藍(lán)白斑篩選法

1、實(shí)驗(yàn)十五 重組子的篩選技術(shù) 藍(lán)白斑篩選法【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?學(xué)習(xí)藍(lán)白斑法篩選重組菌落的原理及具體的實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程?！緦?shí)驗(yàn)材料】 移液器及吸咀 培養(yǎng)皿 接種環(huán) 1.5mL離心管 恒溫培養(yǎng)箱水浴鍋LB液體培養(yǎng)基 蛋白胨 8g 氯化鈉 7g 酵母 5g 定容至1000mL，用NaOH調(diào)pH至7.57.6，可置-20保存，高壓滅菌LB固體培養(yǎng)基 液體培養(yǎng)基中加入1.5%的瓊脂，15磅30分鐘高壓滅菌后使用X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖) X-gal溶于N, N-二甲基甲酰胺中配20mg/mL原夜，-20避光保存IPTG(異丙基-D-半乳糖苷) 0.2g/mL分裝，貯存于-20氨芐青霉素(Am

2、picillin) 1g Ampicillin溶于5mL滅菌水中，配成母液，保存于-20轉(zhuǎn)化菌【實(shí)驗(yàn)原理】 -半乳糖苷酶是一種把乳糖分解成葡萄糖和半乳糖的酶，最常用的-半乳糖苷酶基因來(lái)自大腸桿菌lac操縱子，它們使載體中帶有大腸桿菌lac操縱子的調(diào)節(jié)序列和編碼-半乳糖苷酶N末端146個(gè)氨基酸的序列。用異丙基-D-半乳糖苷(IPTG)可誘導(dǎo)這個(gè)末端片段的合成，合成的片段能與宿主編碼的-半乳糖苷酶缺陷型進(jìn)行互補(bǔ)，恢復(fù)該酶的活性，這一過(guò)程稱(chēng)為-互補(bǔ)。 由于克隆用載體pGEM-T Easy Vector帶有l(wèi)acZ的調(diào)節(jié)序列和-半乳糖苷酶的部分編碼序列，可以與缺陷型宿主DH 5在誘導(dǎo)物IPTG存在下，

3、形成-互補(bǔ)，宿主菌在含色素底物X-gal的培養(yǎng)基平板上形成藍(lán)斑；在有外源DNA片段插入到載體多克隆位點(diǎn)時(shí)，就使載體編碼-半乳糖苷酶的部分序列失活，帶有重組質(zhì)粒的宿主菌產(chǎn)生白斑。為提高篩選的準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)中采取藍(lán)白斑篩選法?！緦?shí)驗(yàn)原理】 IPTG可誘導(dǎo)缺陷型大腸桿菌DH 5表達(dá)出半乳糖苷酶，該酶可分解添加于培養(yǎng)基中無(wú)色的X-gal成半乳糖和深藍(lán)色的底物5-溴-4-氯-靛藍(lán)，使菌落呈現(xiàn)出藍(lán)色反應(yīng)；在T質(zhì)粒載體lacZ序列中，含有一系列不同限制酶的單一識(shí)別位點(diǎn)，其中任何一個(gè)位點(diǎn)插入了外源克隆DNA片段，都會(huì)阻斷半乳糖苷酶的讀碼結(jié)構(gòu)，使其編碼的肽失去活性，結(jié)果產(chǎn)生出白色的菌落。因此，根據(jù)這種半乳糖苷酶的顯色反應(yīng)，便可檢測(cè)出含有外源DNA插入序列的重組克隆?！緦?shí)驗(yàn)步驟】1、平板的準(zhǔn)備 在40uL X-gal中加入4uL IPTG，充分混合，在無(wú)菌條件下涂布于含Amp(濃度為50ug/mL)的LB平板上，將平板置于37恒溫箱中23hr，以使培養(yǎng)基充分吸收色素底物X-gal；2、涂板 將轉(zhuǎn)化菌在無(wú)菌條件下涂布于含抗生素和X-gal、IPTG的平板上，正面朝上放置30分鐘，待菌液完全被吸收后倒置平板，37培養(yǎng)1218hr；3、觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果藍(lán)白斑篩選重組菌落藍(lán)