酶分子化學(xué)修飾

1、第五章第五章 酶分子的化學(xué)修飾酶分子的化學(xué)修飾 酶的活性中心酶的活性中心 酶化學(xué)修飾的目的酶化學(xué)修飾的目的 酶化學(xué)修飾的原理酶化學(xué)修飾的原理 酶化學(xué)修飾的設(shè)計(jì)酶化學(xué)修飾的設(shè)計(jì) 酶化學(xué)修飾的應(yīng)用酶化學(xué)修飾的應(yīng)用第一節(jié)第一節(jié) 酶的活性中心（酶的活性中心（active siteactive site） 一、活性中心的概念一、活性中心的概念 酶酶分分子子非必需基團(tuán)非必需基團(tuán)必需基團(tuán)必需基團(tuán)活性中心活性中心必需基團(tuán)必需基團(tuán)活性中心外活性中心外必需基團(tuán)必需基團(tuán)結(jié)合基團(tuán)結(jié)合基團(tuán)催化基團(tuán)催化基團(tuán)非活性中非活性中心心活活性性中中心心活性中心的重要化學(xué)基團(tuán)活性中心的重要化學(xué)基團(tuán) 7 7種氨基酸出現(xiàn)的頻率最高種氨基

2、酸出現(xiàn)的頻率最高 lys asp glu cys his tyr lys asp glu cys his tyr serser （蘭天果拌豬肉絲）（蘭天果拌豬肉絲） 某些功能基團(tuán)某些功能基團(tuán), ,如（氨基、羧基、巰基、羥基如（氨基、羧基、巰基、羥基 和咪唑基）是酶的必需基團(tuán)。和咪唑基）是酶的必需基團(tuán)。 賴氨酸的氨基賴氨酸的氨基 天冬氨酸和谷氨酸的羧基天冬氨酸和谷氨酸的羧基 半胱氨酸的巰基半胱氨酸的巰基 組氨酸的咪唑基組氨酸的咪唑基 酪氨酸和絲氨酸的羥基酪氨酸和絲氨酸的羥基h2nchcch2ohoohohh2nchcch2ohoshshh2nchcch2ohonnhnnhh2nchcch2oho

3、ch2cohoh2nchcch2ohocohocoohh2nchcch2ohoch2ch2ch2nh2nh2h2nchcch2ohoohoh 與底物相與底物相結(jié)合，使底結(jié)合，使底物與酶的一物與酶的一定構(gòu)象形成定構(gòu)象形成復(fù)合物復(fù)合物 影響底物中某些影響底物中某些化學(xué)鍵的穩(wěn)定，化學(xué)鍵的穩(wěn)定，催化底物發(fā)生化催化底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)并將其轉(zhuǎn)學(xué)反應(yīng)并將其轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物化成產(chǎn)物 維持酶活性中心應(yīng)有空間構(gòu)象所必需的基團(tuán) 二、活性中心的共性二、活性中心的共性(1)(1)活性部位只占酶分子很小的一部分（活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%1-2%）。）。(2)(2)活性部位是一個(gè)三維實(shí)體?；钚圆课皇且粋€(gè)三維實(shí)體。(

4、3)(3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂縫中?；钚灾行奈挥诿阜肿颖砻娴氖杷粤芽p中。 (4)(4)活性中心構(gòu)象不是固定不變的（誘導(dǎo)契合）。活性中心構(gòu)象不是固定不變的（誘導(dǎo)契合）。(5)(5)酶與底物通過鹽鍵、氫鍵、范德華力和疏水酶與底物通過鹽鍵、氫鍵、范德華力和疏水作用等次級(jí)鍵結(jié)合。作用等次級(jí)鍵結(jié)合。active sitethe active site is the region of the enzyme that binds the substrate, to form an enzyme-substrate complex, and transforms it into product

5、. the active site is a three-dimensional entity, often a cleft or crevice on the surface of the protein, in which the substrate is bound by multiple weak interactions.三、研究酶活性中心的方法三、研究酶活性中心的方法 1.1.物理學(xué)方法：物理學(xué)方法： 用用x x射線衍射法直接檢測(cè)底物或其射線衍射法直接檢測(cè)底物或其類似物與酶形成的中間復(fù)合物（包括酶類似物與酶形成的中間復(fù)合物（包括酶和底物）的相對(duì)位置。和底物）的相對(duì)位置。2.2.化學(xué)

