非無菌制劑微生物限度檢查操作標(biāo)準(zhǔn)程序

1、××××××××××公司GMP文件 編碼：SOP-QC-TY-02-033非無菌制劑微生物限度檢查操作標(biāo)準(zhǔn)程序起草人日期 年 月 日?qǐng)?zhí)行日期2015年12月01日審核人日期 年 月 日頒發(fā)部門質(zhì)保部批準(zhǔn)人日期 年 月 日分 發(fā)部 門 質(zhì)保部（）生產(chǎn)部（）采供部（） 銷售部（）設(shè)備部（）物資部（） 銷售部（）行政部（）財(cái)務(wù)部（） 變更記載：修訂號(hào)執(zhí)行日期002012年06月01日012014年05月01日022015年12月01日 1. 目的：建立非無菌藥品微生物限度檢查檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，規(guī)范檢驗(yàn)

2、操作，確保檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確。 2. 適用范圍：適用于本公司所有采用非無菌藥品微生物限度檢查法測(cè)定的供試品。 3. 責(zé)任者：QC檢驗(yàn)員、QC經(jīng)理。 4. 正文： 4.1 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法 4.1.1 簡(jiǎn)述 微生物計(jì)數(shù)法系用于能在有氧條件下生長的嗜溫細(xì)菌和真菌的計(jì)數(shù)。當(dāng)本法用于檢查非無菌制劑及其原、輔料等是否符合規(guī)定的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)按下述規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，包括樣品的取樣量和結(jié)果的判斷等。除另有規(guī)定外，本法不適用于活菌制劑的檢查。 本檢查法可采用替代的微生物檢查法，包括自動(dòng)檢測(cè)方法，但必須證明替代方法等效于藥典規(guī)定的檢查方法。微生物計(jì)數(shù)試驗(yàn)應(yīng)在受控潔凈環(huán)境下的局部潔凈度不低于B

3、級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。檢驗(yàn)全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)域、工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期進(jìn)行監(jiān)測(cè)。 如供試品有抗菌活性，應(yīng)盡可能去除或中和。供試品檢查時(shí), 若使用了中和劑或滅活劑，應(yīng)確認(rèn)其有效性及對(duì)微生物無毒性。 供試液制備時(shí)如果使用了表面活性劑，應(yīng)確認(rèn)其對(duì)微生物無毒性以及與所使用中和劑或滅活劑的相容性。 4.1.2 計(jì)數(shù)方法 計(jì)數(shù)方法包括平皿法、薄膜過濾法和最可能數(shù)法（Most-Probable-NumberMethod，簡(jiǎn)稱MPN 法）。MPN 法用于微生物計(jì)數(shù)時(shí)精確度較差，但對(duì)于某些微生物污染量很小的供試品，MPN 法可能是更

4、適合的方法。 供試品檢查時(shí), 應(yīng)根據(jù)供試品理化特性和微生物限度標(biāo)準(zhǔn)等因素選擇計(jì)數(shù)方法，所選的方法必須具備檢測(cè)充足樣品量的能力，以保證所獲得的試驗(yàn)結(jié)果能夠判斷供試品是否符合規(guī)定。所選方法的適用性須經(jīng)確認(rèn)。4.1.3 計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和供試品計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn) 供試品微生物計(jì)數(shù)中所使用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行適用性檢查。 供試品的微生物計(jì)數(shù)方法應(yīng)進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的微生物計(jì)數(shù)。 若檢驗(yàn)程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，計(jì)數(shù)方法應(yīng)重新進(jìn)行適用性試驗(yàn)。 表1 試驗(yàn)菌液的制備和使用試驗(yàn)菌株試驗(yàn)菌液的制備計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)

5、需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)金黃色葡萄球菌(Staphylococcusau-reus)CMCC(B)26 003)胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度3035，培養(yǎng)時(shí)間1824小時(shí)胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫3035，培養(yǎng)時(shí)間不超過3 天，接種量不大于100cfu胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基/胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（MPN法），培養(yǎng)溫度3035，培養(yǎng)時(shí)間不超過3 天，接種量不大于100cfu銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeru-ginosa） CMCC（B）10 104胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫 度3035，培養(yǎng)時(shí) 間1824

6、小時(shí)胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度 3035，培養(yǎng)時(shí)間 不超過3天，接種量不大于100cfu胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基/胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（MPN法），培養(yǎng)溫度3035，培養(yǎng)時(shí)間不超過3 天，接種量不大于100cfu枯草芽孢桿菌 (Bacillussubtilis) CMCC(B) 63 501胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度3035，培養(yǎng)時(shí)間1824小時(shí)胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng) 基和胰酪大豆胨液體 培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度 3035，培養(yǎng)時(shí)間不超過3天，接種量不大于100cfu胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基/ 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（MPN法），培養(yǎng)溫度3035，培養(yǎng)時(shí)間不超過3

7、 天，接種量不大于100cfu白色念珠菌 (Candida albicans) CMCC(F) 98 001沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度2025，培養(yǎng)時(shí)間23 天胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度3035，培養(yǎng)時(shí)間不超過5天，接種量不大于100cfu沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度2025，培養(yǎng)時(shí)間不超過5天，接種量不大于100cfu胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（MPN 法不適用），培養(yǎng)溫度3035，培養(yǎng)時(shí)間不超過5 天，接種量不大于100cfu沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度 20&#

