如何閱讀質(zhì)粒圖譜(更新版本)

1、如何閱讀質(zhì)粒圖譜最近由于實(shí)驗(yàn)需要，需要查閱載體圖譜，到園子里搜羅一番，發(fā)現(xiàn)雖然有人問載體圖譜閱讀的 問題,也有前輩回答，但都不詳細(xì)，借自己也在琢磨這個(gè)問題的機(jī)會，將我學(xué)到的東西整理一下 ，于大家分享。載體主要有 病毒和非病毒兩大類,其中質(zhì)粒DNA是一種新的非病毒轉(zhuǎn)基因載體。一個(gè)合格質(zhì)粒的組成要素#復(fù)制起始位點(diǎn) Oril即控制復(fù)制起始的位點(diǎn)。原核生物DNA分子中只有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)。而真核生物DNA分子有多個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)。#抗生素抗性基因 可以便于加以檢測，如 Amp+l ,Kan+#多克隆位點(diǎn)MCS克隆攜帶外源基因片段l# P/E啟動子/增強(qiáng)子l# Termsl 終止信號#加poly (A)信號

2、l可以起到穩(wěn)定 mRNA 作用二、如何閱讀質(zhì)粒圖譜第一步：首先看Ori的位置，了解質(zhì)粒的類型(原核/真核/穿梭質(zhì)粒)第二步：再看篩選標(biāo)記，如抗性，決定使用什么篩選標(biāo)記。(1 ) Ampr水解B 內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。(2 ) tetr可以阻止 四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。(3 ) camr生成氯霉素羥乙?；苌?，使之失去毒性。(4 ) neor ( kanr )氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶 使G418 (卡那霉素衍生物)失活(5 ) hygr使潮霉素B失活。第三步：看多克隆位點(diǎn)(MCS )。它具有多個(gè)限制酶的單一切點(diǎn)。便于外源基因的插入。如果 在這些位點(diǎn)外有外源基因的插入，會導(dǎo)致某種標(biāo)志基因的失活，而便于篩

3、選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。第四步：再看外源DNA插入片段大小。質(zhì)粒一般只能容納小于 10Kb 的外源DNA片段。一 般來說，外源 DNA片段越長，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。第五步：是否含有 表達(dá)系統(tǒng)元件，即啟動子-核糖體結(jié)合位點(diǎn)-克隆位點(diǎn)-轉(zhuǎn)錄終止信號。這是用來區(qū)別克隆載體與表達(dá)載體?？寺≥d體中加入一些與表達(dá)調(diào)控有關(guān)的元件即成為表達(dá)載體。選用那種載體，還是要以實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑闇?zhǔn)繩。啟動子-核糖體結(jié)合位點(diǎn)-克隆位點(diǎn)-轉(zhuǎn)錄終止信號#啟動子-促進(jìn) DNA轉(zhuǎn)錄的DNA順序，這個(gè) DNA區(qū)域常在基因或操縱子編碼順序的上游， 是DNA分子上可以與 RNApol特異性結(jié)合并使之開始轉(zhuǎn)錄

4、的部位，但啟動子本身不被轉(zhuǎn)錄。#增強(qiáng)子/沉默子為真核基因組(包括真核病毒基因組)中的一種具有增強(qiáng)鄰近基因轉(zhuǎn)錄過程 的調(diào)控順序。其作用與增強(qiáng)子所在的位置或方向無關(guān)。即在所調(diào)控基因上游或下游均可發(fā)揮作用。/沉默子一負(fù)增強(qiáng)子，負(fù)調(diào)控序列。#核糖體結(jié)合位點(diǎn)/起始密碼/SD序列(Rbs/AGU/SDs )： mRNA有核糖體的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)， 對于原核而言是 AUG (起始密碼)和 SD序列。l#轉(zhuǎn)錄終止順序(終止子)/翻譯終止密碼子：結(jié)構(gòu)基因的最后一個(gè)外顯子中有一個(gè) AATAAA的 保守序列，此位點(diǎn) down stream 有一段GT或T富豐區(qū)，這2部分共同構(gòu)成poly (A)加尾 信號。回答有人之前提