6、修飾法：化學(xué)修飾法：根據(jù)所用修飾試劑不同，分為根據(jù)所用修飾試劑不同，分為 1)1)非專一性化學(xué)修飾非專一性化學(xué)修飾 用非專一性的修飾試劑與氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)作用用非專一性的修飾試劑與氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)作用。若某基團(tuán)被修飾后：若某基團(tuán)被修飾后： 酶活性不變酶活性不變?cè)摶鶊F(tuán)可能不是酶的必需基團(tuán)該基團(tuán)可能不是酶的必需基團(tuán)酶活性降低或喪失酶活性降低或喪失該基團(tuán)可能是酶的必需基團(tuán)該基團(tuán)可能是酶的必需基團(tuán)但不能確定化學(xué)試劑是同活性中心內(nèi)的必需基團(tuán)結(jié)合。但不能確定化學(xué)試劑是同活性中心內(nèi)的必需基團(tuán)結(jié)合?；钚灾行幕鶊F(tuán)的鑒定標(biāo)準(zhǔn)活性中心基團(tuán)的鑒定標(biāo)準(zhǔn)失活程度與修飾劑濃度成一定比例關(guān)系。失活程度與修飾劑濃度成一定比例關(guān)系。

7、s s或可逆抑制劑有保護(hù)作用（活性中心）?；蚩赡嬉种苿┯斜Ｗo(hù)作用（活性中心）。先加先加s s或競(jìng)或競(jìng) 加共價(jià)修飾劑加共價(jià)修飾劑 透析透析除去除去s s或競(jìng)或競(jìng) 活性不喪失活性不喪失 差別標(biāo)記：差別標(biāo)記：底物或抑制劑存在底物或抑制劑存在 活性基團(tuán)不與修飾劑作用活性基團(tuán)不與修飾劑作用去除底物或抑制劑去除底物或抑制劑 原來被保護(hù)的基團(tuán)帶同位素標(biāo)記原來被保護(hù)的基團(tuán)帶同位素標(biāo)記 可直接得到蛋白質(zhì)發(fā)揮功能作用的必需基團(tuán)?？芍苯拥玫降鞍踪|(zhì)發(fā)揮功能作用的必需基團(tuán)?；瘜W(xué)修飾化學(xué)修飾含同位素標(biāo)記含同位素標(biāo)記 的同樣試劑的同樣試劑2)2)專一性化學(xué)修飾（基團(tuán)專一性修飾）專一性化學(xué)修飾（基團(tuán)專一性修飾） 用專一性化學(xué)

8、修飾劑修飾酶活性中心的某一用專一性化學(xué)修飾劑修飾酶活性中心的某一氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)。氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)。3)3)親和標(biāo)記（位點(diǎn)專一性修飾）親和標(biāo)記（位點(diǎn)專一性修飾） 采用的修飾試劑是根據(jù)底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)采用的修飾試劑是根據(jù)底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)合成的含有活潑反應(yīng)基團(tuán)的底物類似物。合成的含有活潑反應(yīng)基團(tuán)的底物類似物。作用機(jī)制：作用機(jī)制：利用酶對(duì)底物的特殊親和力將酶加以利用酶對(duì)底物的特殊親和力將酶加以修飾標(biāo)記。修飾標(biāo)記。化學(xué)修飾的專一性化學(xué)修飾的專一性yyyx-yyyx親和修飾劑：親和修飾劑： 與與s s結(jié)構(gòu)相似結(jié)構(gòu)相似，與活性中心的氨基酸殘基，與活性中心的氨基酸殘基 親和力大，而與活性中心以外

9、的氨基酸親和力大，而與活性中心以外的氨基酸 殘基親和力小。殘基親和力小。具有活潑的化學(xué)基團(tuán)具有活潑的化學(xué)基團(tuán)（如鹵素）可與活性（如鹵素）可與活性 中心的基團(tuán)形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵。中心的基團(tuán)形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵。3.3.蛋白質(zhì)工程：蛋白質(zhì)工程： 將酶相應(yīng)的將酶相應(yīng)的cdnacdna定點(diǎn)突變，突變定點(diǎn)突變，突變的的cdnacdna只表達(dá)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸被置只表達(dá)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸被置換的酶蛋白，測(cè)定其活性可知被置換換的酶蛋白，測(cè)定其活性可知被置換的氨基酸是否為活力所必需。的氨基酸是否為活力所必需。 第二節(jié)第二節(jié) 酶化學(xué)修飾及修飾目的酶化學(xué)修飾及修飾目的 一、酶化學(xué)修飾一、酶化學(xué)修飾 1.1.限制酶大規(guī)模應(yīng)用

