胚胎干細胞在眼科的研究進展

1、胚胎干細胞在眼科的研究進展【摘要】胚胎干細胞是一類具有自我更新和高度增殖能力的全能 干細胞。自1998年人類胚胎干細胞在體外成功培養(yǎng)后，國內(nèi)外學(xué)者進 行了大量的研究，越來越多的研究顯示將胚胎干細胞作為細胞供體進 行角膜移植和視網(wǎng)膜移植，可能補充損傷細胞，重建眼表和恢復(fù)視網(wǎng) 膜功能，給一些難治性眼表及視網(wǎng)膜疾病的治療提供了新的途徑。本 文就胚胎干細胞移植在眼科的應(yīng)用前景作一綜述。【關(guān)鍵詞】胚胎于細胞 移植細胞治療0引言1998年，當thomson等1第一次從胚胎中分離培養(yǎng)了人體胚胎 干細胞，并隨后發(fā)現(xiàn)它能分化為體內(nèi)幾乎所有的細胞以后，干細胞成 為人類在21世紀的偉大科技成果之一，人們對干細胞注入

2、了極大的熱 情。干細胞是一類具有自我更新、高度增殖及多向分化潛能的細胞， 主要分為胚胎t細胞和成體干細胞。胚胎t細胞(embryonic stem cells, escs)是來源于人或動物胚胎內(nèi)的細胞團或原始生殖哺的一種 多能細胞,幾乎可以向所有的成年組織分化。多數(shù)致盲性眼病，如嚴重 的眼表疾病、青光眼、視網(wǎng)膜色素變性等，均存在著不可逆的細胞損 傷和變性的病理過程，因此，應(yīng)用escs作為細胞供體進行移植治療, 可能補充損傷細胞，重建眼表和恢復(fù)視網(wǎng)膜功能，為這類疾病的患者 重見光明帶來了希望。本文將對escs在眼科的研究進展及應(yīng)用前景進 行綜述。1胚胎干細胞概述1. 1 escs的豐物學(xué)特性es

3、cs是從哺乳動物早期胚胎內(nèi)細胞團 (inner cell mass , i cm)或原始生殖細胞(primary germ cell , pgc) 經(jīng)體外分離，抑制分化培養(yǎng)獲得的一種二倍體細胞。這類細胞在適宜培 養(yǎng)基中可無限增殖并保持未分化狀態(tài)，具有多向分化潛能，在體內(nèi)體 外都可形成廣泛的細胞類型2,3。它具有以下特性：escs具有分 化的多潛能性在體外可誘導(dǎo)分化出屬于3個胚層的分化細胞；escs 具有種系傳遞的功能；escs具有長期的未分化增殖能力，細胞不僅 能分化成各種器官組織而且能增殖生成新的保持同種性狀的escs； escs易于進行基因改造操作;escs保留了正常二倍體的性質(zhì)冃核型 正

4、常。thomson等建立的五株escs在體外經(jīng)過45mo未分化增殖， 依然保持分化形成滋養(yǎng)層及所有三胚層組織的能力，將escs注射到 scid小鼠，小鼠可形成含有三胚層組織來源的畸胎瘤。大多數(shù)哺乳動 物escs細胞均表達較高的堿性磷酸酶(akp)活性，而且表達高端粒酶 活性，即使培養(yǎng)3,傳代300代仍具有高端粒酶活性4。未分化的 人escs除表達多潛能干細胞典型標記物如0ct4、akp等外，還表達 階段特異性胚胎抗原3、4(ssea-3,ssea-4),高分子量糖蛋白tra-1-60 和tra-1-80、tg30、tg343,而未分化的鼠escs不表達ssea-3或ssea-4,但特異性表達s

5、sea-1,說明人類和鼠的胚胎發(fā)育過程存在著 基本種族差異5。盡管以上細胞標記物沒有一個是完全的特異性 escs標記物，但作為整體出現(xiàn)與escs未分化狀態(tài)卻有密切聯(lián)系2。 escs在體外可以擴增，又能維持不分化狀態(tài)和發(fā)育全能性，可對它進 行遺傳操作，因此，是進行細胞移植治療的良好種子細胞。然而，明 確控制胚胎干細胞向特定細胞分化的基因和環(huán)境信號，以及胚胎干細 胞移植的組織相容性仍是一個難題，還需大量的實驗和理論研究。1.2 escs的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在小鼠的escs研究屮人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了兩 條各自獨立的干細胞分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, lif

6、)通路和0ct4通路。它們在保持細胞多能性 及支持其未分化狀態(tài)的生長有重要作用。研究表明丄if通過與 gpl30-lif 受體結(jié)合來激活轉(zhuǎn)錄因子 stat3 ( signal transducer and activator of transcription 3)從而來支持escs的分裂增殖。但最 近有人報道:活化stat3信號能維持鼠escs的多能性，但if/ stat3 信號通路不能維持人escs的自我更新及多能性6,7。0ct4是一種 p0u-v相關(guān)的dna結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，它與小鼠全能細胞的表型有關(guān)。進一 步的研究證明,0ct4可阻止icm向體細胞分化，是胚胎發(fā)展期保持細胞 處于未分化狀態(tài)

