微生物檢測(cè)方法

1、-1992 、fda 細(xì)菌分析手冊(cè)需氧菌平板計(jì)數(shù)，或 15300 個(gè)（如iso 4833 : 1991 微生物學(xué)大腸桿菌菌落計(jì)數(shù)通用指南最大可能數(shù)技術(shù)）等。菌落計(jì)數(shù)前先觀測(cè)菌落生長(zhǎng)的情況，一般同一稀釋度的平板上的菌落數(shù)應(yīng)相近，不同稀釋度平板上的菌落數(shù)則應(yīng)與稀釋倍數(shù)成反比。蔓延菌落的生長(zhǎng)會(huì)抑制其他菌株的生長(zhǎng)，或者會(huì)覆蓋其他的小菌落， 所以最好不要選擇有蔓延菌落生長(zhǎng)的平板作為計(jì)數(shù)平板，但如必須選擇， 應(yīng)在記錄中標(biāo)記清楚。 如片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘2 以代表全皿菌落數(shù)。平皿內(nèi)如有鏈狀菌落生長(zhǎng)時(shí)（菌落之間無(wú)明顯界限），若只有一條鏈可視為一個(gè)菌落，如果

2、有不同來源的幾條鏈，則應(yīng)將每條鏈作為一個(gè)菌落計(jì)。當(dāng)每個(gè)稀釋度制備了兩塊平板時(shí)，用所選擇的平板的算術(shù)平均值來計(jì)算原始樣品中的微生物的含量。樣品的菌落數(shù)等于每克或每毫升的cfu 值除以稀釋度。報(bào)告方式：空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)：2.2 大腸菌群大腸菌群或稱總大腸菌群是指一群能在37條件下發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。符合這些條件的腸桿菌科細(xì)菌主要包括4 個(gè)菌屬：埃希氏菌屬，在此菌屬中與人類生活密切相關(guān)的僅有一個(gè)種，即大腸桿菌；其次有檸檬酸桿菌屬，其代表種有弗勞地枸櫞酸桿菌；克雷伯氏菌屬，代表種為肺炎克雷伯氏菌；腸桿菌屬，代表種有陰溝桿菌和產(chǎn)氣桿菌。大腸菌群衛(wèi)生學(xué)意義：大腸菌群主要來源

3、于人、畜糞便。 大腸菌群是反映食品中是否存在糞便污染的指示菌，食品中有糞便污染， 則可推測(cè)該食品中存在著腸道致病菌污染的可能性，潛伏著食物中毒和流行病的威脅，同時(shí)也反映出被測(cè)食品對(duì)人體健康存在危害。大腸菌群檢測(cè)已被廣泛應(yīng)用于食品衛(wèi)生工作中。檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)通常使用gb/t 4789.3-2003、sn 0168-92 檢驗(yàn)中需了解和注意事項(xiàng)：1. 挑選菌落在實(shí)際工作中， 為了提高大腸菌群的檢出率，應(yīng)當(dāng)熟悉大腸菌群的菌落色澤和形態(tài)。在 gb/t 4789.3-2003檢驗(yàn)方法中規(guī)定伊紅美藍(lán)平板為分離培養(yǎng)基，在該平板上， 大腸菌群菌落呈黑紫色有光澤或無(wú)光澤，檢出率為最高；紅色、粉色菌落檢出率較低。2.