5、出的一個(gè)問題： 為什么質(zhì)粒圖譜上有的箭頭順時(shí)針有的箭頭逆時(shí)針？ 那其實(shí)是代表兩條 DNA 鏈，即質(zhì)粒是環(huán)狀雙鏈 DNA ，它的啟動子等在其中一條鏈上，而它 的抗性基因在另一條鏈上 .三、介紹一下關(guān)于載體的知識（雖然課本上都有寫）1. 什么是載體即要把一個(gè)有用的基因 （目的基因 研究或應(yīng)用基因） 通過基因工程手段送到生物細(xì)胞 （受體 細(xì)胞），需要運(yùn)載工具（交通工具）攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞，這種運(yùn)載工具就叫做載體（ vector ）。P.S. 基因工程所用的 vector 實(shí)際上是 DNA 分子，是用來攜帶目的基因片段進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA2. 載體的分類按功能分成：（1 ）克隆載體都有一個(gè)松弛的

6、 復(fù)制子 ，能帶動外源基因，在宿主細(xì)胞中復(fù)制擴(kuò)增。它是用來克 隆和擴(kuò)增 DNA 片段（基因）的載體。（所以有時(shí)實(shí)驗(yàn)時(shí)擴(kuò)增效率低下，要注意是不是使用的嚴(yán) 謹(jǐn)型載體）（2 ）表達(dá)載體具有克隆載體的基本元件（ori,Ampr,Mcs 等）還具有轉(zhuǎn)錄 / 翻譯所必需的 DNA順序的載體。按進(jìn)入受體細(xì)胞類型分：（ 1）原核載體 （2 ）真核載體（ 3）穿梭載體（ sbuttle vector ） 指在兩種宿主生物體內(nèi)復(fù)制的載體分子，因而可以運(yùn)載目的基因（穿梭往返兩種生物之間） . P.S. 穿梭質(zhì)粒含原核和真核生物 2 個(gè)復(fù)制子，以確保兩類細(xì)胞中都能擴(kuò)增。3. 基因工程載體的 3 個(gè)特點(diǎn)：（一）都能獨(dú)立

7、自主的復(fù)制：載體 DNA 分子中有一段不影響它們擴(kuò)增的非必需區(qū)域，如 MCS ， 插在其中的外源 DNA 片段，能被動的跟著載體一起復(fù)制 / 擴(kuò)增，就像載體的正常成分一樣。（二）都能便利的加以檢測：如載體的藥物抗性基因，多是抗生素抗性基因， 將受體細(xì)胞放在含 有該抗生素培養(yǎng)板上培養(yǎng)生長時(shí)，只有攜帶這些抗性基因的載體分子的受體細(xì)胞才能存活。（三）都能容易進(jìn)入宿主細(xì)胞中去，也易從宿主細(xì)胞中分離純化出來。4. 載體的選擇和制備：選擇載體主要 依據(jù)構(gòu)建的目的 ，同時(shí)要考慮載體中 應(yīng)有合適的限制酶切 位點(diǎn) 。如果構(gòu)建的目的是要表達(dá)一個(gè)特定的基因，則要選擇合適的表達(dá)載體。載體選擇主要考慮下述 3 點(diǎn)：【1

8、】構(gòu)建 DNA 重組體的目的，克隆擴(kuò)增 / 表達(dá)，選擇合適的克隆載體 /表達(dá)載體?！? 】.載體的類型：（ 1 ）克隆載體的克隆能力據(jù)克隆片段大?。ù筮x大，小選?。Ｈ?lt;10kb 選質(zhì)粒。（ 2 ）表達(dá)載體據(jù)受體細(xì)胞類型原核/真核/穿梭， E.coli/ 哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體。（ 3 ）對原核表達(dá)載體應(yīng)該注意 3 點(diǎn)： 選擇合適的啟動子及相應(yīng)的受體菌；用于表達(dá)真核蛋白質(zhì)時(shí)注意克服 4 個(gè)困難和閱讀框錯(cuò)位； 表達(dá)天然蛋白質(zhì)或融合蛋白作為相應(yīng)載體的參考?！? 】載體 MCS 中的酶切位點(diǎn)數(shù)與組成方向因載體不同而異，適應(yīng)目的基因與載體易于鏈接， 不產(chǎn)生閱讀框架錯(cuò)位。選用質(zhì)粒(最常用)做載體的4點(diǎn)