8、160;25，培養(yǎng)時(shí)間不超過5天，接種量不大于100cfu黑曲霉(Aspergillus niger) CMCC(F) 98 003沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度2025，培養(yǎng)時(shí)間57天，或直到獲得豐富的孢子胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度3035，培養(yǎng)時(shí)間不超過5 天接種量不大于100cfu沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度 2025，培養(yǎng)時(shí)間不超過5天，接種量不大于100cfu胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)（MPN法不適用），培養(yǎng)溫度3035，培養(yǎng)時(shí)間不超過5天接種量不大于100cfu沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度 

9、2025培養(yǎng)時(shí)間不超過5天接種量不大于100cfu注：當(dāng)需用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基測(cè)定霉菌和酵母菌總數(shù)時(shí)，應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查，檢查方法同沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。 4.1.4 菌種及菌液制備 菌種 試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)不得超過5 代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0 代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)用菌株見表1。 菌液制備 按表1 規(guī)定程序培養(yǎng)各試驗(yàn)菌株。取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物，用PH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液；取黑曲霉的新鮮

10、培養(yǎng)物加入35ml 含0.05聚山梨酯80 的PH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05聚山梨酯80的PH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的黑曲霉孢子懸液。 菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2 小時(shí)內(nèi)使用；若保存在28，可在24小時(shí)內(nèi)使用。穩(wěn)定的黑曲霉孢子懸液可保存在28，在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)使用。 4.1.5 陰性對(duì)照 為確認(rèn)試驗(yàn)條件是否符合要求，應(yīng)進(jìn)行陰性對(duì)照試驗(yàn)，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)無菌生長。如陰性對(duì)照有菌生長，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。 4.1.6 培養(yǎng)基適用性檢查微生物計(jì)數(shù)用的成

11、品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查。 按表 1 規(guī)定，接種不大于100cfu 的菌液至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基管或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板，置表1 規(guī)定條件下培養(yǎng)。 每一試驗(yàn)菌株平行制備2 管或2 個(gè)平皿。同時(shí)，用相應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)。 被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值應(yīng)在0.5-2 范圍內(nèi)，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致；被檢液體培養(yǎng)基管與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，試驗(yàn)菌應(yīng)生長良好。 4.1.7 計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn) 供試液制備 根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性,采取適宜的方法制備供試液。

12、供試液制備若需加溫時(shí),應(yīng)均勻加熱,且溫度不應(yīng)超過45。供試液從制備至加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基,不得超過1 小時(shí)。 常用的供試液制備方法如下。如果下列供試液制備方法經(jīng)確認(rèn)均不適用，應(yīng)建立其他適宜的方法。 水溶性供試品 取供試品，用PH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或PH7.2 磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基溶解或稀釋制成1:10 供試液。若需要，調(diào)節(jié)供試液PH 值至68。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。 水不溶性非油脂類供試品 取供試品，用PH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或PH7.2 磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基制

13、備成1:10 供試液。分散力較差的供試品，可在稀釋劑中加入表面活性劑如0.1%的聚山梨酯80，使供試品分散均勻。若需要，調(diào)節(jié)供試液PH 值至68。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10 倍系列稀釋。 油脂類供試品 取供試品，加入經(jīng)過濾除菌的十四烷酸異丙酯使溶解，或與最少量并能使供試品乳化的無菌聚山梨酯80 或其他無抑菌性的無菌表面活性劑充分混勻。表面活性劑的溫度一般不超過40（特殊情況下，最多不超過45），小心混合，若需要可在水浴中進(jìn)行，然后加入預(yù)熱的稀釋劑使成110供試液，保溫，混合，并在最短時(shí)間內(nèi)形成乳狀液。必要時(shí)，用含適宜濃度的無菌聚山梨酯80 或其他無抑制性無菌表面活性劑的稀釋劑進(jìn)一步

14、10 倍系列稀釋。 需用特殊方法制備供試液的供試品 膜劑供試品 取供試品,剪碎,加PH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或PH7.2磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，浸泡，振搖，制備成110 的供試液。若需要，調(diào)節(jié)供試液PH 值至68。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。 腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品 取供試品，加入PH6.8 無菌磷酸鹽緩沖液（用于腸溶制劑）或PH7.6 無菌磷酸鹽緩沖液（用于結(jié)腸溶制劑），置45水浴中,振搖,使溶解,制備成110 的供試液。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。 氣霧劑、噴霧劑供試品 取供試品,置冰凍室冷凍約1 小時(shí)，取出，迅速消毒供

15、試品開啟部位，用無菌鋼錐在該部位鉆一小孔，放至室溫，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)容器，使拋射劑緩緩全部釋出。用無菌注射器從每一容器中吸出全部藥液于無菌容器中混合，然后取樣檢查。 貼膏劑供試品 取供試品,去掉防粘層，將粘貼面朝上放置在無菌玻璃或塑料器皿上，在粘貼面上覆蓋一層適宜的無菌多孔材料（如無菌紗布），避免貼膏劑粘貼在一起。將處理后的貼膏劑放入盛有適宜體積并含有表面活性劑（如聚山梨脂80 或卵磷脂）稀釋液的容器中，振蕩至少30 分鐘。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10 倍系列稀釋。 接種和稀釋 按下列要求進(jìn)行供試液的接種和稀釋,制備微生物回收試驗(yàn)用供試液。所加菌液的體積應(yīng)不超過供試液體積的1%。為確認(rèn)供試

