膠質(zhì)瘤細(xì)胞的培養(yǎng)及應(yīng)用

1、 膠質(zhì)瘤細(xì)胞的培養(yǎng)及其應(yīng)用【摘要】  膠質(zhì)瘤細(xì)胞及組織培養(yǎng)的方法日益成熟，近些年來有了一些新的改進(jìn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于膠質(zhì)瘤實(shí)驗(yàn)的多方面研究：放療、化療、生物治療等方面細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)以及動(dòng)物模型的建立。【關(guān)鍵詞】  膠質(zhì)瘤；細(xì)胞培養(yǎng)；應(yīng)用   據(jù)統(tǒng)計(jì)大約9%的人類腫瘤是腦腫瘤，而腦腫瘤中90%是膠質(zhì)瘤1。腦膠質(zhì)瘤是來源于神經(jīng)上皮的腫瘤。在成人致命原發(fā)腦腫瘤中，高級(jí)別惡性膠質(zhì)瘤最常見，確診后中位生存期為912個(gè)月2，而且這些患者是經(jīng)過積極治療的，包括外科切除、放療、化療等。這些治療的失敗部分歸咎于膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性生長(zhǎng)以及與周圍正常腦組織交錯(cuò)，因而外科手術(shù)難以完全切

2、除3；同時(shí)由于其異常的生物學(xué)特性，對(duì)放、化療的抗拒，導(dǎo)致術(shù)后放、化療失敗；而且經(jīng)常以同級(jí)別或高級(jí)別復(fù)發(fā)4。因此需要開辟新的治療方法如生物治療以及開發(fā)新的治療藥物，這些新的治療方法及新藥研制都需要以實(shí)驗(yàn)為依據(jù)。目前關(guān)于膠質(zhì)瘤的常用研究方法有臨床實(shí)驗(yàn)和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)。其中常用的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)是基礎(chǔ)，是利用培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，從細(xì)胞水平、分子水平揭示膠質(zhì)瘤的細(xì)胞特性。它具有許多優(yōu)點(diǎn)：可以長(zhǎng)時(shí)間直接觀察細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)5；研究的條件可以人為控制；研究的樣本比較均一；研究的內(nèi)容便于觀察、檢測(cè)和記錄；可以用于許多領(lǐng)域的研究；相對(duì)而言比較經(jīng)濟(jì)。   

3、; 1  膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)的歷史    1925年，F(xiàn)ish培養(yǎng)人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞獲得成功，開創(chuàng)了體外研究膠質(zhì)瘤的先河。Manuelidis 于1959年建立的世界上第1個(gè)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株TC178，使體外長(zhǎng)期連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察膠質(zhì)瘤細(xì)胞成為可能。 20世紀(jì)70年代以來，隨著基礎(chǔ)培養(yǎng)技術(shù)的迅猛發(fā)展，膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)和克隆技術(shù)日趨成熟。近年來更是探索出許多新的培養(yǎng)方法，并應(yīng)用于各項(xiàng)研究。目前膠質(zhì)瘤的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)比較成熟，已經(jīng)建立了許多膠質(zhì)瘤品系，如國(guó)內(nèi)的人腦惡性膠質(zhì)瘤體外細(xì)胞系SHG-44，是1980年取材于額葉星形細(xì)胞瘤的組織塊經(jīng)胰酶消化，單層靜止培養(yǎng)而成的；細(xì)

4、胞形態(tài)有星形、梭形；流式細(xì)胞光度儀測(cè)定，此細(xì)胞以四倍體為主，G1期占54.57%、S期占15.17%、G2/M期占30.25%；免疫組化提示本細(xì)胞中存在S-100和GFAP；存于蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室。已經(jīng)明確的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系（株）有許多，有人型、鼠型等，如U251、U87、U118、T98、TJ899、TJ905、D54、NT325、CHG5、BT325、9L、C6等，而且今后還會(huì)不斷建立新的品系。    2  目前常用培養(yǎng)方法及應(yīng)用    現(xiàn)有的膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)形式主要有：?jiǎn)螌蛹?xì)胞培養(yǎng)、三維/立體培養(yǎng)及聯(lián)合培