4、發(fā)酵管的產(chǎn)氣量在日常工作中，有時(shí)在發(fā)酵倒管內(nèi)有極微小的氣泡（有時(shí)比小米粒還?。?，有時(shí)可遇到在初發(fā)酵時(shí)產(chǎn)酸未產(chǎn)氣，但在液面及管壁卻可以看到緩緩上浮的小氣泡。這種情況大腸菌群的陽(yáng)性檢出率能達(dá)到30%-50% 。所以不能忽視產(chǎn)氣量少的，對(duì)未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵管如有疑問時(shí)，可以用手輕輕打動(dòng)試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應(yīng)作進(jìn)一步試驗(yàn)。3. 抑菌劑大腸菌群檢驗(yàn)中常用的抑菌劑有膽鹽、十二烷基硫酸鈉、煌綠、龍膽紫、孔雀綠等。抑菌劑可抑制樣品中的些雜菌，特別是g+ 的生長(zhǎng)，而有利于大腸菌群的生長(zhǎng)和挑選。gb/t 4789.3-2003中乳糖膽鹽發(fā)酵管利用膽鹽作為抑菌劑，sn 0168-92中

5、 lst 肉湯利用十二烷基硫酸鈉（月桂基）作為抑菌劑，bglb 肉湯利用煌綠和膽鹽作為抑菌劑。2.3 金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌在自然界中無(wú)處不在，空氣、土壤、水、飼料、食品、灰塵及人和動(dòng)物的排泄物中都可以存在。因此， 食品受污染的機(jī)會(huì)很多，是引起食品污染和細(xì)菌性食物中毒的一種重要細(xì)菌。由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒已成為世界性的衛(wèi)生問題。一 . 生物學(xué)特性：1. g+ 、需氧或兼性厭氧，通常在肉浸液肉湯及肉浸液瓊脂或加入血液的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。2. 耐鹽性強(qiáng)。 10%-15% 的氯化鈉培養(yǎng)基中能生長(zhǎng)。3. 在血瓊脂上，幾乎所有的葡萄球菌可產(chǎn)生 、 、和 溶血素（一種或一種以上）。多數(shù)

6、致病菌株可產(chǎn)生透明溶血環(huán)，菌落呈金黃色，有時(shí)也為白色，大而突起、圓形、不透明、表面光滑，周圍有溶血圈。4. 葡萄球菌是無(wú)芽胞菌中抵抗力最強(qiáng)者，耐干燥可達(dá)數(shù)月，加熱 80 30min 才被殺死。5石炭酸，0.1% 升汞10 15 min 死亡。l : 100000 200000 龍膽紫溶液能抑制其生長(zhǎng)。對(duì)磺胺增效劑、青霉素、紅霉素等較敏感，但耐藥菌株逐年增多。葡萄球菌腸毒素具有耐熱性，加熱100 30min 不被破壞 . 要使其完全破壞需煮沸2h，這是葡萄球菌腸毒素的特點(diǎn)二 . 毒素和酶金黃色葡萄球菌的致病力決定于細(xì)菌產(chǎn)生的毒素和酶的能力。致病性菌株產(chǎn)生的毒素和酶主要有下列幾種：1血漿凝固酶：此

7、酶由金黃色葡萄球菌產(chǎn)生，能使含抗凝劑的人或兔血漿發(fā)生凝固。血漿凝固酶試驗(yàn)是鑒定金黃色葡萄球菌的重要標(biāo)志。2溶血毒素：多數(shù)致病性菌株均能產(chǎn)生，包括 、 、和溶血素，對(duì)人致病主要是 -溶血素。3殺白細(xì)胞素：能破壞人和家兔的中性粒細(xì)胞，抵抗吞噬細(xì)胞的吞噬。4. 腸毒素：分a 、b 、c 、d 、e 和 f 六個(gè)型別。耐熱，100 30min 不被破壞。金黃色葡萄球菌引起的食物中毒以a 型為多見，其次是b 、 c 型。5剝脫毒素：由噬菌體l 群中某些金黃色葡萄球菌菌株產(chǎn)生。對(duì)新生兒和免疫功能低下的成年人，可引起葡萄球菌燙傷樣皮膚綜合征。三 . 檢驗(yàn)方法及鑒定金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)方法主要有g(shù)b/t4789