10、的原因：限制酶大規(guī)模應(yīng)用的原因：1)1)細(xì)胞外穩(wěn)定性差；細(xì)胞外穩(wěn)定性差；2)2)酶活性不夠高；酶活性不夠高；3)3)具有抗原性。具有抗原性。 2. 2. 改變酶特性有兩種主要的方法改變酶特性有兩種主要的方法： 1)1)通過分子修飾的方法來改變已分離出通過分子修飾的方法來改變已分離出來的天然酶的活性。來的天然酶的活性。 2)2)通過基因工程方法改變編碼酶分子的通過基因工程方法改變編碼酶分子的基因而達(dá)到改造酶的目的?；蚨_(dá)到改造酶的目的。3. 3. 酶化學(xué)修飾的概念酶化學(xué)修飾的概念酶的化學(xué)修飾（酶的化學(xué)修飾（chemical modificationchemical modification）：

11、）： 通過化學(xué)基團(tuán)的引入或除去，使蛋白質(zhì)共價(jià)通過化學(xué)基團(tuán)的引入或除去，使蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。酶選擇性化學(xué)修飾：酶選擇性化學(xué)修飾： 描述肽鏈側(cè)鏈基團(tuán)被化學(xué)試劑專一性地修飾。描述肽鏈側(cè)鏈基團(tuán)被化學(xué)試劑專一性地修飾。二、酶化學(xué)修飾的目的二、酶化學(xué)修飾的目的1. 1. 研究酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。研究酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。（5050年代末）年代末）2. 2. 人為改變天然酶的某些性質(zhì)，擴(kuò)大酶的應(yīng)用人為改變天然酶的某些性質(zhì)，擴(kuò)大酶的應(yīng)用 范圍。范圍。（7070年代末之后）年代末之后）1 1）提高酶的生物活性（酶活力）。）提高酶的生物活性（酶活力）。2 2）增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性（熱穩(wěn)定性、體內(nèi)半

12、衰期）。）增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性（熱穩(wěn)定性、體內(nèi)半衰期）。3 3）消除抗原性（針對(duì)特異性反應(yīng)降低生物識(shí)別能力）。）消除抗原性（針對(duì)特異性反應(yīng)降低生物識(shí)別能力）。4 4）產(chǎn)生新的催化能力。）產(chǎn)生新的催化能力。 第三節(jié)第三節(jié) 酶化學(xué)修飾的原理酶化學(xué)修飾的原理一、如何增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性一、如何增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性 修飾劑分子存在多個(gè)反應(yīng)基團(tuán)，可與酶修飾劑分子存在多個(gè)反應(yīng)基團(tuán)，可與酶形成多點(diǎn)交聯(lián)。使酶的天然構(gòu)象產(chǎn)生形成多點(diǎn)交聯(lián)。使酶的天然構(gòu)象產(chǎn)生“剛性剛性”結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)。二、如何保護(hù)酶活性部位與抗抑制劑二、如何保護(hù)酶活性部位與抗抑制劑 大分子修飾劑與酶結(jié)合后，產(chǎn)生的空間大分子修飾劑與酶結(jié)合

13、后，產(chǎn)生的空間障礙或靜電斥力阻擋抑制劑，障礙或靜電斥力阻擋抑制劑，“遮蓋遮蓋”了酶了酶的活性部位的活性部位。三、如何維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶三、如何維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶 酶化學(xué)修飾后通過兩種途徑抗蛋白水解酶：酶化學(xué)修飾后通過兩種途徑抗蛋白水解酶：1. 1. 大分子修飾劑產(chǎn)生空間障礙阻擋蛋白水解酶接大分子修飾劑產(chǎn)生空間障礙阻擋蛋白水解酶接近酶分子。近酶分子。“遮蓋遮蓋”酶分子上敏感鍵免遭破壞。酶分子上敏感鍵免遭破壞。2. 2. 酶分子上許多敏感基團(tuán)交聯(lián)上修飾劑后，減少酶分子上許多敏感基團(tuán)交聯(lián)上修飾劑后，減少了受蛋白水解酶破壞的可能性。了受蛋白水解酶破壞的可能性。四、如

14、何消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境四、如何消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境1. 1. 酶蛋白氨基酸組成的抗原決定簇，與修飾劑形成酶蛋白氨基酸組成的抗原決定簇，與修飾劑形成了共價(jià)鍵。了共價(jià)鍵。 破壞了抗原決定簇破壞了抗原決定簇抗原性降低乃至消除抗原性降低乃至消除 “ “遮蓋遮蓋”了抗原決定簇了抗原決定簇阻礙抗原、抗體結(jié)合阻礙抗原、抗體結(jié)合2. 2. 大分子修飾劑本身是多聚電荷體，能在酶分子表大分子修飾劑本身是多聚電荷體，能在酶分子表面形成面形成“緩沖外殼緩沖外殼”，抵御外界環(huán)境的極性變化，抵御外界環(huán)境的極性變化，維持酶活性部位微環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定。維持酶活性部位微環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定。 第四節(jié)第四節(jié) 酶化學(xué)修飾的