5、養(yǎng)等。    2.1  單層細(xì)胞培養(yǎng)及應(yīng)用  傳統(tǒng)意義上的單層細(xì)胞培養(yǎng)可以分為原代培養(yǎng)以及傳代培養(yǎng)兩類。前者是從供體獲得組織后的初次培養(yǎng)，后者一般為利用現(xiàn)有的細(xì)胞系（株）。兩種培養(yǎng)方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，而且都已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。目前國(guó)內(nèi)研究膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)多采用細(xì)胞系，這主要是因?yàn)閲?guó)內(nèi)已經(jīng)有許多膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，品系明確、易于培養(yǎng)；但連續(xù)性細(xì)胞系由于連續(xù)傳代，細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能發(fā)生了一定的變化，傳代代數(shù)越多，發(fā)生的變化也越大，因而對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的影響。原代培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù)相對(duì)要復(fù)雜得多，而且培養(yǎng)成功率較低，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此不為許多研究者選用；但原代細(xì)胞剛離體

6、，在形狀、結(jié)構(gòu)、功能等方面與體內(nèi)細(xì)胞更接近，相對(duì)能更好地代表其來源組織的細(xì)胞類型及組織特異性，更好地保留膠質(zhì)瘤的生物學(xué)特性，更接近也更能反映體內(nèi)生長(zhǎng)特性，所以原代培養(yǎng)出的細(xì)胞更適合做藥物敏感實(shí)驗(yàn)、放射敏感實(shí)驗(yàn)等基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究。原代單層細(xì)胞培養(yǎng)常用的方法有：組織塊原代培養(yǎng)以及單細(xì)胞懸液法培養(yǎng)。前者是將膠質(zhì)瘤組織塊貼附在培養(yǎng)瓶（板）上，一般12天就會(huì)有細(xì)胞從組織塊邊緣游出，利用游出的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；后者是將組織塊通過機(jī)械分離或酶消化法或者二者結(jié)合的方法分離成單細(xì)胞懸液，再接種于培養(yǎng)瓶（板）進(jìn)行培養(yǎng)的方法6,7 。傳代單層細(xì)胞培養(yǎng)的方法相對(duì)簡(jiǎn)單一些，只需將需要傳代的細(xì)胞用胰蛋白酶消化吹打后，按需要接種于

7、培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，補(bǔ)足培養(yǎng)液即可。以上為傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)方法，在此基礎(chǔ)上又發(fā)展出一些培養(yǎng)方法，如：?jiǎn)渭?xì)胞分離培養(yǎng)法、加支持物培養(yǎng)法、球體細(xì)胞培養(yǎng)法、懸浮培養(yǎng)法等。單細(xì)胞分離培養(yǎng)也就是克隆培養(yǎng)，國(guó)內(nèi)孫立軍、黃強(qiáng)等8已經(jīng)通過對(duì)SHG-44細(xì)胞系單克隆化，建立了具有低、中、高3種不同分化程度的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株。加支持物培養(yǎng)法是為了實(shí)驗(yàn)研究或便于觀察而預(yù)先向培養(yǎng)瓶/板內(nèi)加入支持物；如為了做細(xì)胞免疫組化，預(yù)先在培養(yǎng)板內(nèi)放入小玻片，再培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)在玻片上，取出固定、染色，也稱為爬片。球體細(xì)胞培養(yǎng)是將長(zhǎng)成片的細(xì)胞移入不易貼附的底物上，則細(xì)胞片能卷聚生長(zhǎng)成球形。懸浮培養(yǎng)法，顧名思義就是讓原本貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)。

8、李茗初等9運(yùn)用無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，從中分離出該細(xì)胞系的干細(xì)胞。單層細(xì)胞培養(yǎng)是目前最常用的一種培養(yǎng)方式，已廣泛應(yīng)用于各項(xiàng)基礎(chǔ)研究。    2.1.1  在放射治療研究中的應(yīng)用  目前膠質(zhì)瘤細(xì)胞系眾多，不同細(xì)胞系有各自不同的特點(diǎn)，如MO54對(duì)輻射敏感，而T98則對(duì)輻射抵抗10；U373、U251、U118MGT-98G表達(dá)突變型p53，而U87、D54、A172、CCF-STTG1細(xì)胞表達(dá)野生型p53。針對(duì)不同細(xì)胞系的特點(diǎn)，在實(shí)驗(yàn)研究時(shí)可以根據(jù)需要而加以選擇。Ostruszka等11在研究細(xì)胞周期進(jìn)程中由2,2-二氟脫氧胞嘧啶核苷

