木聚糖酶檢測(cè)方法

1、木聚糖酶活力的測(cè)定分光光度法1 原理木聚糖酶能將底物木聚糖（本實(shí)驗(yàn)采用xylan from oat spelt，燕麥木聚糖，sigma no. :x0627 ）降解成寡糖和單糖，具有還原性末端的寡糖和有還原基團(tuán)的單糖在沸水浴條件下可以與dns 試劑發(fā)生顯色反應(yīng)。反應(yīng)液顏色的深淺與酶解產(chǎn)生的還原糖量成正比，而還原糖的生成量又與反應(yīng)液中木聚糖酶的活力成正比。因此，通過分光比色測(cè)定反應(yīng)液顏色的強(qiáng)度，可以計(jì)算待測(cè)木聚糖酶的活力。2 木聚糖酶活力單位（u）的定義在 40、 ph 值為 5.0 的條件下， 1.0 min 從濃度為 5 mg/ml 的木聚糖溶液中降解釋放1 mol 還原糖（以木糖表示）所需

2、要的酶量為一個(gè)酶活力單位（u） 。其中樣品的酶活力以u(píng) / g（固體酶）或u / ml （液體酶）表示。樺木木聚糖（xylan from birch wood ）山毛櫸木聚糖（xylan from beechwood ）3 主要儀器3.1 分光光度計(jì)3.2 精密電子天平精確至 0.0001 g。3.3 恒溫水浴鍋30-60可調(diào)，精度為0.1。3.4 酸度計(jì)精確至 0.01。3.5 秒表每小時(shí)誤差不超過5s。3.6 刻度試管（ 15ml ）帶玻璃塞， 10 支以上。3.7 移液管（ 0.5、 1、2、5、10ml）3.8 分樣篩孔徑為 0.25 mm（ 60 目） 。3.9 分析天平精確至 0.

3、001 g。3.10 磁力攪拌器附加熱功能。3.11 電磁振蕩器3.12 燒結(jié)玻璃過濾器孔徑為 0.45 m。3.13 離心機(jī)3000 r/min 3.14 冰箱4 試劑與溶液配制除特殊說明外，所用的試劑均為分析純，水均為符合gb/t6682 中規(guī)定的二級(jí)水。4.1 氫氧化鈉（ naoh ）溶液（濃度為200 g/l）稱取氫氧化鈉20.0g，加水溶解，定容至100ml。4.2 乙酸（ ch3cooh ）溶液（濃度為0.1 mol/l）吸取冰乙酸0.60ml，加水溶解，定容至100ml。4.3 乙酸鈉溶液（ch3coona ） （濃度為0.1 mol/l）稱取三水乙酸鈉1.36g，加水溶解，定容

4、至100ml 。4.4 乙酸 乙酸鈉（ch3cooh ch3coona ）緩沖溶液 （濃度為0.1 mol/l，ph 為 5.0）稱取三水乙酸鈉19.17 g，加入冰乙酸3.60 ml。再加水溶解，定容至2000 ml 。測(cè)定溶液的 ph 值。如果 ph 值偏離 5.0，再用乙酸溶液（4.2）或乙酸鈉溶液（4.3）調(diào)節(jié)至5.0。用精密 ph 試紙檢定。4.5 木糖（ c5h10o5）溶液（濃度為10.0 mg/ml ）稱取無水木糖1.000 g，加乙酸 乙酸鈉緩沖溶液（4.4）溶解，定容至100 ml。4.6 木聚糖溶液（濃度為10.0g/l）稱取木聚糖 （sigma x0627 ）1.00

5、g，加入 0.32g 氫氧化鈉， 再加入 90 ml 水，磁力攪拌，同時(shí)緩慢加熱，直至木聚糖完全溶解。然后停止加熱，繼續(xù)攪拌30 min，加入 0.8 ml 冰乙酸。繼續(xù)磁力攪拌，測(cè)定其ph 值。如果ph 值為 5.0，用乙酸 乙酸鈉緩沖溶液（4.4）定容至 100 ml。如果 ph 值偏離 5.0，再用乙酸溶液（4.2）或乙酸鈉溶液（ 4.3）調(diào)節(jié)至 5.0，然后再用乙酸 乙酸鈉緩沖溶液（4.4）定容至100 ml。木聚糖溶液能立即使用，使用前適當(dāng)搖勻。 4避光保存，有效期為3 天。4.7 dns 試劑稱取 3,5-二硝基水楊酸3.15 g（化學(xué)純），加水 500 ml，攪拌 5 s，水浴至

6、 45。然后逐步加入 100 ml 氫氧化鈉溶液（4.1） ，同時(shí)不斷攪拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氫氧化鈉過程中，溶液溫度不要超過48。 ） 。再逐步加入四水酒石酸鉀鈉91.0 g、苯酚 2.50 g和無水亞硫酸鈉2.50 g。繼續(xù) 45水浴加熱，同時(shí)補(bǔ)加水300 ml，不斷攪拌，直到加入的物質(zhì)完全溶解。停止加熱，冷卻至室溫后，用水定容至1000ml。用 燒結(jié)玻璃過濾器過濾。取濾液，儲(chǔ)存在棕色瓶 中，避光保存。室溫下存放7 天后可以使用，有效期為6 個(gè)月。4.8 乙酸 乙酸鈉 2號(hào)緩沖溶液量取 100ml 乙酸 乙酸鈉 1 號(hào)緩沖溶液， 加入 0.15gtriton x-100（曲拉通

