植物抗病基因工程的基本原理與方法

1、編輯課件1 植物抗病基因工程是通過分子生物學(xué)技術(shù)獲得對(duì)植物病植物抗病基因工程是通過分子生物學(xué)技術(shù)獲得對(duì)植物病害（病毒、細(xì)菌、真菌、線蟲等病害）具有一定抗性的轉(zhuǎn)基害（病毒、細(xì)菌、真菌、線蟲等病害）具有一定抗性的轉(zhuǎn)基因植株。因植株。 1983年首例轉(zhuǎn)基因煙草問世。年首例轉(zhuǎn)基因煙草問世。 1994年首批轉(zhuǎn)基因作物如延熟西紅柿和抗除草劑棉花等獲得批準(zhǔn)年首批轉(zhuǎn)基因作物如延熟西紅柿和抗除草劑棉花等獲得批準(zhǔn)進(jìn)行商品化生產(chǎn)。目前，國內(nèi)外已報(bào)道的轉(zhuǎn)基因作物有進(jìn)行商品化生產(chǎn)。目前，國內(nèi)外已報(bào)道的轉(zhuǎn)基因作物有1 6種種70多個(gè)品系。多個(gè)品系。 自自1986年年3月以后，我國已研究的轉(zhuǎn)基因作物月以后，我國已研究的轉(zhuǎn)基

2、因作物47類，涉及的轉(zhuǎn)基因類，涉及的轉(zhuǎn)基因103種。正式公布的轉(zhuǎn)基因作物：棉花、大豆、西紅柿、青椒和矮牽牛。種。正式公布的轉(zhuǎn)基因作物：棉花、大豆、西紅柿、青椒和矮牽牛。 目前，已經(jīng)商品化的轉(zhuǎn)基因作物所轉(zhuǎn)入的外源基因主要是抗性基目前，已經(jīng)商品化的轉(zhuǎn)基因作物所轉(zhuǎn)入的外源基因主要是抗性基因，只有少數(shù)是改良作物品種性狀的。因，只有少數(shù)是改良作物品種性狀的。 編輯課件21.1 1.1 導(dǎo)入植物抗病相關(guān)基因和病原菌致病相關(guān)基因?qū)胫参锟共∠嚓P(guān)基因和病原菌致病相關(guān)基因在植物抗性基因的利用方面在植物抗性基因的利用方面 根據(jù)已有的根據(jù)已有的R基因結(jié)構(gòu)特征，設(shè)計(jì)新的基因結(jié)構(gòu)特征，設(shè)計(jì)新的R基因?；颉?異源表達(dá)異

3、源表達(dá)R基因?；?。 向同一株植物中導(dǎo)入多個(gè)向同一株植物中導(dǎo)入多個(gè)R基因?；?。在病原菌無毒基因的利用方面在病原菌無毒基因的利用方面 轉(zhuǎn)病原菌無毒基因。轉(zhuǎn)病原菌無毒基因。 將病原菌無毒基因和相應(yīng)的將病原菌無毒基因和相應(yīng)的R基因一起導(dǎo)入植物?；蛞黄饘?dǎo)入植物。 導(dǎo)入與植物抗病信號(hào)有關(guān)的基因。導(dǎo)入與植物抗病信號(hào)有關(guān)的基因。編輯課件31.2 1.2 導(dǎo)入植物防衛(wèi)基因?qū)胫参锓佬l(wèi)基因 Broglie(1991),et al. 在克隆菜豆幾丁質(zhì)基因的基礎(chǔ)上將在克隆菜豆幾丁質(zhì)基因的基礎(chǔ)上將CH5B基因修飾改造，通過基因修飾改造，通過Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化煙草，獲得幾丁質(zhì)酶質(zhì)粒轉(zhuǎn)化煙草，獲得幾丁質(zhì)酶高效表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植