8、.10-2003食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)和sn0172-1992出口食品中金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)方法。3 操作步驟3. 1 增菌培養(yǎng)法3. 1.1.! 檢樣處理 :按無(wú)菌操作取檢樣25 g(ml) ，加入 225 ml滅菌生理鹽水，固體樣品研磨或置均質(zhì)器中制成混懸液。3. 1.2 增菌及分離培養(yǎng):吸取 5 ml 上述混懸液，接種于7.5% 氯化鈉肉湯或胰酪胨大豆肉湯50 ml 培養(yǎng)基內(nèi)， 36士 1培養(yǎng) 24 h, 轉(zhuǎn)種血平板和baird-parker平板，36士 1培養(yǎng) 24 h ，挑取血平板上金黃色(有時(shí)為白色 )菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗(yàn)。3.1.3 形態(tài) : 本菌

9、為革蘭氏陽(yáng)性球菌，排列呈葡萄球狀，無(wú)芽胞，無(wú)莢膜，致病性葡萄球菌菌體較小，直徑約為0.5m -1m3. l. 4 在肉湯中呈混濁生長(zhǎng)，在胰酪脈大豆肉湯內(nèi)有時(shí)液體澄清，菌量多時(shí)呈混濁生長(zhǎng)，血平板上菌落呈金黃色，有時(shí)也為白色，大而突起、圓形、不透明、表面光滑，周圍有溶血圈。在bird-parker平板上為圓形、光滑凸起、濕潤(rùn)、直徑為2 mm- 3 mm ,顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的硬度，偶然會(huì)遇到非脂肪溶解的類似菌落;但無(wú)混濁帶及透明圈。長(zhǎng)期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。3.

10、1.5 血漿凝固酶試驗(yàn):吸取 1，4 新鮮兔血漿0. 5 ml ，放入小試管中，再加人培養(yǎng)24 h 的金黃色葡萄球菌肉浸液肉湯培養(yǎng)物o. 5 ml. ，振蕩搖勻，置36 士 1溫箱或水浴內(nèi)，每半小時(shí)觀察一次，觀察6 h, 如呈現(xiàn)凝固，即將試管傾斜或倒置時(shí)，呈現(xiàn)凝塊者，被認(rèn)為陽(yáng)性結(jié)果。同時(shí)以已知陽(yáng)性和陰性葡萄球菌株及肉湯作為對(duì)照。3.2 直接計(jì)數(shù)方法3.2.1 吸取上述1：10 混懸液，進(jìn)行10 倍遞次稀釋，根據(jù)樣品污染情況，選擇不同濃度稀釋液 1 ml ，分別加入三塊baird-parker平板，每個(gè)平板接種量分別為0. 3 ml,0. 3 mi.,0.4 ml，然后用滅菌l 棒涂布整個(gè)平板。

11、如水分多不易吸收，可將平板放在36 士 10c 1 h ，等水分蒸發(fā)后反轉(zhuǎn)平皿置36士 1培養(yǎng)。3.2.2 在三個(gè)平板上點(diǎn)數(shù)周圍有混濁帶的黑色菌落，并從中任選五個(gè)菌落，分別接種血平板，36士 1 0c 24 h培養(yǎng)后進(jìn)行染色鏡檢、血漿凝固酶試驗(yàn)，步驟同增菌培養(yǎng)法。3.2.3 菌落計(jì)數(shù) :將三個(gè)平板中疑似金黃色葡萄球菌黑色菌落數(shù)相加，乘以血漿凝固酶陽(yáng)性數(shù)，除以5，再乘以稀釋倍數(shù)，即可求出每克樣品中金黃色葡萄球菌數(shù)。四鑒定試驗(yàn)（ 1）血漿凝固酶試驗(yàn)：本試驗(yàn)是鑒定金黃色葡萄球菌致病性的重要試驗(yàn)血漿凝固酶通常以兔血漿為最好，避免使用檸檬酸抗凝的血漿，以 edta 抗凝兔血漿為最好。取肉湯培養(yǎng)物0.3