15、設(shè)計(jì)酶化學(xué)修飾的設(shè)計(jì) 一、充分認(rèn)識(shí)酶分子的特性一、充分認(rèn)識(shí)酶分子的特性 包括酶的包括酶的 1. 1. 活性部位情況活性部位情況 2. 2. 穩(wěn)定條件及反應(yīng)最佳條件穩(wěn)定條件及反應(yīng)最佳條件 3. 3. 側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)及反應(yīng)活潑性側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)及反應(yīng)活潑性二、二、 修飾劑的選擇修飾劑的選擇 要考慮要考慮 1.1.修飾劑的分子量及鏈的長(zhǎng)度（要求有較大修飾劑的分子量及鏈的長(zhǎng)度（要求有較大的分子量）的分子量） 2.2.修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的數(shù)目及位置（要求有修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的數(shù)目及位置（要求有較多的反應(yīng)活性基團(tuán)）較多的反應(yīng)活性基團(tuán)） 3.3.修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的活化方法與條件修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的活化方法與

16、條件三、反應(yīng)條件的選擇三、反應(yīng)條件的選擇 要注意要注意 1. 1. 酶與修飾劑的分子比例酶與修飾劑的分子比例 2. 2. 反應(yīng)體系的溶劑性質(zhì)、鹽濃度、反應(yīng)體系的溶劑性質(zhì)、鹽濃度、phph條件條件 3. 3. 反應(yīng)溫度及時(shí)間反應(yīng)溫度及時(shí)間第五節(jié)第五節(jié) 酶化學(xué)修飾的種類及應(yīng)用酶化學(xué)修飾的種類及應(yīng)用 一、酶的表面化學(xué)修飾一、酶的表面化學(xué)修飾 （一）大分子修飾（大分子結(jié)合修飾）（一）大分子修飾（大分子結(jié)合修飾） 是目前應(yīng)用最廣的酶分子修飾方法。是目前應(yīng)用最廣的酶分子修飾方法。 1.1.定義：定義：利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而改變的空間結(jié)

17、構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而改變酶的特性與功能的方法。酶的特性與功能的方法。2. 2. 修飾劑：修飾劑： 聚乙二醇（聚乙二醇（pegpeg）、右旋糖酐（）、右旋糖酐（dextrandextran）、）、肝素（肝素（heparinheparin）、蔗糖聚合物（）、蔗糖聚合物（ficollficoll）等。）等。 修飾方法：修飾前活化，然后在一定條件下修飾方法：修飾前活化，然后在一定條件下與酶分子共價(jià)結(jié)合。與酶分子共價(jià)結(jié)合。3. 3. 應(yīng)用：應(yīng)用：如：如：pegpeg超氧化物歧化酶（超氧化物歧化酶（sodsod） pegpeg溶血類蛋白質(zhì)（鏈激酶、尿激酶等）溶血類蛋白質(zhì)（鏈激酶、尿激酶等） pegp

18、eg天門冬酰胺酶（天門冬酰胺酶（asnaseasnase） 消除了抗原性消除了抗原性 延長(zhǎng)了酶在體內(nèi)的半衰期延長(zhǎng)了酶在體內(nèi)的半衰期又如：用又如：用dextrandextran修飾修飾 - -淀粉酶，淀粉酶， 淀粉酶，胰淀粉酶，胰蛋白酶、過氧化氫酶，蛋白酶、過氧化氫酶，提高了酶的熱穩(wěn)定性。提高了酶的熱穩(wěn)定性。（二）小分子修飾（二）小分子修飾 （酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾）（酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾）定義：定義：通過選擇性的試劑或親和標(biāo)記試劑與酶分通過選擇性的試劑或親和標(biāo)記試劑與酶分子側(cè)鏈上特定的功能基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。子側(cè)鏈上特定的功能基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。側(cè)鏈基團(tuán)：側(cè)鏈基團(tuán)：組成蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的功能團(tuán)。組成蛋