7、的關(guān)鍵因素。另有研究表明，轉(zhuǎn)錄因子nanog在保持 嚙齒類動物的escs處于未分化狀態(tài)中也起一定的作用。nanog的表達 比0ct4稍晚一些，對于保持icm及escs的未分化狀態(tài)有重要意義。2胚胎干細胞在眼科的研究現(xiàn)狀2. 1胚胎干細胞與角膜 嚴重的眼表疾病如stevens-johnson綜 合癥、化學(xué)性燒傷等，可以引起角膜緣上皮細胞缺失，導(dǎo)致球結(jié)膜上 皮化、角膜新生血管形成和結(jié)膜瘢痕，最終導(dǎo)致視力喪失。雖然目前 自體角膜緣干細胞移植8和口唇粘膜9移植可以成功的進行眼表重 建，但一些嚴重的眼表疾病如stevens-johnson綜合癥，通常是雙眼 發(fā)生病變，且口唇粘膜同時受累，因此，將escs

8、誘導(dǎo)形成角膜緣干細 胞，為治療此類疾病提供了新的思路。王智崇等10用表層角膜緣基 質(zhì)接觸誘導(dǎo)escs,在體外分化成為單一形態(tài)的較大細胞，裸鼠皮下移 植后形成細胞復(fù)層，電了顯微鏡發(fā)現(xiàn)細胞核呈扁平狀，細胞表面有微 絨毛結(jié)構(gòu)，符合角膜緣干細胞的部分形態(tài)學(xué)特征，而體外培養(yǎng)條件下, 角膜基質(zhì)剝離面的escs細胞仍保持其小細胞狀態(tài)不變,未經(jīng)表層角膜 緣基質(zhì)誘導(dǎo)的escs細胞裸鼠皮下注射后分化為畸胎瘤樣結(jié)構(gòu)，表明表 層角膜緣基質(zhì)的這種微妙的調(diào)節(jié)微環(huán)境具有誘導(dǎo)escs細胞定向分化 為角膜緣干細胞的潛能。2001年，喻令瓦等將大鼠esc細胞與兔角膜緣 上皮細胞共同培養(yǎng)以誘導(dǎo)其分化,結(jié)果由escs分化岀的細胞具有

9、上皮 細胞表型，并且述表達角膜上皮細胞特異性標志物細胞角蛋白k3/ k12llo最近，homma等12將小鼠escs用iv型膠原接觸誘導(dǎo)后形 成上皮祖細胞，其角膜上皮細胞特異性標記物k12表達陽性，鱗狀上 皮細胞標記物k14表達陰性。然后將誘導(dǎo)后的上皮祖細胞移植到以n 庚醇制備的角膜損傷小鼠模型，移植后24h可見受損角膜重新上皮 化，修復(fù)細胞來源于移植的干細胞。有趣的是部分移植細胞呈現(xiàn)基底 細胞或翼細胞外觀，說明移植細胞同時出現(xiàn)了非角膜上皮細胞的特性。 由此可見，對于雙眼完全性角膜緣干細胞缺乏的病例，escs很有可能 為角膜緣干細胞移植和眼表重建提供充足的細胞來源。2.2胚胎干細胞與晶狀體目前

10、，人工晶狀體植入在口內(nèi)障治療 中得到世界范圍的廣泛應(yīng)用，其手術(shù)方法的安全性是明確的，但是術(shù) 后的調(diào)節(jié)問題一直沒有得到很好的解決。2003年，國外研究者13以 基質(zhì)細胞來源的誘導(dǎo)活性(stromal cell-derived inducing activity, sdta)為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)猴escs分化成晶狀體細胞，20d后細胞聚集成 群，最終形成不同大小的透明體，具有三維結(jié)構(gòu)，免疫組化和western blot檢測顯示q a品狀體蛋白和pax6陽性。一些細胞群內(nèi)可見色素上 皮細胞的存在。同時，晶狀體細胞的數(shù)量隨fgf-2濃度和escs集落密 度的增加而增多。因此，將escs誘導(dǎo)成晶狀體細胞，植入

11、到晶狀體摘 除術(shù)后的囊?guī)?nèi)，是替代人工晶狀體治療白內(nèi)障的一個可能途徑，而 冃可以很好的解決術(shù)后調(diào)節(jié)問題。2. 3胚胎干細胞與視網(wǎng)膜 在眼科領(lǐng)域的研究中，escs移植尚處 于實驗研究階段，其在視網(wǎng)膜變性疾病及視神經(jīng)病變治療屮的應(yīng)用潛 能逐漸成為研究的熱點。escs既可以作為視網(wǎng)膜神經(jīng)元發(fā)育機制研究 的良好模型，也可以為視網(wǎng)膜變性疾病進行細胞移植提供充足的資源。 schraermeyer 等14將 escs 移植至 rcs (royal college of surgeons) 大鼠的視網(wǎng)膜下腔，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未進行escs移植的對照組視網(wǎng)膜外核層 細胞發(fā)生變性而escs移植組外核層仍保留8排左右細胞，