16、品中的微生物能被充分檢出，首先應(yīng)選擇最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)。 （1）試驗(yàn)組 取上述制備好的供試液，加入試驗(yàn)菌液，混勻，使每1ml供試液或每張濾膜所濾過的供試液中含菌量不大于100cfu。 （2）供試品對(duì)照組 取制備好的供試液, 以稀釋液代替菌液同試驗(yàn)組操作。 （3）菌液對(duì)照組 取不含中和劑及滅活劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液,按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌液并進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。 若因供試品抗菌活性或溶解性較差的原因?qū)е聼o法選擇最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)采用適宜的方法對(duì)供試液進(jìn)行進(jìn)一步的處理。如果供試品對(duì)微生物生長的抑制作用無法以其他方法消除，供試液可經(jīng)過中和、稀釋或薄膜過

17、濾處理后再加入試驗(yàn)菌懸液進(jìn)行方法適應(yīng)性試驗(yàn)。 抗菌活性的去除或滅活 供試液接種后，按下列“微生物回收”規(guī)定的方法進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)。若試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值小于菌液對(duì)照組菌數(shù)值的50%，可采用下述方法消除供試品的抑菌活性。 增加稀釋液或培養(yǎng)基體積。 加入適宜的中和劑或滅活劑。 中和劑或滅活劑（表2）可用于消除抗菌劑的抑菌活性， 最好在稀釋劑或培養(yǎng)基滅菌前加入。若使用中和劑或滅活劑，試驗(yàn)中應(yīng)設(shè)中和劑或滅活劑對(duì)照組，即取相應(yīng)量稀釋液替代供試品同試驗(yàn)組操作，以確認(rèn)其有效性和對(duì)微生物無毒性。中和劑或滅活劑對(duì)照組的菌落數(shù)與菌液對(duì)照組的菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.52范圍內(nèi)。表2 常見干擾物的中和劑或

18、滅活方法干擾物可選用的中和劑或滅活方法戊二醛亞硫酸氫納酚類、乙醇、吸附物稀釋法醛類甘氨酸季銨化合物、對(duì)羥基苯甲酸、雙胍類化合物卵磷脂季銨化合物、碘、對(duì)羥基苯甲酸聚山梨酯水銀巰基醋酸鹽水銀、汞化物、醛類硫代硫酸鹽乙二胺四乙酸（EDTA）、喹諾酮類抗生素鎂或鈣離子磺胺類對(duì)氨基苯甲酸ß-內(nèi)酰胺類抗生素ß-內(nèi)酰胺酶 采用薄膜過濾法。 上述幾種方法的聯(lián)合使用。 若沒有適宜消除供試品抑菌活性的方法，對(duì)特定試驗(yàn)菌回收的失敗，表明供試品對(duì)該試驗(yàn)菌具有抗菌活性，同時(shí)也表明供試品不可能被該類微生物污染。但是，供試品也可能僅對(duì)特定試驗(yàn)菌株具有抑制作用，而對(duì)其他菌株沒有抑制作用。 因此，根據(jù)供試品

19、須符合的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報(bào)告規(guī)則，在不影響檢驗(yàn)結(jié)果判斷的前提下，應(yīng)采用能使微生物生長的更高稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)。若方法適用性試驗(yàn)符合要求，應(yīng)以該稀釋級(jí)供試液作為最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行供試品檢查。 供試品中微生物的回收 表1 所列的計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)用的各試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。 微生物的回收可采用平皿法、薄膜過濾法或MPN 法。 平皿法 平皿法包括傾注法和涂布法。表1 中每株試驗(yàn)菌每種培養(yǎng)基至少制備2 個(gè)平皿，以算術(shù)均值作為計(jì)數(shù)結(jié)果。 傾注法 取照上述“供試液的制備”、“接種和稀釋”和“抑菌活性的中和或消除”制備的供試液1ml，置直徑90mm 的無菌平皿中, 注入1

20、520ml 溫度不超過45熔化的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。 若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基的用量應(yīng)相應(yīng)增加。按表1 規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。 同法測(cè)定供試品對(duì)照組及菌液對(duì)照組菌數(shù)。計(jì)算各試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)。涂布法 取1520ml 溫度不超過45的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，注入直徑90mm 的無菌平皿，凝固，制成平板，采用適宜的方法使培養(yǎng)基表面干燥。 若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基用量也應(yīng)相應(yīng)增加。每一平皿表面接種上述照“供試液的制備”、“接種和稀釋”和“抑菌活性的中和或消除”制備的供試液不少于0.1ml。按表1 規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。同法測(cè)定供試品對(duì)照組及菌

21、液對(duì)照組菌數(shù)。計(jì)算各試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)。 薄膜過濾法 薄膜過濾法所采用的濾膜孔徑應(yīng)不大于 0.45m,直徑一般為50mm,若采用其他直徑的濾膜,沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。選擇濾膜材質(zhì)時(shí)應(yīng)保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。使用時(shí),應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品,其濾膜和濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率,應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過濾后,若需要用沖洗液沖洗濾膜,每張濾膜每次沖洗量為100ml?？倹_洗量不得超過1000ml,以避免濾膜上的微生物受損