19、白質(zhì)氨基酸殘基上的功能團(tuán)。主要有：主要有：氨基、羧基、胍基、巰基、酚基、咪唑基。氨基、羧基、胍基、巰基、酚基、咪唑基。側(cè)鏈基團(tuán)修飾劑：側(cè)鏈基團(tuán)修飾劑：采用的各種小分子化合物。采用的各種小分子化合物。 2020種不同氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)中只有極性氨基種不同氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)中只有極性氨基酸的側(cè)鏈易被修飾，它們一般具有親核性。酸的側(cè)鏈易被修飾，它們一般具有親核性。根據(jù)氨基酸側(cè)鏈根據(jù)氨基酸側(cè)鏈r r基的極性，基的極性，2020種氨基酸可分成種氨基酸可分成4 4類類。 1. 1. 非極性非極性r r基氨基酸基氨基酸（共（共8 8種）：種）： 丙氨酸丙氨酸(alanine(alanine,ala,a),ala

20、,a), 亮氨酸亮氨酸(leucine,leu(leucine,leu, l), l), 纈氨酸纈氨酸(valine(valine,val,v), ,val,v), 異亮氨酸異亮氨酸(isoleucine,ile(isoleucine,ile,i),i), 苯丙氨酸苯丙氨酸(phenylalanine,phe(phenylalanine,phe,f),f), 色氨酸色氨酸(tryptophan,trp(tryptophan,trp,w),w), 甲硫氨酸甲硫氨酸(methionine(methionine,met,m),met,m), 脯氨酸脯氨酸(proline(proline,pro,p)

21、,pro,p)2.2.無電荷的極性無電荷的極性r r基氨基酸基氨基酸（共（共7 7種）：種）：絲氨酸絲氨酸(serine,ser,s), (serine,ser,s), 蘇氨酸蘇氨酸(threonine,thr(threonine,thr,t),t),酪氨酸酪氨酸(tyrosine,tyr,y), (tyrosine,tyr,y), 半胱氨酸半胱氨酸(cysteine,cys(cysteine,cys,c),c),天冬酰胺天冬酰胺(asparagine,asn,n),(asparagine,asn,n),甘氨酸甘氨酸(glycine,gly(glycine,gly,g), ,g), 谷氨酰胺谷

22、氨酰胺(glutamine,gln(glutamine,gln,q),q)3.3.帶正電荷的極性帶正電荷的極性r r基氨基酸基氨基酸（共（共3 3種）：種）：賴氨酸賴氨酸(lysine,lys,k), (lysine,lys,k), 精氨酸精氨酸(arginine,arg(arginine,arg,r),r),組氨酸組氨酸(histidine(histidine,his,h),his,h)4.4.帶負(fù)電荷的極性帶負(fù)電荷的極性r r基氨基酸基氨基酸（共（共2 2種）：種）：天冬氨酸天冬氨酸(aspartic(aspartic acid,asp,d), acid,asp,d),谷氨酸谷氨酸(glu

23、tamic acid,glu(glutamic acid,glu,e),e)幾種重要的修飾反應(yīng)：幾種重要的修飾反應(yīng)：烷基化反應(yīng)烷基化反應(yīng)?；磻?yīng)?；磻?yīng)氧化還原反應(yīng)氧化還原反應(yīng)芳香環(huán)取代反應(yīng)芳香環(huán)取代反應(yīng)1. 1. 化學(xué)修飾反應(yīng)的類型化學(xué)修飾反應(yīng)的類型 1) 1) 烷基化反應(yīng)烷基化反應(yīng) 試劑特點(diǎn)：試劑特點(diǎn)：烷基上帶活潑鹵素，導(dǎo)致酶分子的親核烷基上帶活潑鹵素，導(dǎo)致酶分子的親核基團(tuán)（如基團(tuán)（如nhnh2 2，-sh-sh等）發(fā)生烷基化。等）發(fā)生烷基化。 可作用基團(tuán)：可作用基團(tuán)： 氨基（氨基（lyslys，argarg），巰基（），巰基（cyscys），羧基（），羧基（aspasp、gluglu），

24、），甲硫基（甲硫基（metmet），咪唑基（），咪唑基（hishis）。）。 修飾劑：修飾劑：2 2，4 4二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。 烷基化反應(yīng) 2) 2) ?；磻?yīng)?；磻?yīng) 試劑特點(diǎn)：試劑特點(diǎn)： 含有含有 結(jié)構(gòu)，作用于側(cè)鏈基團(tuán)上結(jié)構(gòu)，作用于側(cè)鏈基團(tuán)上的親核基團(tuán)，使之?；?。的親核基團(tuán)，使之?；?。 可作用基團(tuán)：可作用基團(tuán)： 氨基，巰基，醇羥基（氨基，巰基，醇羥基（serser、thrthr），酚），酚羥基（羥基（tyrtyr）?；磻?yīng) 3) 3) 氧化和還原反應(yīng)氧化和還原反應(yīng) 試劑特點(diǎn)：試劑特點(diǎn)：具有氧化性或還原性。具有氧化性或還原性。 氧化劑：