12、ml 同 0.5 ml凝固酶試驗(yàn)免血漿于8 mm x 100 mm試管內(nèi)充分混合，置36 士 1培養(yǎng)，定時(shí)觀察是否有凝塊形成，至少觀察6h 。以內(nèi)容物完全凝固，使試管倒置或傾斜時(shí)不流動(dòng)者為陽(yáng)性。試驗(yàn)中需同時(shí)做已知陽(yáng)性和陰性對(duì)照。sn0172-1992中明確規(guī)定對(duì)可疑結(jié)果，應(yīng)進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢和其他輔助試驗(yàn)如耐熱核酸酶試驗(yàn)等加以證實(shí)。( 2 ）觸酶試驗(yàn)：挑取菌落置于清潔玻片上，滴加3%h2o2 1 2 滴，1min 產(chǎn)生大量氣泡為陽(yáng)性。( 3 ）甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)：多數(shù)致病性葡萄球菌菌株發(fā)酵甘露醇。( 4 ）耐熱核酸酶試驗(yàn)：方法在 sn0172-1992中附錄 c。( 5 ) spa 的檢測(cè)：sp

13、a 能與免抗羊紅細(xì)胞血清中的igg 的 fc 段結(jié)合，使致敏羊紅細(xì)胞發(fā)生凝集，a 蛋白的存在是金黃色葡萄球菌的特征。( 6 ）新生霉素敏感試驗(yàn)：每片含5g ，抑菌環(huán)16mm 者為敏感， 16mm 者為耐藥。五腸毒素的測(cè)定方法在 gb/t4789.10-2003中。當(dāng)食品中檢出金黃色葡萄球菌時(shí)，表明食品加工處理衛(wèi)生條件較差，并不一定說明該食品導(dǎo)致了食物中毒。 但當(dāng)食品中未分離出金黃色葡萄球菌時(shí)，也不能證明食品中不存在葡萄球菌腸毒素。2.4 沙門氏菌沙門菌屬分類屬腸桿菌科，是腸桿菌科中最復(fù)雜的菌屬，是一種重要的腸道致病菌，可從人和世界各地所有動(dòng)物中分離得到，其致病性具有種系特異性，例如人是傷寒、副

14、傷寒a(chǎn) 、b 、c 沙門菌的天然宿主。有些專對(duì)動(dòng)物致病，也有些對(duì)人和動(dòng)物都能致病。沙門菌可致多種感染。1 生物學(xué)性狀形態(tài)染色革蘭陰性直桿菌，較細(xì)長(zhǎng)，多具有周鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)無(wú)鞭毛的突變型。無(wú)芽胞，無(wú)莢膜。1.1 培養(yǎng)特性兼性厭氧，最適生長(zhǎng)溫度35 一 37，最適生長(zhǎng)ph 6.8 一 7.8, 本菌屬對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求不高，在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上生長(zhǎng)的菌落為圓形、光滑、濕潤(rùn)、半透明、邊緣整齊的菌落，有時(shí)出現(xiàn)粗糙型的菌落。有些能產(chǎn)生硫化氫的菌株，在ss 瓊脂上形成中心黑色的菌落。在亞硫酸鉍瓊脂上，不同沙門氏菌可形成如下三種不同的菌落，在亞硫酸鉍瓊脂上，不同沙門氏菌可形成如下三種不同的菌落：深黑色菌落，

15、 大小為 2mm ，扁平的菌落， 并有向周圍擴(kuò)散的灰褐色暈環(huán)，如傷寒沙門氏菌往往形成這樣的菌落；灰黑色至灰褐色的菌落，大小為2mm 3mm ，圓形、光滑、濕潤(rùn)、突起，周圍有向外擴(kuò)散的灰褐色暈環(huán)，多數(shù)沙門氏菌屬于此類型；淺灰色菌落，一般較大，直徑為2mm 4mm ，突起黏液狀，有向周圍擴(kuò)散或無(wú)擴(kuò)散的灰色暈環(huán)。在 he 瓊脂上，沙門氏菌培養(yǎng)24h 后，可形成兩種不同的菌落。一類菌落大小為2mm 3mm ，綠色至藍(lán)綠色，中央有黑色沉淀物。另一類菌落大小為2mm ，綠色至藍(lán)綠色，無(wú)黑心。亞利桑那沙門氏菌，因?yàn)榘l(fā)酵乳糖，可形成橙黃色，帶有黑心的菌落，直徑為2mm 。在 xld 瓊脂（木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊

16、脂）上，沙門氏菌培養(yǎng)24h 后，大多數(shù)沙門氏菌形成淺粉色，大小為2mm ，光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊。而發(fā)酵乳糖的亞利桑那沙門氏菌形成帶有黑心的黃色菌落。在 dhl- 瓊脂（膽硫乳瓊脂）上，沙門氏菌培養(yǎng)24h 后，產(chǎn)生硫化氫的沙門氏菌可形成帶有黑心的菌落大小為2mm 3mm ，圓形、突起、濕潤(rùn)、邊緣整齊。不產(chǎn)生硫化氫的沙門氏菌，菌落中心無(wú)黑色沉淀物。亞利桑那沙門氏菌，因發(fā)酵乳糖和產(chǎn)生硫化氫，形成紅色帶黑心的菌落。1.2 生化反應(yīng)不發(fā)酵乳糖、蔗糖，對(duì)葡萄糖、麥芽糖和甘露醇發(fā)酵，除傷寒沙門氏菌不產(chǎn)氣外，其它沙門氏菌均產(chǎn)酸產(chǎn)氣。tsi 上典型的沙門氏菌培養(yǎng)物顯示斜面堿性（紅色）或不變色和底部酸性（黃色），

17、伴隨著產(chǎn)氣和（約90% 情況下）硫化氫產(chǎn)生（k/a + + ）；當(dāng)分離到乳糖陽(yáng)性的沙門氏菌時(shí)，tsi 的斜面是黃色的。因此，沙門氏菌培養(yǎng)物的初步確認(rèn)并不能僅僅根據(jù)tsi 瓊脂實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，還要再接種尿素瓊脂或賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基。尿素瓊脂如果反應(yīng)為陽(yáng)性，尿素分解釋放氨，其顏色由粉紅變成玫瑰紅，最后變成深櫻紅色。賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基陽(yáng)性反應(yīng)為紫色，陰性反應(yīng)為黃色。對(duì)初步反應(yīng)可疑為沙門氏菌屬的tsi 培養(yǎng)物進(jìn)行生化試驗(yàn)。生化結(jié)果符合沙門氏菌屬特性的進(jìn)行血清學(xué)試驗(yàn)。2.血清學(xué)特性2.1 抗原構(gòu)造本菌屬的抗原結(jié)構(gòu)主要有3 種，即菌體（o ）抗原、鞭毛（h ）抗原及表面抗原（vi 抗原等）。根據(jù)o 抗原、 h

18、 抗原雙相抗原及vi 抗原的不同，可將沙門氏菌分為近 3000 種血清型。( l ) o 抗原： 為多糖一類脂蛋白質(zhì)復(fù)合物，具耐熱性， 能耐受100 2.5 h 。o 抗原共有58 種，以阿拉伯?dāng)?shù)字順序排列，現(xiàn)已排至第67 （其中有9 種被刪除）。每個(gè)沙門菌的血清型可含一種或多種o 抗原。 凡含共同抗原成分的血清型歸為個(gè)群，每個(gè)群以0 加上阿拉伯?dāng)?shù)字及括號(hào)中大寫的26 個(gè)英文字母（a z）順序編排，則可將沙門氏菌屬分成az 、051 063 、o65 o67 42 個(gè)群，引起人類疾病的沙門氏菌大多數(shù)在ae 群。 0 抗原是分群的依據(jù)。其刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體以ig m 為主 ,與相應(yīng)的抗血清反應(yīng)時(shí)