22、傷。 取照上述“供試液的制備”、“接種和稀釋”和“抑菌活性的中和或消除”制備的供試液適量（一般取相當(dāng)于1g、1ml或10cm2的供試品,若供試品中所含的菌數(shù)較多時(shí)，供試液可酌情減量），加至適量的稀釋液中,混勻,過濾。用適量的沖洗液沖洗濾膜。 測(cè)定需氧菌總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上；若測(cè)定霉菌和酵母總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上。按表1 規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。每株試驗(yàn)菌每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。同法測(cè)定供試品對(duì)照組及菌液對(duì)照組菌數(shù)。 MPN 法 MPN 法的精密度和準(zhǔn)確度不及薄膜過濾法和平皿計(jì)數(shù)法，僅在供試品需氧菌總數(shù)沒有適宜計(jì)數(shù)方法的情況下使用，本

23、法不適用于霉菌計(jì)數(shù)。若使用MPN 法，按下列步驟進(jìn)行。 取照上述 “供試液的制備”、“接種和稀釋”和“抑菌活性的中和或消除”制備的供試液至少3 個(gè)連續(xù)稀釋級(jí)，每一稀釋級(jí)取3 份1ml 分別接種至3 管裝有910ml 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，同法測(cè)定菌液對(duì)照組菌數(shù)。必要時(shí)可在培養(yǎng)基中加入表面活性劑、中和劑或滅活劑。 接種管置3035培養(yǎng)3 天，逐日觀察各管微生物生長情況。如果由于供試品的原因使得結(jié)果難以判斷，可將該管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，在相同條件下培養(yǎng)12 天，觀察是否有微生物生長。根據(jù)微生物生長的管數(shù)從表3 查對(duì)被測(cè)供試品每1g 或每1ml 中總需氧菌的最可

24、能數(shù)。表3 微生物最可能數(shù)檢索表生長管數(shù)需氧菌總數(shù)最可能數(shù)95%置信限每管含樣品的g或ml數(shù)MPN/g或ml下限上限0.10.010.001000309.400130.19.501030.1100116.11.2170206.21.2170309.43.5351003.60.2171017.21.217102114351107.41.320111114351201143512115538130165382009.21.53520114435202205382101543821120538212279942202154022128994222359942302999423136994300235

25、94301389104302641618131043918131175171993121203036031316030380320931836032115030380322210304003232909099033024040990331460901980332110020040003331100注：表內(nèi)所列檢驗(yàn)量如改用1g（或ml）、0.1g（或ml）和0.01g（或ml）時(shí)，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低10 倍；如改用0.01 g（或ml）、0.001 g（或ml）和0.0001 計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)中，采用薄膜過濾法或平皿法時(shí)，試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值與菌液對(duì)照組菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.5

26、2 范圍內(nèi)；采用MPN法，試驗(yàn)g（或ml）時(shí)，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增加10 倍，其余類推。 結(jié)果判斷 組菌數(shù)應(yīng)在菌液對(duì)照組菌數(shù)的95%置信限內(nèi)。若各試驗(yàn)菌的回收試驗(yàn)均符合要求，照所用的供試液制備方法及計(jì)數(shù)方法進(jìn)行該供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)。方法適用性確認(rèn)時(shí),若采用上述方法還存在一株或多株試驗(yàn)菌的回收達(dá)不到要求,那么選擇回收最接近要求的方法和試驗(yàn)條件進(jìn)行供試品的檢查。 4.1.8 供試品檢查 檢驗(yàn)量 檢驗(yàn)量即一次試驗(yàn)所用的供試品量（g、ml 或cm2）。除另有規(guī)定外,一般供試品的檢驗(yàn)量為10g 或10ml；膜劑為100cm2；貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗(yàn)量可以酌減。檢驗(yàn)時(shí),應(yīng)從2 個(gè)以

27、上最小包裝單位中抽取供試品,大蜜丸還不得少于4 丸,膜劑還不得少于4 片。 一般應(yīng)隨機(jī)抽取供試品，取規(guī)定容器數(shù)，混合，取規(guī)定量供試品進(jìn)行檢驗(yàn)。 供試品的檢查 按計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行供試品中需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的測(cè)定。 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基用于測(cè)定需氧菌總數(shù)；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于測(cè)定霉菌和酵母菌總數(shù)。 陰性對(duì)照試驗(yàn) 以稀釋劑代替供試液進(jìn)行陰性對(duì)照試驗(yàn)，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)無菌生長。如果陰性對(duì)照有菌生長，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。 平皿法 平皿法包括傾注法和涂布法。除另有規(guī)定外，取規(guī)定量供試品，按方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備和菌數(shù)測(cè)定，每稀釋級(jí)每種培養(yǎng)基