9、(2, 2-difluoro-2-deoxycytidine; dFdCyd)引起的放射敏感性的作用中運(yùn)用了2種人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和D54，并且發(fā)現(xiàn)U251對(duì)dFdCyd的細(xì)胞毒性更敏感，dFdCyd也是U251的放射增敏劑，這種差異在于U251表達(dá)突變型p53，而D54細(xì)胞表達(dá)野生型p53，在D54細(xì)胞聯(lián)合dFdCyd和電離輻射后，突出表現(xiàn)在G1期阻滯。Chen等12在研究DB-67作為一種新型DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶具有靶向輻射增敏劑的研究中也運(yùn)用了表達(dá)野生型p53和突變型p53的D54-MG和T-98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞系。Shono等13采用將腺病毒載體-p53(Ad-p53)導(dǎo)入表達(dá)突變型p53

10、的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251、U373和表達(dá)野生型p53的U87、D54細(xì)胞系，Ad-p53能通過增加表達(dá)野生型p53膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡趨勢(shì)來提高它們的放射敏感性，并進(jìn)一步揭示Ad-p53轉(zhuǎn)染的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞所誘導(dǎo)的凋亡和磷酸化區(qū)域特異性的位點(diǎn)相關(guān)。    2.1.2  在化療藥物研究中的應(yīng)用  膠質(zhì)瘤化療效果差，這主要與缺乏有效的化療藥、全身化療時(shí)化療藥難以通過血腦屏障以及腫瘤耐藥有關(guān)。因此膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)廣泛應(yīng)用于新藥開發(fā)。Das等14用U87-MG研究地塞米松能夠通過維持Bax:Bcl比率來保護(hù)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87-MG免于遭受替莫唑胺誘導(dǎo)的凋亡，提示

11、膠質(zhì)瘤患者接受替莫唑胺化療之前如果用地塞米松將會(huì)產(chǎn)生非預(yù)期效果，為指導(dǎo)臨床治療打下基礎(chǔ)。Landen等15在研究那可丁通過血腦屏障及抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)時(shí)利用鼠C6細(xì)胞系，證明那可丁可以抑制C6細(xì)胞增殖，并測(cè)定那可丁通過一層培養(yǎng)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞比率，并且與已知的滲透劑和非滲透劑相比較，來作為體外測(cè)定那可丁通過血腦屏障的方法。    2.1.3  在生物和基因治療研究中的應(yīng)用  生物治療主要是通過調(diào)動(dòng)宿主天然防衛(wèi)機(jī)制或給予機(jī)體某些物質(zhì)來取得抗腫瘤效應(yīng)。對(duì)抗腫瘤防御機(jī)制的基礎(chǔ)理論的深入了解以及生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑（BRMs）的不斷發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用使得生物治療前景廣

12、闊。BRMs大致有以下幾類：天然或基因重組細(xì)胞因子、抗腫瘤的各類體細(xì)胞和輔助性的造血干細(xì)胞、抗體、基因治療、腫瘤疫苗、抗血管生成藥、細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑、某些菌類及其有效成分、植物藥包括中藥的有效成分、有機(jī)酸及小分子合成劑、其他類型。隨著生物治療研究的不斷升溫，膠質(zhì)瘤的細(xì)胞培養(yǎng)已廣泛應(yīng)用于膠質(zhì)瘤生物治療的許多方面，如：Friese等16利用人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系GL261 和SMA-560研究NKG2D，腫瘤細(xì)胞表達(dá)的配體激活免疫受體NKG2D 刺激由NK、T和CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫。人膠質(zhì)瘤細(xì)胞表達(dá)NKG2D的配體MICA、MICB和一些UL16-結(jié)合蛋白家族，然而膠質(zhì)瘤細(xì)胞因?yàn)楦弑?/p>