4、株，具有協(xié)同拮抗枯萎病菌的效果。高效表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株，具有協(xié)同拮抗枯萎病菌的效果。 M.J.Carmona(1993),et al.，將來源于大麥基因組克隆的，將來源于大麥基因組克隆的硫素基因和來源于小麥硫素基因和來源于小麥cDNA克隆的硫素基因轉(zhuǎn)化到煙草中，克隆的硫素基因轉(zhuǎn)化到煙草中，獲得了對(duì)獲得了對(duì)P.s.pv.tabaci具有較高抗性的植株。具有較高抗性的植株。 美國孟山都（美國孟山都（Monsanto）公司將真菌編碼葡萄糖氧化）公司將真菌編碼葡萄糖氧化酶基因?qū)腭R鈴薯中，獲得了對(duì)酶基因?qū)腭R鈴薯中，獲得了對(duì)Ecc引起的細(xì)菌性軟腐病具引起的細(xì)菌性軟腐病具有良好抗性的植株。有良好抗性的植株

5、。編輯課件41.3 1.3 導(dǎo)入降解病原物致病因子基因?qū)虢到獠≡镏虏∫蜃踊?H. Anzai(1989),et al.分離到了抗煙毒素（分離到了抗煙毒素（tabtoxin）的基因的基因ttr，將基因，將基因ttr與與CaMV 35S啟動(dòng)子融合成嵌合基啟動(dòng)子融合成嵌合基因，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入煙草，獲得因，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入煙草，獲得ttr高表達(dá)高表達(dá)量的轉(zhuǎn)基因植株，對(duì)煙毒素和病原菌的侵染均表現(xiàn)出良量的轉(zhuǎn)基因植株，對(duì)煙毒素和病原菌的侵染均表現(xiàn)出良好的抗性。好的抗性。 菜豆毒素（菜豆毒素（phaseolotoxin）是一種非寄主?；远荆┦且环N非寄主?；远舅?，產(chǎn)菜豆毒素的素，

6、產(chǎn)菜豆毒素的P.s.pv.phaseolicola菌株通過菌株通過argK基因基因合成一種不被菜豆毒素抑制的合成一種不被菜豆毒素抑制的OCTaseR酶，從而對(duì)該毒酶，從而對(duì)該毒素不敏感。將素不敏感。將argK基因?qū)霟煵莺筒硕梗@得的轉(zhuǎn)基因基因?qū)霟煵莺筒硕?，獲得的轉(zhuǎn)基因煙草和菜豆對(duì)煙草和菜豆對(duì)P.s.pv.phaseolicola有較高的抗性。有較高的抗性。編輯課件51.4 1.4 導(dǎo)入其它蛋白基因?qū)肫渌鞍谆?賈士榮賈士榮,等等(1993)和和M.Hassan (1993),et al.向馬鈴薯向馬鈴薯導(dǎo)入導(dǎo)入cecropin基因后提高了馬鈴薯對(duì)青枯病的抗性?；蚝筇岣吡笋R鈴薯對(duì)青枯病

7、的抗性。 J.M.Jaynes(1993),et al.將將cecropinB基因?qū)霟煵莼驅(qū)霟煵莺螳@得的轉(zhuǎn)基因植株，提高了其對(duì)后獲得的轉(zhuǎn)基因植株，提高了其對(duì)R.solanacearum引起引起病害的抗性。病害的抗性。 黃大年黃大年,等等(1997)將將cecropinB和和cecropinD基因?qū)牖驅(qū)胨居着?，獲得的轉(zhuǎn)基因水稻植株可明顯地提高對(duì)水稻水稻幼胚，獲得的轉(zhuǎn)基因水稻植株可明顯地提高對(duì)水稻白葉枯病的抗性，同時(shí)也獲得了高抗水稻條斑病和水稻白葉枯病的抗性，同時(shí)也獲得了高抗水稻條斑病和水稻白葉枯病的高抗品系。白葉枯病的高抗品系。編輯課件6 至今已分離的供植物基因工程應(yīng)用的目的至今已