28、至少制備2個(gè)平皿。培養(yǎng)和計(jì)數(shù) 除另有規(guī)定外，胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板在3035培養(yǎng)3天，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板在2025培養(yǎng)5 天， 觀察菌落生長情況,點(diǎn)計(jì)平板上生長的所有菌落數(shù)，必要時(shí)可適當(dāng)延長培養(yǎng)時(shí)間至7 天進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并報(bào)告。菌落蔓延生長成片的平皿不宜計(jì)數(shù)。點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)后，計(jì)算各稀釋級(jí)供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報(bào)告規(guī)則報(bào)告菌數(shù)。若同稀釋級(jí)兩個(gè)平皿的菌落數(shù)平均值不小于15，則兩個(gè)平皿的菌落數(shù)不能相差1 倍或以上。 菌數(shù)報(bào)告規(guī)則 需氧菌總數(shù)測(cè)定宜選取平均菌落數(shù)小于 300cfu 的稀釋級(jí)、霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定宜選取平均菌落數(shù)小于100cfu 的稀釋級(jí)，作為菌數(shù)報(bào)告（取兩位有效數(shù)字）的依據(jù)。取

29、最高的平均菌落數(shù)，計(jì)算1g、1ml 或10cm2 供試品中所含的微生物數(shù)。 如各稀釋級(jí)的平皿均無菌落生長，或僅最低稀釋級(jí)的平板有菌落生長，但平均菌落數(shù)小于1 時(shí)，以1 乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。 薄膜過濾法 除另有規(guī)定外，按計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備。取相當(dāng)于1g、1ml 或10cm2 供試品的供試液，若供試品所含的菌數(shù)較多時(shí)，可取適宜稀釋級(jí)的供試液，照方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法加至適量稀釋液中，立即過濾，沖洗，沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)。 培養(yǎng)和計(jì)數(shù) 培養(yǎng)條件和計(jì)數(shù)方法同平皿計(jì)數(shù)法，每張濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過100cfu。

30、菌數(shù)報(bào)告規(guī)則 以相當(dāng)于 1g、1ml 或10cm2 供試品的菌落數(shù)報(bào)告菌數(shù)；若濾膜上無菌落生長，以1 報(bào)告菌數(shù)（每張濾膜過濾1g、1ml 或10cm2 供試品）,或1 乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。 MPN 法 取規(guī)定量供試品，按方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備和供試品接種，所有試驗(yàn)管在3035培養(yǎng)35 天，如果需要確認(rèn)是否有微生物生長，按方法適應(yīng)性試驗(yàn)確定的方法進(jìn)行。記錄每一稀釋級(jí)微生物生長的管數(shù)，從表3查對(duì)每1g 或1ml 供試品中需氧菌總數(shù)的最可能數(shù)。 4.1.9 結(jié)果判斷 需氧菌總數(shù)是指胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上生長的總菌落數(shù)（包括真菌菌落數(shù)）；霉菌和酵母菌總數(shù)是指沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)

31、基上生長的總菌落數(shù)（包括細(xì)菌菌落數(shù)）。若因沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的細(xì)菌使霉菌和酵母菌的計(jì)數(shù)結(jié)果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素（如氯霉素、慶大霉素）的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或其他選擇性培養(yǎng)基（如玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基）進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定。使用選擇性培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查。若采用MPN 法，測(cè)定結(jié)果為需氧菌總數(shù)。各品種項(xiàng)下規(guī)定的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)解釋如下： 101cfu： 可接受的最大菌數(shù)為20； 102cfu： 可接受的最大菌數(shù)為200； 103cfu： 可接受的最大菌數(shù)為2000：依此類推。 若供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的檢查結(jié)果均符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品符合規(guī)

32、定；若其中任何一項(xiàng)不符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品不符合規(guī)定。稀釋液、沖洗液及培養(yǎng)基見非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法（通則1106） 無菌檢查法系用于檢查藥典要求無菌的藥品、生物制品、醫(yī)療器具、原料、輔料、及其他品種是否無菌的一種方法。若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定,僅表明了供試品在該檢驗(yàn)條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。 4.1.10 稀釋液、沖洗液及培養(yǎng)基 見非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制及檢查法。 4.2 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制及檢查法 4.2.1 簡(jiǎn)述 控制菌檢查法系用于在規(guī)定的試驗(yàn)條件下，檢查供試品中是否存在特定的微生物。 當(dāng)本法用于檢查非無菌制劑及其原、輔料是否符合相應(yīng)的微生物

33、限度標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)按下列規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，包括樣品取樣量和結(jié)果判斷等。 本檢查法可采用替代的微生物檢查法，包括自動(dòng)檢測(cè)方法，但必須證明替代方法等效于藥典規(guī)定的檢查方法。 供試液制備及實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求同“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法”（通則1105）。 如果供試品具有抗菌活性，應(yīng)盡可能去除或中和。供試品檢查時(shí), 若使用了中和劑或滅活劑，應(yīng)確認(rèn)有效性及對(duì)微生物無毒性。 供試液制備時(shí)如果使用了表面活性劑，應(yīng)確認(rèn)其對(duì)微生物無毒性以及與所使用中和劑或滅活劑的相容性。 4.2.2 培養(yǎng)基適用性檢查和控制菌檢查方法適用性試驗(yàn) 供試品控制菌檢查中所使用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行適用性檢查。 供試品的控制菌檢查方法應(yīng)進(jìn)行方法