25、氧化劑：h2o2 ，n-溴代琥珀酰亞胺溴代琥珀酰亞胺 可被氧化的側(cè)鏈基團(tuán)：可被氧化的側(cè)鏈基團(tuán)：巰基，甲硫基，吲哚基（巰基，甲硫基，吲哚基（trp）、）、咪唑基，酚基等。咪唑基，酚基等。 還原劑：還原劑：2巰基乙醇、巰基乙醇、dtt等。等。 可被還原的側(cè)鏈基團(tuán)：可被還原的側(cè)鏈基團(tuán)：二硫鍵。二硫鍵。連四硫酸鹽氧化巰基，連四硫酸鹽氧化巰基，dttdtt還原逆回，用于保護(hù)巰基。還原逆回，用于保護(hù)巰基。 4) 4) 芳香環(huán)取代反應(yīng)芳香環(huán)取代反應(yīng)試劑：鹵（碘）化，硝化試劑。試劑：鹵（碘）化，硝化試劑。 碘代：碘代： i2 + hi 硝化：硝化： (no2)4c + +(no2)3ch （四硝基甲烷）（四硝

26、基甲烷）2.2.特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾1) 1) 氨基的化學(xué)修飾：氨基的化學(xué)修飾：來源：來源：lys, arg, his, glnlys, arg, his, gln修飾反應(yīng)：修飾反應(yīng)：酰基化與烷基化?；c烷基化酰基化酰基化修飾劑修飾劑: 三硝基苯磺酸（三硝基苯磺酸（tnbstnbs）、）、丹磺酰氯（丹磺酰氯（dnsdns）烷基化烷基化修飾劑修飾劑： 2 2，4 4二硝基氟苯（二硝基氟苯（dnfbdnfb）、碘乙酸、碘乙）、碘乙酸、碘乙酰胺、亞硝酸等酰胺、亞硝酸等 2) 2) 羧基的化學(xué)修飾羧基的化學(xué)修飾修飾羧基的反應(yīng)專一性較差。修飾羧基的反應(yīng)專一性

27、較差。常用常用水溶性碳化二亞胺水溶性碳化二亞胺修飾天冬氨酸和谷氨酸。修飾天冬氨酸和谷氨酸。可定量測(cè)定酶分子中羧基的數(shù)目。可定量測(cè)定酶分子中羧基的數(shù)目。 + 水溶性碳化二亞胺水溶性碳化二亞胺3)3)胍基的化學(xué)修飾胍基的化學(xué)修飾來源：來源：argarg修飾反應(yīng)：修飾反應(yīng)：本質(zhì)上是本質(zhì)上是羰基羰基對(duì)對(duì)氨基氨基?；；?。修飾劑：修飾劑： 丁二酮丁二酮 二羰基化合物二羰基化合物 1 1，2 2環(huán)己二酮環(huán)己二酮 苯乙二醛苯乙二醛4)4)巰基的化學(xué)修飾巰基的化學(xué)修飾 來源：來源：cyscys 修飾反應(yīng)修飾反應(yīng): :烷基化烷基化 修飾劑：修飾劑：碘乙酸碘乙酸(iaa) (iaa) 碘乙酰胺碘乙酰胺(iam

28、)(iam) e-sh + r-x e-sr +hxn-n-乙基馬來酰亞胺乙基馬來酰亞胺（nemnem）（常用的專一修飾巰基試劑）（常用的專一修飾巰基試劑）esh 5) 5) 二硫鍵的化學(xué)修飾二硫鍵的化學(xué)修飾還原：還原：巰基乙醇、二硫蘇糖醇（巰基乙醇、二硫蘇糖醇（dttdtt）氧化：氧化：過甲酸過甲酸: : performic acid 6)6)咪唑基的化學(xué)修飾咪唑基的化學(xué)修飾 來源：來源：hishis 修飾反應(yīng)修飾反應(yīng): :?；c?；c烷基化烷基化 ?；；揎梽┬揎梽? : 常用焦碳酸二乙酯（常用焦碳酸二乙酯（diethyl paracarbonatediethyl paracar