7、100） ， 0.15g牛血清白蛋白（bsa ）混合均勻。如果ph 值偏離 5.0，再用乙酸溶液（4.2）或乙酸鈉溶液（4.3）調(diào)節(jié)至5.0。5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制吸取乙酸 乙酸鈉緩沖溶液（4.4）2.0 ml，加入 dns 試劑（ 4.7）3.0 ml ，沸水浴加熱 5 min。用自來水冷卻至室溫，用水定容至15.0 ml，制成標(biāo)準(zhǔn)空白樣。分別吸取木糖溶液（4.5）3.00、4.00、5.00、6.00 7.00 和 8.00ml，分別用緩沖溶液 （ 4.4）定容至 100 ml，配制成濃度為300、400、500、 600、700、800 g/ ml 木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取上述濃度系列的木糖標(biāo)

8、準(zhǔn)溶液各1.00 ml （做三個(gè)平行） ，分別加入到刻度試管中， 再分別加入1.0 ml 緩沖液（4.4）（終濃度分別為： 0,150， 200， 250， 300， 350 和 400 g/ml）和 3.0 ml dns 試劑（ 4.7） 。振蕩 3 s，沸水浴加熱5 min。然后用自來水冷卻到室溫，再用蒸餾水定容至15 ml。以標(biāo)準(zhǔn)空白樣為對(duì)照調(diào)零，在540 nm 處測(cè)定吸光度od 值。以木糖濃度為y 軸、吸光度od 值為 x 軸， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。每次新配制dns 試劑均需要重新表一：木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作數(shù)據(jù)記錄木糖系列濃度( g/ml) 150 200 250 300 350 400 用 e

9、xcel 線性回歸，得到回歸方程，用于后續(xù)酶活力的計(jì)算：y( g/ml)=aod540nm + b -（2）得：a= ；b= . 6 試樣溶液的制備固體樣品應(yīng)粉碎或充分碾碎，然后過60 目篩（孔徑為0.25 mm） ，稱取1.000g 樣品，精確至 0.001 g。加入 40 ml 乙酸 乙酸鈉緩沖溶液（4.4） 。高速磁力攪拌30 min ，再用緩沖溶液（ 4.4）定容至100 ml。上離心機(jī)（3.13）4000r 離心 3min，取上清液，再用緩沖溶液（ 4.4）做適當(dāng)稀釋（吸光度od540nm值應(yīng)控制在0.2-0.6 之間，否則需重新稀釋再做）。（注： 當(dāng)以麩皮或玉米芯份做載體的樣品時(shí)，

10、應(yīng)使用乙酸乙酸鈉2 號(hào)緩沖溶液（4.8 ）抽提，但應(yīng)使用乙酸乙酸鈉1 號(hào)緩沖溶液（ 4.4 ）稀釋。）液體樣品可以直接用乙酸 乙酸鈉緩沖溶液（4.4）進(jìn)行稀釋、定容（稀釋后吸光度在 0.2-0.6 之間）。如果稀釋后酶液的ph 值偏離 5.0，需要用乙酸溶液（4.2）或乙酸鈉溶液（4.3）調(diào)節(jié)校正至5.0，然后再用緩沖溶液（5.4）做適當(dāng)稀釋定容。7 測(cè)定步驟吸取 10.0 ml 木聚糖溶液（ 5.6） ，40 平衡 10 min。吸取 10.0 ml 經(jīng)過適當(dāng)稀釋的酶液，40平衡 10 min。酶空白樣制作：吸取 1.00 ml 經(jīng)過適當(dāng)稀釋的酶液（已經(jīng)過40平衡） ， 加入到刻度試管中，

11、再加入 3ml dns 試劑（ 4.7） ，電磁振蕩3 s。然后加入1.0 ml 木聚糖溶液（ 4.6） ，40反應(yīng) 20 min，沸od540nm1 號(hào)管2 號(hào)管3 號(hào)管平均水浴加熱5 min。用自來水冷卻至室溫，加水定容至15 ml，電磁振蕩3 s。以此作為反應(yīng)空白調(diào)零。酶反應(yīng)樣制作（需作3 個(gè)平行）：吸取 1.00 ml 經(jīng)過適當(dāng)稀釋的酶液（已經(jīng)過 40 平衡） ，加入到刻度試管中，再加入 1.0 ml 木聚糖 （ 4.6） （已經(jīng)過40平衡） ，電磁振蕩3 s，40精確保溫20 min。加入 3.0 ml dns試劑（ 4.7） ，電磁振蕩3 s，以終止酶解反應(yīng)。沸水浴加熱5 min，用自來水冷卻至室溫，加水定容至15 ml，電磁振蕩3 s。以酶空白樣為調(diào)零，在540 nm 處測(cè)定吸光度a。跟據(jù)回歸方程計(jì)算出還原糖量，即y 值。8 試樣酶活的計(jì)算y n 2 xd = -（2）20 150 xd 試樣稀釋液中木聚糖酶的活力，u/ml 或者 u/g；y 根據(jù)樣品吸光度od540nm，用回歸方程計(jì)算出的還原糖量（即 y 值） ， 單位為： g/ml；n 從固體樣品到測(cè)定前最終液的總稀釋倍數(shù)；2 酶促反應(yīng)體積為2.0 ml 。