8、分離的供植物基因工程應(yīng)用的目的基因有基因有100多個(gè)，其中研究得比較多的是抗病毒、多個(gè)，其中研究得比較多的是抗病毒、細(xì)菌和真菌的基因，能殺死害蟲或使害蟲拒食的細(xì)菌和真菌的基因，能殺死害蟲或使害蟲拒食的基因，能抵抗各種除草劑的基因，能抗逆境如干基因，能抵抗各種除草劑的基因，能抗逆境如干旱、高寒、高溫鹽堿等的基因，能提高植物體中旱、高寒、高溫鹽堿等的基因，能提高植物體中蛋白質(zhì)含量或蛋白質(zhì)品質(zhì)的基因等等。這些基因蛋白質(zhì)含量或蛋白質(zhì)品質(zhì)的基因等等。這些基因中有些是來自植物本身，有些來自微生物，還有中有些是來自植物本身，有些來自微生物，還有少數(shù)是人工合成的。少數(shù)是人工合成的。編輯課件72.1 2.1 目

9、的基因的分離和鑒定目的基因的分離和鑒定 對(duì)已知序列進(jìn)行分子克隆對(duì)已知序列進(jìn)行分子克隆 從蛋白質(zhì)到基因序列從蛋白質(zhì)到基因序列PCR擴(kuò)增擴(kuò)增構(gòu)建構(gòu)建cDNA文庫文庫構(gòu)建基因組文庫構(gòu)建基因組文庫 與已知基因緊密連鎖基因的分離與已知基因緊密連鎖基因的分離編輯課件8 根據(jù)植株或細(xì)胞表型變異進(jìn)行基因分離根據(jù)植株或細(xì)胞表型變異進(jìn)行基因分離轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法圖位克隆法圖位克隆法基因挽救技術(shù)基因挽救技術(shù)基因組相減法基因組相減法cDNA差式顯示差式顯示轉(zhuǎn)座子導(dǎo)入細(xì)胞轉(zhuǎn)座子導(dǎo)入細(xì)胞目的形狀突變株目的形狀突變株構(gòu)建核構(gòu)建核DNA文庫文庫用轉(zhuǎn)座子序列作用轉(zhuǎn)座子序列作探針進(jìn)行雜交探針進(jìn)行雜交分析轉(zhuǎn)座子兩側(cè)序分析轉(zhuǎn)座

10、子兩側(cè)序列并以此作探針列并以此作探針野生型野生型細(xì)胞核細(xì)胞核DNA構(gòu)建構(gòu)建 核核DNA 文庫文庫完整的目的完整的目的性狀基因性狀基因轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法流程圖轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法流程圖編輯課件92.2 2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建表達(dá)載體的構(gòu)建 目的基因分離后，往往需要經(jīng)過修飾才能應(yīng)用于目的基因分離后，往往需要經(jīng)過修飾才能應(yīng)用于植物基因工程。構(gòu)建植物表達(dá)載體就是在目的基因的植物基因工程。構(gòu)建植物表達(dá)載體就是在目的基因的5端加上啟動(dòng)子，在基因的端加上啟動(dòng)子，在基因的3端加上中止子，以便使外源端加上中止子，以便使外源基因能在植物中有效地表達(dá)，充分發(fā)揮其功能?；蚰茉谥参镏杏行У乇磉_(dá)，充分發(fā)揮其功能。加入啟動(dòng)子區(qū)加入啟動(dòng)