29、bonate） + + c2h5oh +co2 烷基化烷基化修飾劑：修飾劑：碘乙酸碘乙酸 + ich2cooh + hi7 7）酚羥基的化學(xué)修飾）酚羥基的化學(xué)修飾來源：來源：tyrtyr修飾反應(yīng)：修飾反應(yīng)：芳香環(huán)取代反應(yīng)芳香環(huán)取代反應(yīng)修飾劑：修飾劑：碘、硝化試劑（四硝基甲烷）碘、硝化試劑（四硝基甲烷）8 8）吲哚基的化學(xué)修飾）吲哚基的化學(xué)修飾 來源：來源：trptrp 修飾反應(yīng)：修飾反應(yīng)：氧化反應(yīng)氧化反應(yīng) 修飾劑：修飾劑： n-n-溴代琥珀酰亞胺溴代琥珀酰亞胺氨基酸氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)側(cè)鏈基團(tuán)修飾劑修飾劑lyslys氨基氨基三硝基苯磺酸，三硝基苯磺酸，2 2，4 4二硝基氟苯、碘乙二硝基氟苯、碘乙酸

30、、碘乙酰胺、酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亞硝酸丹磺酰氯、亞硝酸aspasp、gluglu羧基羧基水溶性碳化二亞胺水溶性碳化二亞胺argarg胍基胍基苯乙二醛，苯乙二醛，1,21,2環(huán)己二酮、丁二酮環(huán)己二酮、丁二酮cyscys巰基巰基碘乙酸、碘乙酰胺、碘乙酸、碘乙酰胺、n-n-乙基馬來酰亞胺乙基馬來酰亞胺二硫鍵二硫鍵巰基乙醇、巰基乙醇、dttdtthishis咪唑基咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸焦碳酸二乙酯、碘乙酸t(yī)yrtyr酚羥基酚羥基碘、四硝基甲烷碘、四硝基甲烷trptrp吲哚基吲哚基n-n-溴代琥珀酰亞胺溴代琥珀酰亞胺 各種氨基酸側(cè)鏈的修飾劑各種氨基酸側(cè)鏈的修飾劑 但解釋修飾效果須十分小心，因?yàn)椋?/p>

31、但解釋修飾效果須十分小心，因?yàn)椋喝魏我环N修飾劑不是絕對(duì)專一的。任何一種修飾劑不是絕對(duì)專一的。有些修飾劑引起蛋白質(zhì)構(gòu)象變化有些修飾劑引起蛋白質(zhì)構(gòu)象變化失活，失活， 不一定是活性中心基團(tuán)被共價(jià)修飾。不一定是活性中心基團(tuán)被共價(jià)修飾。不同部分的相同基團(tuán)，修飾效果不同，分子不同部分的相同基團(tuán)，修飾效果不同，分子內(nèi)部的必需基團(tuán)，不易被修飾。內(nèi)部的必需基團(tuán)，不易被修飾。（三）交聯(lián)修飾（三）交聯(lián)修飾（交聯(lián)法）（交聯(lián)法） 用雙功能基團(tuán)試劑用雙功能基團(tuán)試劑( (如戊二醛如戊二醛) )，與酶分子內(nèi)不，與酶分子內(nèi)不同肽鏈部分共價(jià)交聯(lián)，使酶分子空間構(gòu)象更加穩(wěn)定。同肽鏈部分共價(jià)交聯(lián)，使酶分子空間構(gòu)象更加穩(wěn)定。（四）固定化

32、修飾（四）固定化修飾（共價(jià)偶聯(lián)法）（共價(jià)偶聯(lián)法） 通過酶表面的酸性或堿性殘基，將酶共價(jià)連接通過酶表面的酸性或堿性殘基，將酶共價(jià)連接到惰性載體上，由于酶所處的微環(huán)境發(fā)生改變，使到惰性載體上，由于酶所處的微環(huán)境發(fā)生改變，使酶的最適酶的最適phph、最適溫度和穩(wěn)定性發(fā)生改變。、最適溫度和穩(wěn)定性發(fā)生改變。二、酶分子內(nèi)部修飾二、酶分子內(nèi)部修飾（一）蛋白主鏈修飾（肽鏈有限水解修飾）（一）蛋白主鏈修飾（肽鏈有限水解修飾） 蛋白主鏈修飾采用酶法（用專一性較強(qiáng)的蛋白主鏈修飾采用酶法（用專一性較強(qiáng)的蛋白酶或肽酶為修飾劑）。蛋白酶或肽酶為修飾劑）。 （與前面化學(xué)修飾區(qū)別）（與前面化學(xué)修飾區(qū)別） 酶蛋白的肽鏈被水解后