34、適用性試驗(yàn)，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的控制菌檢查。 若檢驗(yàn)程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，控制菌檢查方法應(yīng)重新進(jìn)行適用性試驗(yàn)。 4.2.3 菌種及菌液制備 菌種 試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)不得超過5 代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0 代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CMCC（B）26 003 銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CMCC（B）10 104 大腸埃希菌(Escherichia coli)CMCC（B）44 102 乙型副傷寒沙門菌(Salmonel

35、la paratyphi B)CMCC（B）50 094 白色念珠菌(Candida albicans)CMCC（F）98 001 生孢梭菌（Clostridium sporogenes）CMCC（B）64 941菌液制備 將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門菌分別接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中或在胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，3035培養(yǎng)1824 小時(shí)；將白色念珠菌接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上或沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，2025培養(yǎng)23 天；將生孢梭菌接種于梭菌增菌培養(yǎng)基中置厭氧條件下3035培養(yǎng)2448 小時(shí)或接種于硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中3035培養(yǎng)1824 小時(shí)。上述培養(yǎng)物用pH7.0

36、 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液。 菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2 小時(shí)內(nèi)使用；若保存在28，可在24 小時(shí)內(nèi)使用。生孢梭菌孢子懸液可替代新鮮的菌懸液，穩(wěn)定的孢子懸液可保存在28，在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)使用。 4.2.4 陰性對(duì)照 為確認(rèn)試驗(yàn)條件是否符合要求，應(yīng)進(jìn)行陰性對(duì)照試驗(yàn)，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)無菌生長。如陰性對(duì)照有菌生長，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。 4.2.5 培養(yǎng)基適用性檢查 控制菌檢查用的成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性檢查?？刂凭鷻z查用培養(yǎng)基的適用性檢查項(xiàng)目包括促生長能力、抑制能力及指示特性的檢查。各培養(yǎng)基的檢測(cè)項(xiàng)目及所用的菌株

37、見表1。 表1 控制菌檢查用培養(yǎng)基的促生長能力、抑制能力和指示特性控制菌檢查培養(yǎng)基特性試驗(yàn)菌株耐膽鹽 革蘭陰性菌腸道菌增菌液體培養(yǎng)基 促生長能力大腸埃希菌、銅綠假單胞菌抑制能力金黃色葡萄球菌紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 促生長能力+指示特性大腸埃希菌、銅綠假單胞菌 大腸埃希菌麥康凱液體培養(yǎng)基 促生長能力 大腸埃希菌抑制能力金黃色葡萄球菌麥康凱液體培養(yǎng)基 促生長能力+指示特性 大腸埃希菌沙門菌RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基促生長能力乙型副傷寒沙門菌四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基促生長能力乙型副傷寒沙門菌 抑制能力金黃

38、色葡萄球菌木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基 促生長能力+指示能力乙型副傷寒沙門菌三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基 指示能力乙型副傷寒沙門菌銅綠假單胞菌溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基促生長能力銅綠假單胞菌 抑制能力大腸埃希菌金黃色葡萄球菌甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基促生長能力+指示能力金黃色葡萄球菌抑制能力大腸埃希菌 梭菌 梭菌增菌培養(yǎng)基促生長能力生孢梭菌哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基 促生長能力 生孢梭菌白色念珠菌 沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基促生長能力白色念珠菌沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基促生長能力+指示能力白色念珠菌念珠菌顯色培養(yǎng)基促生長能力+指示能力白色念珠菌&

39、#160; 抑制能力大腸埃希菌 液體培養(yǎng)基促生長能力檢查 分別接種不大于100cfu 的試驗(yàn)菌（見表1）于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不長于規(guī)定的最短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)，與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗(yàn)菌應(yīng)生長良好。 固體培養(yǎng)基促生長能力檢查 用涂布法分別接種不大于100cfu 的試驗(yàn)菌（見表1）于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不長于規(guī)定的最短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)，被檢培養(yǎng)基與對(duì)照培養(yǎng)基上生長的菌落大小、形態(tài)特征應(yīng)一致。 培養(yǎng)基抑制能力檢查 接種不少于100cfu 的試驗(yàn)菌（見表1）于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)

40、定的培養(yǎng)溫度及不短于規(guī)定的最長培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)，試驗(yàn)菌應(yīng)不得生長。 培養(yǎng)基指示特性檢查 用涂布法分別接種不大于100cfu 的試驗(yàn)菌（見表1）于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不長于規(guī)定的最短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)，被檢培養(yǎng)基上試驗(yàn)菌生長的菌落大小、形態(tài)特征、指示劑反應(yīng)情況等應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基一致。 4.2.6 控制菌檢查方法適用性試驗(yàn) 供試液制備 按下列“供試品檢查”中的規(guī)定制備供試液。 試驗(yàn)菌 根據(jù)各品種項(xiàng)下微生物限度標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定檢查的控制菌選擇相應(yīng)試驗(yàn)菌株，確認(rèn)耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法時(shí),采用大腸埃希菌和銅綠假單胞菌為試驗(yàn)菌。 適用性試驗(yàn) 按控制菌檢查法取規(guī)定量供試液及不大