19、呈顆粒狀凝集。( 2 ) h 抗原為不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)抗原，加熱或用乙醇處理均被破壞。有兩個(gè)相，第一相特異性較高稱特異相，用小寫英文字母a 、 b 、c 表示，沙門菌h 抗原直至z , z 以后z 加阿拉伯?dāng)?shù)字表示，如 21 、 22 、 23 265 。第二相抗原為沙門菌所共有，稱非特異，直接用1、2、3 表示。同時(shí)有第一相和第二相h 抗原的細(xì)菌稱雙相菌，僅有一相者用相稱單相菌。h 抗原是定型的依據(jù)。其刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體以igg 為主，與相應(yīng)的抗血清呈絮狀反應(yīng)。( 3 ）表面抗原：在沙門菌屬中已被證實(shí)的表面抗原有vi 抗原、m 抗原和s 抗原三種：l ) vi 抗原：是一種不耐熱的酸性多糖聚合物

20、，加熱6030 分鐘或經(jīng)石炭酸處理即被破壞，經(jīng)人工培養(yǎng)基傳代后也易喪失。新分離的傷寒及副傷寒丙沙門菌常帶有此抗原。vi 抗原位于菌體的最表層，有抗吞噬及保護(hù)細(xì)菌免受相應(yīng)抗體和補(bǔ)體的溶菌作用。vi 抗原存在時(shí)可阻止0 抗原與相應(yīng)抗體發(fā)生凝集，故在沙門菌血清學(xué)鑒定時(shí)應(yīng)加以注意，需事先加熱破壞vi 抗原之后，o 抗原才得以與相應(yīng)的o 抗血清發(fā)生凝集。帶vi 抗原的沙門菌亦可用vi 噬菌體進(jìn)行分型，有助于流行病學(xué)調(diào)查和追蹤傳染源。2 ) m 抗原：又稱粘液抗原。多種沙門菌均可產(chǎn)生m 抗原。m 抗原有免疫原性，但各菌種之間無(wú)特異性，不能用于血清學(xué)分型。m 抗原存在時(shí)亦可阻止o 抗原與相應(yīng)抗體發(fā)生凝集，同

21、樣可用加熱的方法加以破壞。3 ) s 抗原：過去認(rèn)為s 抗原是一種o 抗原，與o 抗原的區(qū)別是s 抗原可被lmol / l 的鹽酸所破壞，故與o 抗原不同，仍屬表面抗原。2.2 抗原變異沙門菌屬在一定條件下可發(fā)生變異，主要表現(xiàn)為：( 1 ) s 一 r 變異：自臨床標(biāo)本初次分離的菌株一般都是光滑型，經(jīng)人工培養(yǎng)、 傳代后可逐漸變成粗糙型菌落。此時(shí)菌體表面的特異多糖抗原喪失，在生理鹽水中可出現(xiàn)自凝。（ 2） h-o 變異：是指有鞭毛的沙門菌失去鞭毛的變異。( 3 ）位相變異：具有雙相h 抗原的沙門菌變成只有其中某一相h 抗原的單相菌，稱位相變異在沙門菌血清學(xué)分型時(shí)，如遇到單相菌，特別是只有第相（非

22、特異相）抗原時(shí)，需反復(fù)分離和誘導(dǎo)出第相（特異相）抗原方可作出鑒定。( 4 ) v-w變異：是指沙門菌失去vi 抗原的變異。初次分離得到的具有vi 抗原、 o 不凝集的沙門菌稱v 型菌；vi 抗原部分喪失，既可與o 抗血清發(fā)生凝集又可與vi 抗血清凝集者稱vw 型菌； vi 抗原完全喪失， 與 0 抗血清發(fā)生凝集而與vi 抗血清不凝集者稱w 型菌。 v-w 變異的過程是v 型菌經(jīng)人工培養(yǎng)，逐漸喪失部分vi 抗原而成為vw 型菌，進(jìn)而喪失全部vi抗原而成為w 型菌。3檢驗(yàn)方法：按照gb/t4789.4-2003 sn0170-1992進(jìn)行檢驗(yàn)。2.5 大腸埃希氏菌大腸桿菌是腸道的正常菌群。在一定條