13、達(dá)型MHC抗原而抵抗NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，體外實(shí)驗(yàn)中質(zhì)粒介導(dǎo)或腺病毒介導(dǎo)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞過表達(dá)的MICA可提高它們對(duì)NK和T細(xì)胞的應(yīng)答。腫瘤疫苗也是當(dāng)今研究熱點(diǎn)之一，制備以及測(cè)試抗膠質(zhì)瘤疫苗都需要膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)。如利用膠質(zhì)瘤細(xì)胞致敏樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）制備膠質(zhì)瘤疫苗。Driessens等17發(fā)現(xiàn)被射線或化療藥（順鉑和絲裂霉素）作用后凋亡的膠質(zhì)瘤9L細(xì)胞聯(lián)合鼠來源的成熟DCs分泌GM-CSF顯示較好的治療腫瘤潛能。Giezeman-Smits等18發(fā)現(xiàn)用白介素-4(IL-4)轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤9L細(xì)胞制備的腫瘤疫苗能夠誘導(dǎo)親代腫瘤發(fā)生特異的、有保護(hù)性的免疫應(yīng)答。針對(duì)膠質(zhì)瘤基因

14、治療的研究也越來越多，如單純皰疹病毒胸腺激酶(HSV-TK)基因/丙氧鳥苷(GCV)系統(tǒng)、大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶(Ec-CD)基因/5 氟胞嘧啶(5-FC)系統(tǒng)；早期生長(zhǎng)反應(yīng)基因-1啟動(dòng)子（pEgr-1）；CEA-啟動(dòng)子等19 22。    2.1.4  在動(dòng)物模型研究中的應(yīng)用  培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞還可以用于建立動(dòng)物模型，為研究膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)理以及治療提供良好的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。如利用鼠類細(xì)胞系立體定向注射于大鼠顱內(nèi)建立鼠膠質(zhì)瘤模型等。Prins等23通過向C57BL/6 (H-2b)雌鼠的腹側(cè)皮下注射GL26膠質(zhì)瘤細(xì)胞以及將GL26膠質(zhì)瘤細(xì)胞立體定向注射于

15、大鼠顱內(nèi)建立鼠膠質(zhì)瘤模型，用于研究黑色素瘤相關(guān)抗原（MMAs）的靶向免疫治療。    2.1.5  在其他方面研究中的應(yīng)用  膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)除用于上述研究外，還廣泛應(yīng)用于其他研究方面，如探討膠質(zhì)瘤細(xì)胞與正常星型細(xì)胞之間的作用機(jī)制；膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制以及侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制等。Zhang等6在研究惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞和星型細(xì)胞之間的直接縫隙連接的交流中采用了原代培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞和原代培養(yǎng)的星型細(xì)胞。Joy等3利用SF767 和T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞系研究發(fā)現(xiàn)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞激活P13-K途徑并且表現(xiàn)降低凋亡的敏感性。Yamamoto等24利用SNB-19、D-54M

16、GU、87 MG、U-373 MG、U-118 MG和SW1088研究N-glycan在調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤遷移和侵襲中的作用。    2.2  三維（立體）培養(yǎng)及應(yīng)用  單層細(xì)胞培養(yǎng)雖然已經(jīng)得以廣泛應(yīng)用，但也有其不足之處：第一，具有遺傳不穩(wěn)定性；第二，是一個(gè)平面結(jié)構(gòu)，而人體是三維立體結(jié)構(gòu)，與人體環(huán)境相差很遠(yuǎn)。針對(duì)這些不足，許多科研工作者也嘗試用立體培養(yǎng)，因?yàn)榄h(huán)境對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)分化有著至關(guān)重要的作用。已有科研證明異位植入的胚胎細(xì)胞能轉(zhuǎn)化為惡性細(xì)胞，并引發(fā)癌癥，而相同的細(xì)胞在子宮內(nèi)則可形成正常的胚胎；相反畸胎瘤細(xì)胞植入胚胎內(nèi)可能經(jīng)歷正常的發(fā)育過程。與傳統(tǒng)的培