11、子區(qū) 目前植物基因工程中外源基因常選用的啟動(dòng)子主要目前植物基因工程中外源基因常選用的啟動(dòng)子主要有有3類：第一類是從類：第一類是從Ti質(zhì)粒的質(zhì)粒的T-DNA序列上分離的啟動(dòng)序列上分離的啟動(dòng)區(qū)。具有真核生物轉(zhuǎn)基因起始所需的區(qū)。具有真核生物轉(zhuǎn)基因起始所需的TATA盒和盒和CAT盒；盒；第二類是第二類是CaMV的的35S和和19S啟動(dòng)子；第三類是從植物啟動(dòng)子；第三類是從植物本身分離出來的啟動(dòng)子。本身分離出來的啟動(dòng)子。編輯課件10加入轉(zhuǎn)錄的加尾序列加入轉(zhuǎn)錄的加尾序列 真核生物為保證一個(gè)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)完全末端需要有真核生物為保證一個(gè)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)完全末端需要有一個(gè)加尾序列。其功能一方面保證轉(zhuǎn)錄的終止；另一一個(gè)

12、加尾序列。其功能一方面保證轉(zhuǎn)錄的終止；另一方面保證形成有活性的方面保證形成有活性的mRNA鏈。植物基因工程中常鏈。植物基因工程中常用的加尾序列是用的加尾序列是AATAAA。插入內(nèi)含子插入內(nèi)含子 內(nèi)含子是真核生物基因組結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)之一。在基因內(nèi)含子是真核生物基因組結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)之一。在基因工程中，多數(shù)不用在目的基因中插入這種片段就能得到工程中，多數(shù)不用在目的基因中插入這種片段就能得到有效的表達(dá)，因此，認(rèn)為它是基因產(chǎn)物功能非必需的。有效的表達(dá)，因此，認(rèn)為它是基因產(chǎn)物功能非必需的。但是在實(shí)際操作中，如果在目的基因適當(dāng)?shù)奈恢貌迦脒@但是在實(shí)際操作中，如果在目的基因適當(dāng)?shù)奈恢貌迦脒@種序列，其表達(dá)量可以提高幾十到

13、幾百倍。因此，有人種序列，其表達(dá)量可以提高幾十到幾百倍。因此，有人推測(cè)，內(nèi)含子可能在基因翻譯中起增強(qiáng)子的作用。推測(cè)，內(nèi)含子可能在基因翻譯中起增強(qiáng)子的作用。編輯課件11加入翻譯起始密碼子加入翻譯起始密碼子 由于植物中由于植物中mRNA的翻譯起始密碼子多數(shù)也是的翻譯起始密碼子多數(shù)也是AUG，因此，要在目的基因功能蛋白的編碼序列前加上適當(dāng)?shù)囊虼?，要在目的基因功能蛋白的編碼序列前加上適當(dāng)?shù)暮塑账嵝蛄小：塑账嵝蛄?。加入終止密碼子加入終止密碼子 植物基因工程中所使用的植物基因工程中所使用的mRNA翻譯終止密碼子有翻譯終止密碼子有UAA、UAG、UGA三種。一般在目的基因功能蛋白的三種。一般在目的基因功能蛋

14、白的編碼序列后直接加上對(duì)應(yīng)的堿基序列。實(shí)驗(yàn)中通常采用編碼序列后直接加上對(duì)應(yīng)的堿基序列。實(shí)驗(yàn)中通常采用的是的是Ti質(zhì)粒中的質(zhì)粒中的Nos終止子。終止子。加入增強(qiáng)序列加入增強(qiáng)序列編輯課件12加入與植物中特定加入與植物中特定DNA同源的序列同源的序列 為了實(shí)現(xiàn)將目的基因和植物基因組有效整合，植物基因?yàn)榱藢?shí)現(xiàn)將目的基因和植物基因組有效整合，植物基因工程中常在目的基因兩端接上能和植物特定基因能整合的工程中常在目的基因兩端接上能和植物特定基因能整合的DNA序列，一方面可以提高外源基因的插入效率；另一方序列，一方面可以提高外源基因的插入效率；另一方面也可以結(jié)合植物基因組表達(dá)調(diào)控規(guī)律，通過調(diào)整所加同面也可以結(jié)