23、件下可引起腸道外感染，一部分血清型的大腸桿菌致病性強(qiáng)， 引起腹瀉， 與人類疾病有關(guān)的大腸桿菌統(tǒng)稱為致瀉大腸桿菌。包括腸產(chǎn)毒素性大腸桿菌（etec ）、腸致病性大腸桿菌（epec ）、腸出血性大腸桿菌（ehec ）、腸侵襲性大腸桿菌（eiec ）、腸集聚性粘附大腸桿菌（eaggec ）。腸出血性大腸桿菌（ehec ）引起散發(fā)或暴發(fā)性出血性結(jié)腸炎，主要血清型是o157:h7 ，ehec o157:h7的一個(gè)顯著性特征是產(chǎn)生志賀樣毒素（ vero toxin,vt），是 ehec 的主要致病因子。ehec o157:h7不發(fā)酵或遲緩發(fā)酵山梨醇。在山梨醇麥康凱瓊脂平板上菌落呈無(wú)色半透明。絕大多數(shù)o15

24、7:h7 大腸桿菌不具有葡萄糖醛酸酶，不能水解4-甲基傘形酮 - -d 葡萄糖醛酸苷（mug ），不能產(chǎn)生熒光。腸產(chǎn)毒素性大腸桿菌（etec ）能產(chǎn)生不耐熱腸毒素（lt ）和耐熱腸毒素（ st）。衛(wèi)生學(xué)意義：檢出大腸桿菌，即意味著直接或間接地被糞便污染，衛(wèi)生學(xué)上被用于飲水、食品等的糞源性污染衛(wèi)生細(xì)菌學(xué)指標(biāo)；由于大腸桿菌在外界存活時(shí)間與一些腸道致病菌相近，它的檢出也可能預(yù)示著某些腸道致病菌（沙門菌、志賀氏菌）的存在，因此該菌是國(guó)際上公認(rèn)的衛(wèi)生監(jiān)測(cè)指示菌。251 形態(tài)與結(jié)構(gòu)革蘭陰性直短桿狀，多數(shù)有鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，某些菌株尤其是引起腸外感染的菌株有莢膜（微莢膜）和周身菌毛。252 培養(yǎng)和生化反應(yīng)兼性厭

25、氧，營(yíng)養(yǎng)要求不高，在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上生長(zhǎng)良好，形成較大的圓形、光滑、濕潤(rùn)、灰白色的菌落,在血瓊脂上某些菌株可產(chǎn)生 -溶血，在腸道選擇培養(yǎng)基上可發(fā)酵乳糖，形成有色菌落。大腸桿菌能發(fā)酵乳糖、葡萄糖等多種糖類產(chǎn)酸產(chǎn)氣，典型的大腸桿菌的吲哚、甲基紅、 v -p 、枸椽酸鹽（ i mvic ）的生化試驗(yàn)結(jié)果為+ + - - ，在三糖鐵瓊脂（tsi ）上斜面和底層均產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，h2 s 陰性（a/a + - ），不分解尿素。大腸桿菌一般不產(chǎn)生硫化氫，但近來發(fā)現(xiàn)產(chǎn)硫化氫的菌株，應(yīng)引起注意。大腸桿菌的血清學(xué)反應(yīng)，往往是對(duì)經(jīng)分離、鑒定、確證為大腸桿菌的進(jìn)一步分型。根據(jù) o 抗原、 h 抗原及 k 抗原的不同進(jìn)行大