41、于100cfu 的試驗(yàn)菌接入規(guī)定的培養(yǎng)基中；采用薄膜過濾法時(shí),取規(guī)定量供試液,過濾,沖洗,試驗(yàn)菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中,過濾后,注入規(guī)定的培養(yǎng)基或取出濾膜接入規(guī)定的培養(yǎng)基中。依相應(yīng)的控制菌檢查方法，在規(guī)定的溫度及最短時(shí)間下培養(yǎng)，應(yīng)能檢出所加試驗(yàn)菌相應(yīng)的反應(yīng)特征。 結(jié)果判斷 上述試驗(yàn)若檢出試驗(yàn)菌，按此供試液制備法和控制菌檢查方法進(jìn)行供試品檢查；若未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)消除供試品的抑菌活性（見非無菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計(jì)數(shù)法中的“抗菌活性的去除或滅活”），并重新進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。 如果經(jīng)過試驗(yàn)確證供試品對(duì)試驗(yàn)菌的抗菌作用無法消除，可認(rèn)為受抑制的微生物不可能存在于該供試品中，選擇抑菌成份消除相對(duì)徹底的

42、方法進(jìn)行供試品的檢查。 4.2.7 供試品檢查 供試品的控制菌檢查應(yīng)按經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行。 陽性對(duì)照試驗(yàn) 陽性對(duì)照試驗(yàn)方法同供試品的控制菌檢查,對(duì)照菌的加量應(yīng)不大于100cfu。陽性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。 陰性對(duì)照試驗(yàn) 以稀釋劑代替供試液照相應(yīng)控制菌檢查法檢查，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)無菌生長。如果陰性對(duì)照有菌生長，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。 耐膽鹽革蘭陰性菌(Bile-Tolerant Gram-Negative Bacteria) 供試液制備和預(yù)培養(yǎng) 取供試品，用胰酪大豆胨液體作為稀釋劑照“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法” （通則1105）制成1：10 供試液，混勻，在2025培養(yǎng)，

43、培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)使供試品中的細(xì)菌充分恢復(fù)但不增殖（約2 小時(shí)）。 未檢出試驗(yàn) 另有規(guī)定外，取相當(dāng)于1g 或1mL 供試品的上述預(yù)培養(yǎng)物接種至腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，3035培養(yǎng)2448 小時(shí)后，劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035培養(yǎng)1824 小時(shí)。如果平板上無菌落生長，判供試品未檢出耐膽鹽革蘭陰性菌。 定量試驗(yàn) 選擇和分離培養(yǎng) 取相當(dāng)于0.1g、0.01g 和0.001g（或0.1mL、0.01mL 和0.001mL）供試品的預(yù)培養(yǎng)物或其稀釋液分別接種至腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，3035培養(yǎng)2448 小時(shí)。上述每一培養(yǎng)物分別劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035培養(yǎng)1824

44、 小時(shí)。 結(jié)果判斷 若紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，則對(duì)應(yīng)培養(yǎng)管為陽性，否則為陰性。根據(jù)各培養(yǎng)管檢查結(jié)果，從表2 查對(duì)1g 或1ml 供試品中含有耐膽鹽革蘭陰性菌的最大可能數(shù)。表2 耐膽鹽革蘭陰性菌的可能菌數(shù)各供試品量的檢查結(jié)果每1g(或1ml)供試品種可能的菌數(shù)cfu0.1g或0.1ml0.01或0.01ml0.001或0.001mlN103102N10310N102N10 注： 代表紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上有菌落生長；代表紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上無菌落生長。 若供試品量減少10 倍（如0.01g 或0.01ml，0.001g 或0.001ml，0.0001g 或0.0001ml

45、），則每1g(或1mL)供試品中可能的菌數(shù)（N）應(yīng)相應(yīng)增加10 倍。 大腸埃希菌(Escherichia coli) 供試液制備和增菌培養(yǎng) 取供試品，照“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法” （通則1105）制成1：10 供試液。取相當(dāng)于1g 或1mL 供試品的供試液，接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確定的）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，3035培養(yǎng)1824 小時(shí)。選擇和分離培養(yǎng) 取上述預(yù)培養(yǎng)物1mL 接種至100mL 麥康凱液體培養(yǎng)基中，4244培養(yǎng)2448 小時(shí)。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035培養(yǎng)1872 小時(shí)。 結(jié)果判斷 若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落

46、生長，應(yīng)進(jìn)行分離、純化及適宜的鑒定試驗(yàn), 確證是否為大腸埃希菌；若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。 沙門菌（Salmonella） 供試液制備和增菌培養(yǎng) 取10g 或10mL 供試品直接或處理后接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確定的）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，3035培養(yǎng)1824 小時(shí)。 選擇和分離培養(yǎng) 取上述預(yù)培養(yǎng)物0.1mL 接種至10mL RV 沙門增菌液體培養(yǎng)基中，3035培養(yǎng)1824 小時(shí)。取少量RV 沙門菌增菌液體培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035培養(yǎng)1848 小時(shí)。 沙門菌在木糖賴氨酸

47、脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上生長良好，菌落為淡紅色或無色、透明或半透明、中心有或無黑色。用接種針挑選疑似菌落于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進(jìn)行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng)1824 小時(shí)，或采用其它適宜方法進(jìn)一步鑒定。 結(jié)果判斷 若木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上有疑似菌落生長，且三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面為紅色、底層為黃色，或斜面黃色、底層黃色或黑色，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行適宜的鑒定試驗(yàn), 確證是否為沙門菌。如果平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性，或三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面未見紅色、底層未見黃色；或斜面黃色、底層未見黃色黑色，判供試品未檢出沙門菌。 銅綠假單胞菌（Pseudomonas aerug