15、合植物基因組表達(dá)調(diào)控規(guī)律，通過調(diào)整所加同源序列的堿基序列有效地控制外源基因的插入位點(diǎn)和表達(dá)源序列的堿基序列有效地控制外源基因的插入位點(diǎn)和表達(dá)時(shí)間，使目的基因更便于操作以及整合后更好地發(fā)揮作用。時(shí)間，使目的基因更便于操作以及整合后更好地發(fā)揮作用。加入報(bào)道基因加入報(bào)道基因 常用的報(bào)道基因：常用的報(bào)道基因：lacZ、ocs、cat、npt、lux和和gus編輯課件132.3 2.3 目的基因向植物的轉(zhuǎn)化目的基因向植物的轉(zhuǎn)化 近年來，植物的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)得到了迅近年來，植物的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)得到了迅速的發(fā)展，已建立了多種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，如以農(nóng)桿速的發(fā)展，已建立了多種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，如以農(nóng)桿菌菌Ti質(zhì)粒及質(zhì)粒及Ri質(zhì)粒為

16、載體的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，以質(zhì)粒為載體的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，以PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)化學(xué)導(dǎo)入法、電激法、基因槍法、介導(dǎo)的原生質(zhì)化學(xué)導(dǎo)入法、電激法、基因槍法、花管導(dǎo)入法等等。總之，植物細(xì)胞遺傳轉(zhuǎn)化系花管導(dǎo)入法等等?？傊参锛?xì)胞遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)可分為兩大類：以載體為介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化統(tǒng)可分為兩大類：以載體為介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化（vector mediated gene transfer）和）和DNA直接直接轉(zhuǎn)化（轉(zhuǎn)化（naked DNA transfer）。）。 編輯課件142.4 2.4 轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的篩選及轉(zhuǎn)基因植物的鑒定轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的篩選及轉(zhuǎn)基因植物的鑒定 植物外植體經(jīng)過農(nóng)桿菌或植物外植體經(jīng)過農(nóng)桿菌或DNA直接轉(zhuǎn)化后，大部分直

17、接轉(zhuǎn)化后，大部分細(xì)胞是沒有轉(zhuǎn)化的，只有極少數(shù)是轉(zhuǎn)化的，這就需要采用細(xì)胞是沒有轉(zhuǎn)化的，只有極少數(shù)是轉(zhuǎn)化的，這就需要采用特定的的方式將未轉(zhuǎn)化細(xì)胞與轉(zhuǎn)化細(xì)胞區(qū)分開來，淘汰未特定的的方式將未轉(zhuǎn)化細(xì)胞與轉(zhuǎn)化細(xì)胞區(qū)分開來，淘汰未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，然后利用植物細(xì)胞的全能性在適宜的環(huán)境條轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，然后利用植物細(xì)胞的全能性在適宜的環(huán)境條件下使轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生成可育的轉(zhuǎn)基因植株。件下使轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生成可育的轉(zhuǎn)基因植株。 目前，轉(zhuǎn)化細(xì)胞與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的區(qū)分及非轉(zhuǎn)化細(xì)胞目前，轉(zhuǎn)化細(xì)胞與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的區(qū)分及非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的淘汰常采用抗菌素抗性基因及抗除草劑基因，總稱篩選的淘汰常采用抗菌素抗性基因及抗除草劑基因，總稱篩選標(biāo)記。植物基因工程中常用的篩選標(biāo)記是標(biāo)記。植物基因工程中常用的篩選標(biāo)記是npt（neomycin phosphotransferase）基因和）基因和cat（chloramphenicol acetyltr-ansferase ）基因）基因編輯課件15概概 況況 世界上已批準(zhǔn)世界上已批準(zhǔn) 進(jìn)行商品化轉(zhuǎn)基因進(jìn)行商品化轉(zhuǎn)基因作物：作物：大豆、玉米、棉花、大豆、玉米、棉花、 西