26、腸桿菌血清學(xué)分型。表示大腸桿菌血清型的方式按 o；k；h 排列。檢驗(yàn)方法： gb/t4789.6-2003；sn0169-92 。志賀菌屬志賀菌屬與沙門菌屬一樣，是主要的腸道病原菌之一，是引起人類細(xì)菌性痢疾的病原體。在伯杰手冊(cè)（1984 ）中將志賀菌屬分為4 個(gè)血清群（種）: a 群為痢疾志賀菌, b 群為福氏志賀菌 , c 群為鮑氏志賀菌, d 群為宋內(nèi)志賀菌）而沿用至今。生物學(xué)性狀1 形態(tài)結(jié)構(gòu)和染色革蘭陰性桿菌，菌體短小，無(wú)芽胞，無(wú)莢膜，無(wú)鞭毛，有菌毛。2.培養(yǎng)和生化反應(yīng)發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，大多不發(fā)酵乳糖，僅宋內(nèi)氏菌遲緩發(fā)酵乳糖。不分解尿素，不產(chǎn)生h2s 。tsi ：(k/a - -)

27、2. 檢驗(yàn)方法 : 按照 gb/t4789.5-2003標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)。三 .生物安全基本知識(shí)3.1 生物安全柜的使用（ 1）生物安全柜必須在運(yùn)行正常時(shí)才能使用。（ 2） 生物安全柜在使用中不能打開玻璃觀察擋板。（ 3） 生物安全柜內(nèi)應(yīng)盡量少放置器材或樣品，不能影響后部壓力排風(fēng)系統(tǒng)的氣流循環(huán)。（ 4） 生物安全柜內(nèi)不能使用酒精燈，否則燃燒產(chǎn)生的熱量會(huì)干擾氣流并可能損壞過濾器。允許使用微型電加熱器，但最好使用一次性無(wú)菌接種環(huán)。（ 5） 所有工作必須在工作臺(tái)面的中后部進(jìn)行，并能夠通過玻璃觀察擋板看到。（ 6） 盡量減少操作者身后的人員流動(dòng)。（ 7） 操作者不應(yīng)反復(fù)移出和伸進(jìn)手臂以免干擾氣流。（ 8） 不

28、要使實(shí)驗(yàn)記錄本、移液管以及其他物品阻擋空氣格柵，因?yàn)檫@將干擾氣體流動(dòng)，引起物品的潛在污染和操作者的暴露。（ 9） 工作完成后以及每天下班前，應(yīng)使用適當(dāng)?shù)南緞?duì)生物安全柜的表面進(jìn)行擦拭。(10) 在生物安全柜內(nèi)的工作開始前和結(jié)束后，安全柜的風(fēng)機(jī)應(yīng)至少運(yùn)行15min 。(11) 在生物安全柜內(nèi)操作時(shí)，不能進(jìn)行文字工作。3.2 移液管和移液輔助器的使用1、應(yīng)使用移液輔助器，嚴(yán)禁用口吸取。2、所有移液管應(yīng)帶有棉塞以減少移液器具的污染。3、不能向含有感染性物質(zhì)的溶液中吹入氣體。4、感染性物質(zhì)不能使用移液管反復(fù)吹吸混合。5、不能將液體從移液管內(nèi)用力吹出。6、刻度對(duì)應(yīng)（ mark-to-mark）移液管不需要排出最后一滴液體，因此最好使用這種移液管。7、污染的移液管應(yīng)該完全浸泡在盛有適當(dāng)消毒液的防碎容器中。移液管應(yīng)當(dāng)在消毒劑中浸泡適當(dāng)時(shí)間后再進(jìn)行處理。8、盛放廢棄移液管的容器不能放在外面，應(yīng)當(dāng)放在生物安全柜內(nèi)。9、有固定皮下注射針頭的注射器不能夠用于移液。10、在打開隔膜封口的瓶子時(shí)，應(yīng)使用可以使用移液管的工具，而避免使用皮下注射針頭和注射器。11、為了避免感染性物質(zhì)從移液管中滴出