48、inosa） 供試液制備和增菌培養(yǎng) 取供試品，照“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法” （通則1105）制成1：10 供試液。取相當(dāng)于1g 或1mL 供試品的供試液，接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確定的）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻。3035培養(yǎng)1824 小時(shí)。 選擇和分離培養(yǎng) 取上述預(yù)培養(yǎng)物劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035培養(yǎng)1872 小時(shí)。取上述平板上生長的菌落進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)，或采用其它適宜方法進(jìn)一步鑒定。 氧化酶試驗(yàn) 將潔凈濾紙片置于平皿內(nèi),用無菌玻棒取上述平板上生長的菌落涂于濾紙片上，滴加新配制的1二鹽酸二甲基對(duì)苯二胺試液，在30 秒內(nèi)若培養(yǎng)物呈粉紅色并逐

49、漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗(yàn)陽性,否則為陰性。 結(jié)果判斷 若溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，且氧化酶試驗(yàn)陽性，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行適宜的鑒定試驗(yàn), 確證是否為銅綠假單胞菌。如果平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性，或氧化酶試驗(yàn)陰性，判供試品未檢出銅綠假單胞菌。 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 供試液制備和增菌培養(yǎng) 取供試品，照“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法”（通則1105）制成1：10供試液。取相當(dāng)于1g或1mL供試品的供試液，接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確定的）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻。3035培養(yǎng)1824 小時(shí)。 選擇和分離

50、培養(yǎng) 取上述預(yù)培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035培養(yǎng)1872 小時(shí)。 結(jié)果判斷 若甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上有黃色菌落或外周有黃色環(huán)的白色菌落生長，應(yīng)進(jìn)行分離、純化及適宜的鑒定試驗(yàn), 確證是否為金黃色葡萄球菌；若平板上沒有與上述形態(tài)特征相符或疑似的菌落生長，或雖有相符或疑似的菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。 梭菌（Clostridia） 供試液制備和熱處理 取供試品，照“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法” （通則1105）制成1：10 供試液。取相當(dāng)于1g 或1mL 供試品的供試液2 份，其中1 份置80保溫10 分鐘后迅速冷卻。 選擇和分離

51、培養(yǎng) 將上述2 份供試液分別接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確定的）的梭菌增菌培養(yǎng)基中，置厭氧條件下3035培養(yǎng)48 小時(shí)。取上述每一培養(yǎng)物少量，分別涂抹接種于哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上，置厭氧條件下3035培養(yǎng)4872 小時(shí)。 過氧化氫酶試驗(yàn) 取上述平板上生長的菌落，置潔凈玻片上，滴加3%過氧化氫試液，若菌落表面有氣泡產(chǎn)生,為過氧化氫酶試驗(yàn)陽性,否則為陰性。 結(jié)果判斷 若哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上有帶或不帶芽孢的厭氧桿菌生長，且過氧化氫酶反應(yīng)陰性的，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行適宜的鑒定試驗(yàn), 確證是否為梭菌；如果哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上沒有厭氧桿菌生長，或雖有相符或疑似的菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性，或過氧化氫酶

52、反應(yīng)陽性，判供試品未檢出梭菌。 白色念珠菌（Candida albicans） 供試液制備和增菌培養(yǎng) 取供試品，照“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法” （通則1105）制成1：10 供試液。取相當(dāng)于1g 或1mL 供試品的供試液，接種到100mL 沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，混勻，3035培養(yǎng)35 天。選擇和分離 取上述預(yù)培養(yǎng)物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035培養(yǎng)2448 小時(shí)。 白色念珠菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的菌落呈乳白色，偶見淡黃色,表面光滑有濃酵母氣味,培養(yǎng)時(shí)間稍久則菌落增大，顏色變深、質(zhì)地變硬或有皺褶。挑取疑似菌落接種至念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)2448 小時(shí)

53、（必要時(shí)延長至72 小時(shí)），或采用其它適宜方法進(jìn)一步鑒定。 結(jié)果判斷 若沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上有疑似菌落生長，且疑似菌在念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上生長的菌落陽性反應(yīng)，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行適宜的鑒定試驗(yàn), 確證是否為白色念珠菌；若沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性，或疑似菌在念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上生長的菌落呈陰性反應(yīng)，判供試品未檢出白色念珠菌。 4.2.8 稀釋液 稀釋液配制后,應(yīng)采用驗(yàn)證合格的滅菌程序滅菌。 1. PH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 照無菌檢查法（通則1101)制備。 2. PH6.8 無菌磷酸鹽緩沖液、pH7.2 無菌磷酸鹽緩沖液 、pH7.6 無菌磷酸鹽緩沖液按緩沖液照緩沖液（通則8004）配制后,過濾,分裝,滅菌。如需要,可在上述稀釋液滅菌前或滅菌后加入表面活性劑或中和劑等。 3. 0.9%無菌氯化鈉溶液 取氯化鈉9.0g,加水溶解使成1000ml，過濾，分裝，滅菌。 4.2.8 培養(yǎng)基及其制備方法 培養(yǎng)基可按以下處方制備