9、要求： 選分子量小的質(zhì)粒，即小載體(1 - 1.5kb )-不易損壞，在細(xì)菌里面拷貝數(shù)也多(也有大載體)； 一般使用松弛型質(zhì)粒在細(xì)菌里擴(kuò)增不受約束，一般10個(gè)以上的拷貝，而嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒<10個(gè)。 必需具備一個(gè)以上的酶切位點(diǎn)，有選擇的余地； 必需有易檢測的標(biāo)記，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr (試一試)。無論選用哪種載體，首先都要獲得載體分子，然后采用適當(dāng)?shù)南拗泼笇⑤d體DNA進(jìn)行切割，獲得分子，以便于與目的基因片段進(jìn)行連接。質(zhì)粒載體質(zhì)粒(plasmid )是細(xì)菌或細(xì)胞染色質(zhì)以外的，能自主復(fù)制的，與細(xì)菌或細(xì)胞共生的遺傳成分。其特點(diǎn)如下： 是染色質(zhì)外的雙鏈共價(jià)閉合環(huán)形 DNA (cov

10、alently closed circuar DNA,cccDNA)，可自然形成超螺旋結(jié)構(gòu)，不同質(zhì)粒大小在2-300kb 之間，v 15kb的小質(zhì)粒比較容易分離純化，15kb的大質(zhì)粒則不易提取。 能自主復(fù)制，是能獨(dú)立復(fù)制的復(fù)制子(autonomous replicon)。一般質(zhì)粒 DNA復(fù)制的質(zhì)?？呻S宿主細(xì)胞分裂而傳給后代。按質(zhì)粒復(fù)制的調(diào)控及其拷貝數(shù)可分兩類：嚴(yán)緊控制(stri nge ntcon trol )型質(zhì)粒的復(fù)制常與宿主的繁殖偶聯(lián)，拷貝數(shù)較少，每個(gè)細(xì)胞中只有1個(gè)到十幾個(gè)拷貝；另一類是松弛控制( relaxedcontrol )型質(zhì)粒，其復(fù)制宿主不偶聯(lián)，每個(gè)細(xì)胞中有幾十到幾百個(gè)拷貝。每

11、個(gè)質(zhì)粒DNA上都有復(fù)制的起點(diǎn)，只有ori能被宿主細(xì)胞復(fù)制蛋白質(zhì)識別的質(zhì)粒才能在該種細(xì)胞中復(fù)制，不同質(zhì)粒復(fù)制控制狀況主要與復(fù)制起點(diǎn)的序列結(jié)構(gòu)相關(guān)。有的質(zhì)粒的可以整合到宿主細(xì)胞染色質(zhì)DNA中,隨宿主DNA復(fù)制，稱為附加體，例如細(xì)菌的性質(zhì)粒就是一種附加體，它可以質(zhì)粒形式存在，也 能整合入細(xì)菌的 DNA，又能從細(xì)菌染色質(zhì) DNA上切下來。F因子攜帶基因編碼的蛋白質(zhì)能使兩 個(gè)細(xì)菌間形成纖毛狀細(xì)管連接的接合(conjugation )，通過這細(xì)管遺傳物質(zhì)可在兩個(gè)細(xì)菌間傳遞。 質(zhì)粒對宿主生存并不是必需的。這點(diǎn)不同于線粒體，線粒體DNA也是環(huán)狀雙鏈分子，也有獨(dú)立復(fù)制的調(diào)控，但線粒體的功能是細(xì)胞生存所必需的。線