33、，可能出現(xiàn)以下三種情況酶蛋白的肽鏈被水解后，可能出現(xiàn)以下三種情況中的一種：中的一種：1 1 引起酶活性中心的破壞，酶失去催化功能。引起酶活性中心的破壞，酶失去催化功能。2 2 仍維持活性中心的完整構(gòu)象，保持酶活力。仍維持活性中心的完整構(gòu)象，保持酶活力。3 3 有利于活性中心與底物結(jié)合并形成準(zhǔn)確的催化部位，有利于活性中心與底物結(jié)合并形成準(zhǔn)確的催化部位，酶活力提高。酶活力提高。 后兩種情況，肽鏈的水解在限定的肽鍵上進(jìn)行，后兩種情況，肽鏈的水解在限定的肽鍵上進(jìn)行，稱肽鏈有限水解。稱肽鏈有限水解。應(yīng)用實(shí)例：應(yīng)用實(shí)例：1 1）提高酶活力：）提高酶活力：2 2）消除抗原性：）消除抗原性：（二）氨基酸置換修

34、飾（二）氨基酸置換修飾 將肽鏈上的某一個(gè)氨基酸換成另一個(gè)氨基酸，引起將肽鏈上的某一個(gè)氨基酸換成另一個(gè)氨基酸，引起酶蛋白空間構(gòu)象的改變，從而改變酶的某些特性和功能酶蛋白空間構(gòu)象的改變，從而改變酶的某些特性和功能的方法。的方法。 通過兩個(gè)途徑實(shí)現(xiàn)：通過兩個(gè)途徑實(shí)現(xiàn)：化學(xué)修飾法：由于可用試劑的限制，獲得的種類少?；瘜W(xué)修飾法：由于可用試劑的限制，獲得的種類少。蛋白質(zhì)工程：利用基因操縱技術(shù)。蛋白質(zhì)工程：利用基因操縱技術(shù)。（三）金屬離子置換修飾（三）金屬離子置換修飾 改變酶分子中所含的金屬離子，使酶的特性和功能改變酶分子中所含的金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的方法。發(fā)生改變的方法。 第六章第六章 酶的

35、蛋白質(zhì)工程酶的蛋白質(zhì)工程一、概念：一、概念： 蛋白質(zhì)工程是以創(chuàng)造性能更適用的蛋蛋白質(zhì)工程是以創(chuàng)造性能更適用的蛋白質(zhì)分子為目的，以結(jié)構(gòu)生物學(xué)與生物信白質(zhì)分子為目的，以結(jié)構(gòu)生物學(xué)與生物信息學(xué)為基礎(chǔ)，以基因重組技術(shù)為主要手段，息學(xué)為基礎(chǔ)，以基因重組技術(shù)為主要手段，對(duì)天然蛋白質(zhì)分子的設(shè)計(jì)和改造。對(duì)天然蛋白質(zhì)分子的設(shè)計(jì)和改造。二、蛋白質(zhì)的功能基礎(chǔ)二、蛋白質(zhì)的功能基礎(chǔ) 蛋白質(zhì)的功能在很大程度上取決于蛋白質(zhì)的功能在很大程度上取決于其空間結(jié)構(gòu)。其空間結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定：一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定：直接法：直接法：直接測(cè)定多肽鏈的氨基酸順序。直接測(cè)定多肽鏈的氨基酸順序。間接法：間接法：從編碼蛋白質(zhì)

36、的基因的核苷酸順序來推導(dǎo)從編碼蛋白質(zhì)的基因的核苷酸順序來推導(dǎo)蛋白質(zhì)的氨基酸順序。蛋白質(zhì)的氨基酸順序。三級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定：三級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定：x-x-射線晶體衍射射線晶體衍射研究處在研究處在晶體狀態(tài)晶體狀態(tài)下的蛋白質(zhì)下的蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)的空間結(jié)構(gòu)核磁共振核磁共振( (nmr)nmr)光譜光譜研究處在研究處在溶液狀態(tài)溶液狀態(tài)的蛋白的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。質(zhì)的結(jié)構(gòu)。 x-x-射線衍射技術(shù)：射線衍射技術(shù)： 用于蛋白質(zhì)及核酸三維結(jié)構(gòu)的確定，至今已有數(shù)用于蛋白質(zhì)及核酸三維結(jié)構(gòu)的確定，至今已有數(shù)百種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)被確定。百種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)被確定。三、蛋白質(zhì)工程的主要手段三、蛋白質(zhì)工程的主要手段 以重組以重組dnadna技術(shù)為核心的基因工程技術(shù)改造蛋白質(zhì)。技術(shù)為核心的基因工程技術(shù)改造蛋白質(zhì)。 位點(diǎn)特異性突變位點(diǎn)特異性突變