12、說明移植 escs能延緩視網(wǎng)膜感光細胞的變性。zhao等15研究發(fā)現(xiàn)，escs經(jīng)體外誘導(dǎo)后可以分化成表達光感 受器細胞特異性標志的細胞，但不呈現(xiàn)光感受器細胞的形態(tài)，可能與 未同時進行細胞分化和形態(tài)學(xué)分化誘導(dǎo)有關(guān)。hara等16將escs移 植入成年小鼠玻璃體腔內(nèi)，分別在移植后5d和3d進行形態(tài)學(xué)和凋亡 檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在移植后5d, escs呈未分化狀態(tài)，不表達神經(jīng)元標 記物，且人量細胞凋亡。而移植后30d未檢測到凋亡細胞，其中一部 分細胞沿視網(wǎng)膜內(nèi)表面分化呈現(xiàn)神經(jīng)節(jié)細胞形態(tài)，位于神經(jīng)節(jié)細胞層, 并形成神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)，口表達與宿主神經(jīng)節(jié)細胞相似的神經(jīng)元標記物； 而另一部分遠離視網(wǎng)膜表面的細胞則形成

13、了畸胎瘤，說明escs向視網(wǎng) 膜神經(jīng)元分化需要視網(wǎng)膜微環(huán)境的誘導(dǎo)。而meyer等17將小鼠escs 在體外用視黃酸誘導(dǎo)為神經(jīng)祖細胞后，移植至rdl鼠玻璃體腔后進行 觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植細胞大部分分布在視網(wǎng)膜內(nèi)界膜，少數(shù)細胞整合 至視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層和內(nèi)從狀層，移植細胞呈現(xiàn)神經(jīng)元樣表型，且 表達神經(jīng)元和突觸特異性標記物，說明視網(wǎng)膜特異性微環(huán)境對escs 向神經(jīng)元分化也具有誘導(dǎo)作用，且分化后的神經(jīng)元可能與宿主神經(jīng)元 建立了突觸聯(lián)系。但其具體的誘導(dǎo)分化機制，以及是否成功的進行了 功能重建還需進一步研究。最近，ilaruta等18將猴escs誘導(dǎo)分化 成為色素上皮細胞，分化后的細胞在形態(tài)上呈六角形，富含

14、色索，頂 端具有微絨毛，細胞間形成緊密連接，而且具有非特異性吞噬功能。 隨后他們將市這種escs獲得的色素上皮細胞移植入4wk齡的rcs大鼠 視網(wǎng)膜下腔，8wk后分析表明移植細胞具有止常視網(wǎng)膜色素上皮細胞 的形態(tài)，而且對光感受器細胞具有一定的保護作用。研究者同時還對 移植鼠進行了行為學(xué)檢測，結(jié)果顯示移植鼠的視功能得到了很好的保 存。最近，有學(xué)者將escs在體外誘導(dǎo)形成含有色素上皮前體細胞的 eye-like結(jié)構(gòu)，并移植至雞胚的視泡內(nèi)，可見視網(wǎng)膜色素上皮細胞單 層的形成，表明移植結(jié)構(gòu)在體內(nèi)可以定向的分化為成熟的類色素上皮 細胞19 o此外，人escs也可誘導(dǎo)分化成色素上皮細胞，具有正常視 網(wǎng)膜色

15、素上皮細胞的形態(tài)和非特異性吞噬功能，表達色素上皮細胞特 異性標記物，同吋還可轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元細胞，經(jīng)多次傳代后乂可重新 分化為類色素上皮細胞。讓人感興趣的是，這些rtl escs誘導(dǎo)分化來源 的色素上皮細胞與視網(wǎng)膜色素上皮組織在基因表達上具有高度的相似 性，其相似性高于目前已經(jīng)建系的人視網(wǎng)膜色素上皮細胞d407和 arpe-1920。這為研究視網(wǎng)膜色素上皮細胞失代償引起的視網(wǎng)膜變性 的發(fā)病機制、藥物治療的開發(fā)和細胞替代治療提供了無窮資源。3存在問題escs的成瘤性是ii前escs移植面臨的困難之一。arnho 1 d等21 在移植后的長期觀察中，50%的移植眼可以看到畸胎瘤的形成，并侵 犯宿主的

16、視網(wǎng)膜，其至是全眼球受累。這說明escs的無限自我更新和 高分化潛能在移植后有形成腫瘤的危險，這就要求在使用escs進行治 療前,必須先進行體外誘導(dǎo)escs分化產(chǎn)生某種特定的組織細胞或設(shè)計 口殺基因，當移植的細胞向腫瘤發(fā)展時，口殺基因能啟動口毀程序使 其凋亡。而且如何控制escs分裂增殖屮的突變，產(chǎn)生正常的分化細胞 仍需大量實驗研究。此外，escs的倫理學(xué)問題也仍然是目前的爭論焦 點之一。總之，escs的自身應(yīng)用優(yōu)勢雖然為難治性眼科疾病的治療提供 了新的途徑，但也存在著大量有待解決的問題。因此，闡明escs的定 向分化機制、明確向目的細胞分化的誘導(dǎo)條件、基因修飾escs將是未 來escs研究的

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