12、粒體是細(xì)胞的一部分，質(zhì)粒也往 往有其表型，其表現(xiàn)不是宿主生存所必需的，但也不妨礙宿主的生存。某些質(zhì)粒攜帶的基因 功能有利于宿主細(xì)胞的特定條件下生存，例如，細(xì)菌中許多天然的質(zhì)粒帶有抗藥性基因，女口 編碼合成能分解破壞四環(huán)素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，這種質(zhì)粒稱為抗藥性質(zhì)粒， 又稱R質(zhì)粒，帶有 R質(zhì)粒的細(xì)菌就能在相應(yīng)的抗生素存在生存繁殖。所以質(zhì)粒對宿主不是 寄生的，而是共生的。答學(xué)生問：克隆載體與表達(dá)載體FROM紅泥小火爐問題：基因工程中有克隆載體和表達(dá)載體， 克隆載體可以在受體菌中大量復(fù)制， 表達(dá)載體用于 表達(dá)目的蛋白， 那么實(shí)際應(yīng)用中， 我們的最終目的是要得到目的蛋白， 克隆載體不能完成表

13、 達(dá)，有何用呢？還是說利用克隆載體實(shí)現(xiàn)目的基因的大量復(fù)制后， 再將其轉(zhuǎn)移到表達(dá)載體中 實(shí)現(xiàn)表達(dá)？它是否有何缺陷不能整合克隆載體的功能？構(gòu)建兼有克隆和表達(dá)雙重功能的載 體有何困難？ 回答：1. 克隆的目的比較單一，就是將你感興趣的 DNA 片段，重組進(jìn)入載體，然后于宿主細(xì)胞中 大量繁殖， 主要用于各種文庫的建立， 比如人類基因組計(jì)劃； 同時(shí)由于載體所能容納的目的 片段的長度是有限的， 而克隆載體沒有表達(dá)所需的各種片段， 所以可以容納更長的目的片段， 即可以克隆足夠長的基因，效率更高。2. 重組 DNA 需要使用限制性內(nèi)切酶，因此待克隆的目的片段兩端必需有其識別位點(diǎn)，現(xiàn)在 的 T/A 克隆載體可以

14、直接克隆 PCR 產(chǎn)物，省去了兩端加裝識別位點(diǎn)的設(shè)計(jì)， PCR 效率就更3. 表達(dá)載體的目的是多樣化的，為了實(shí)現(xiàn)實(shí)際工作中的需要，不同的目的就要設(shè)計(jì)不同的載 體，用表達(dá)載體克隆基因不是不可以，實(shí)際工作中要考慮更多，因此更復(fù)雜。4. 細(xì)菌攝取能量的能力是一定的，如果用來合成大量蛋白質(zhì)，合成核酸就會少。5. 細(xì)菌承受的工作負(fù)荷也是有限的，給它的工作太多，效率必然低下，這和我們?nèi)粘Ｉ钍?一個(gè)道理。原因很簡單，不是不能，是完全可以，但是效率會低很多。所以我們一般的策略是，將目的 片段克隆于非常簡單的克隆載體上，按照需要再亞克隆于可以滿足各種要求的表達(dá)載體上。 回答的不是很系統(tǒng)，如有問題可以繼續(xù)來信討

15、論，希望對你有所幫助。新浪網(wǎng)友 2009-10-10 08:48:28 舉報(bào) 您好！您博文里得 “T/A 克隆載體可以直接克隆 PCR 產(chǎn)物，省去了兩端加裝識別位點(diǎn)的設(shè)計(jì)， PCR 效率就更高。 ”是什么意思？我是初學(xué)者，請求賜教。博主回復(fù)： 2009-10-16 09:51:51T/A克隆載體是PUC載體的線性化后兩端加了 T,而Taq酶有在PCR產(chǎn)物后隨機(jī)加 A的特 性，所以PCR產(chǎn)物直接可以接入 T載體。而經(jīng)典的克隆PCR產(chǎn)物需要限制性內(nèi)切酶切割后 接入載體，所以在設(shè)計(jì) PCR 引物時(shí)兩端要加酶的識別位點(diǎn)，而加裝的序列與模板不配對， 因此 PCR 效率會低很多。新浪網(wǎng)友 2010-01-08 13:00:09 舉報(bào) 老師，您好！ 您的意思是說克隆載體只是為了得到大量的目的基因，而現(xiàn)在多用 PCR 就可以達(dá)到這個(gè)目 的。那這個(gè)目的基因的主要用途是什么？只用來測序嗎？ 表達(dá)載體應(yīng)該兼有克隆與表達(dá)的功能的吧？盼望您的回復(fù)！謝謝博主回復(fù)： 2010-03