17、養(yǎng)方式相比，三維立體培養(yǎng)的細(xì)胞在細(xì)胞形狀和細(xì)胞環(huán)境更接近于活體內(nèi)狀態(tài)，而形狀和環(huán)境能決定細(xì)胞的基因表達(dá)和生物學(xué)行為。三維細(xì)胞培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)還在于具有清晰的幾何學(xué)形狀，這使其結(jié)構(gòu)與功能直接相關(guān)，從而可以進(jìn)行理論分析25。Joki等26在研究環(huán)氧化酶-2的實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用了三維培養(yǎng)系統(tǒng)，證明環(huán)氧化酶-2抑制劑NS-398對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移有抑制作用。但是三維立體培養(yǎng)也不能完全模擬體內(nèi)環(huán)境，而且立體培養(yǎng)的模型在目前條件下難以無限生長(zhǎng)下去，主要是因?yàn)槟Ｐ烷L(zhǎng)到一定大小時(shí)，由于模型中心缺乏營(yíng)養(yǎng)或缺氧而壞死。因此如何解決這些問題，還需要進(jìn)一步努力。    2.3  其他培養(yǎng)方

18、法及應(yīng)用  目前培養(yǎng)和應(yīng)用膠質(zhì)瘤細(xì)胞除了單獨(dú)應(yīng)用上述培養(yǎng)方法以外，還有共培養(yǎng)（coculture）方法,即將2種或2種以上的細(xì)胞一起培養(yǎng)的方法，其實(shí)質(zhì)也是單層細(xì)胞培養(yǎng)；也有嘗試2種或幾種方法聯(lián)合應(yīng)用，如同時(shí)選用單層細(xì)胞培養(yǎng)及三維立體培養(yǎng)。Zhang等6將原代培養(yǎng)的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞和原代培養(yǎng)的鼠星型細(xì)胞共培養(yǎng)，并認(rèn)為2種細(xì)胞之間的縫隙連接的形成不是自然的，因?yàn)閷⒛z質(zhì)瘤細(xì)胞注射入活鼠腦內(nèi)很快就能和宿主細(xì)胞功能性耦聯(lián)在一起，而且和膠質(zhì)瘤細(xì)胞耦聯(lián)在一起的縫隙連接似乎可以調(diào)節(jié)星型細(xì)胞的表型。和膠質(zhì)瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的星型細(xì)胞表達(dá)Cx43顯著降低并可以低水平表達(dá)GFAP。Joki等26在研究環(huán)氧化酶-2的

19、實(shí)驗(yàn)中除了運(yùn)用三維培養(yǎng)系統(tǒng)外，還運(yùn)用了單層細(xì)胞培養(yǎng)檢測(cè)NS-398抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖以及運(yùn)用共培養(yǎng)系統(tǒng)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞侵襲入正常鼠腦細(xì)胞。    3  展  望    提到膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)就不得不關(guān)注膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的研究。目前除膠質(zhì)瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)以及膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的培養(yǎng)外，還有人通過原代無血清培養(yǎng)、神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)以及CD133免疫磁珠分離等方法成功地分離、培養(yǎng)出膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及研究是目前膠質(zhì)瘤研究的熱點(diǎn)，該研究將為膠質(zhì)瘤的診斷與治療帶來新的突破與希望。膠質(zhì)瘤血管發(fā)生、形成、血管結(jié)構(gòu)改變以及與

20、周圍組織的關(guān)系也是當(dāng)今研究熱點(diǎn)，而這方面研究也需要細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。通過該研究有利于闡明膠質(zhì)瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移與其血管生成、結(jié)構(gòu)之間的相關(guān)性，以及化療藥物透過血腦屏障的藥代機(jī)制等。所以膠質(zhì)瘤的細(xì)胞培養(yǎng)是一項(xiàng)非常重要的基礎(chǔ)技術(shù)，相信新的培養(yǎng)技術(shù)會(huì)不斷產(chǎn)生，新的應(yīng)用領(lǐng)域會(huì)不斷發(fā)現(xiàn)。 【參考文獻(xiàn)】  1 Bondy ML, Wang LE, El-Zein R, et al. -radiation sensitivity and risk of gliomaJ. J Natl Cancer Inst, 2001, 93(20) :1553-1557.2 Hegde M, Rodcoe J

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