微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)：生活污水（含藥廠廢水）的細(xì)菌學(xué)檢查（綜合性實(shí)驗(yàn)）

1、實(shí)驗(yàn)一生活污水(含藥廠廢水)的細(xì)菌學(xué)檢查(綜合性實(shí)驗(yàn))實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?. 學(xué)習(xí)水樣的采取方法和水樣中細(xì)茵總數(shù)測(cè)定的方法2 了解水源水的平板菌落計(jì)數(shù)的原則3. 了解pcr技術(shù)監(jiān)測(cè)污染水體大腸埃希菌的意義和基本原理4. 掌握pcr操作技術(shù)實(shí)驗(yàn)材料：1培養(yǎng)基牛肉膏蛋口ii東瓊脂培養(yǎng)基。2. 材料水樣3. 儀器及其他用具 恒溫培養(yǎng)箱、三角燒瓶，帶玻璃塞瓶，培養(yǎng)皿，移液器(iml),移液 管(iml),試管等，pcr儀，水浴鍋,培養(yǎng)箱，電泳儀，自動(dòng)微最移液器(各型號(hào))，濾膜, pcr管，離心管，whatman 3mm濾紙或相當(dāng)產(chǎn)品。4. 試劑及溶液 含有適當(dāng)抗菌素的lb培養(yǎng)基，taq dna聚合酶，正向引物

2、(20pmol/l) 及反向引物(20pmol/l)溶于水中，dna分了量標(biāo)準(zhǔn)，乙酸錢(10mol/l),無(wú)水乙醇，tsel(50mmol/ltris-hcl, ph8.o, 20%廉糖，50mmol/ledta, 1 pg/pl 溶菌腮)，ssk (50mmol/lnacl, 1%sds, 3mg/ml 蛋口酶 k),te 緩沖液,10x擴(kuò)增緩沖液(500mmol/lkcl, 100 mmol/ltris-hcl, 15mmol/l, mgcl2)o4種dntp貯存液(20mmol/l, ph8.(),瓊脂糖溶液(0.7%),電泳緩沖液(1xtae),澳 化乙錠染色液，6x凝膠上樣緩沖液。4

3、.儀器及其他用具實(shí)驗(yàn)原理：本實(shí)驗(yàn)采用平板菌落計(jì)數(shù)技術(shù)測(cè)定水中細(xì)菌總數(shù)。山于水中細(xì)菌種類繁多，它們對(duì)營(yíng)養(yǎng) 和其他生長(zhǎng)條件的要求差別很大，不可能找到一種培養(yǎng)基在一種條件下，使水中所有的細(xì)菌 均能生長(zhǎng)繁殖。因此，以一定的培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)出來(lái)的菌落計(jì)算得到的水中細(xì)菌總數(shù)僅是 一種近似值。目前-般是采用牛肉膏蛋白豚瓊脂培養(yǎng)基測(cè)定水屮細(xì)菌總數(shù)。大腸埃希菌(escherichia coll )是指示糞便污染的重要指示物。當(dāng)水體中出現(xiàn)人量的e. coli就說(shuō)明近期內(nèi)水體受到了糞便污染(因其脫離寄主后，其半存留期會(huì)大人縮短)。pcr 檢測(cè)這種微生物非常靈敏，即使每looml水中只有一個(gè)個(gè)體，也能被檢驗(yàn)出來(lái)。實(shí)驗(yàn)

4、內(nèi)容：(-)細(xì)菌總數(shù)測(cè)定自來(lái)水(1) 用滅菌移液管或移液器吸取iml水樣，注入滅菌培養(yǎng)hll'l'o(2) 分別傾注約15ml已融化并冷卻到45°c左右的牛肉膏蛋l(fā)1j東瓊脂培養(yǎng)基，并立即在 桌上作平而旋搖，使水樣與培養(yǎng)基充分混勻。(3) 另取一空的滅菌培養(yǎng)皿，傾注牛肉膏蛋白丿陳瓊脂培養(yǎng)基15nil,作空白對(duì)照。(4) 培養(yǎng)基凝固后，倒置于37°c溫箱中，培養(yǎng)24h,進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。兩個(gè)平板的平均菌 落數(shù)即為iml水樣的細(xì)菌總數(shù)。池水、河水或湖水等(1) 稀釋水樣：取3個(gè)滅菌空試管，分別加入9ml滅菌水。取iml水樣注入第一管9ml 滅菌水內(nèi)、搖勻，再自笫一管

5、取iml至下一管滅菌水內(nèi)，如此稀釋到笫三管，稀釋度 分別為10，io-'與10'稀釋倍數(shù)看水樣污染程度而定，以培養(yǎng)后平板的菌落數(shù)在 30-300個(gè)z間的稀釋度最為合適，若三個(gè)稀釋度的菌數(shù)均多到無(wú)法計(jì)數(shù)或少到無(wú)法計(jì) 數(shù)，則需繼續(xù)稀釋或減小稀釋倍數(shù)。一般中等污染水樣，取10，10巴10-3三個(gè)連續(xù)稀 釋度，污染嚴(yán)重的取103 10-3, 1()4三個(gè)連續(xù)稀釋度。(2) 自授后三個(gè)稀釋度的試管中各取iml稀釋水加入空的滅菌培養(yǎng)皿中。每一稀釋度做 兩個(gè)培養(yǎng)血。(3) 各傾注15ml己融化并冷卻至50°c左右的牛肉膏蛋口月東瓊脂培養(yǎng)基，立即放在桌上 搖勻。(4) 凝固后倒置于3

6、7°c培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h.o菌落計(jì)數(shù)方法先計(jì)算相同稀釋度的平均菌落數(shù)。若其中一個(gè)平板有較大片狀菌苔生長(zhǎng)時(shí)，則不應(yīng)采用, 而應(yīng)以無(wú)片狀菌苔生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的平均菌落數(shù)。(2) 選擇平均菌落數(shù)在303()0之間的，當(dāng)只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍吋，則 以該平均菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)即為該水樣的細(xì)菌總數(shù)。(3) 若冇兩個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)均在30300 z間，則按兩者菌落總數(shù)z比值來(lái)決定。若 其比值小于2,應(yīng)采取兩者的平均數(shù)；若人于2,則取其中較小的菌落總數(shù)。(4) 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均人于300,則應(yīng)按稀禪度最髙的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍(5) 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于

7、30,則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在3()3()()之間，則以”近30()或3()的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。(-)應(yīng)用pcr技術(shù)監(jiān)測(cè)污染水體大腸埃希菌1. 水樣的處理及模板dna的制備(1)取水樣iml,低速(2 ()0() r/min )離心5min,以除去不溶性雜質(zhì)。取出上清，經(jīng)6 000 r/niin 離心5min,收集菌體。 將菌體懸于100 pltsel溶液中，置37°c水浴作用30 mine 向反應(yīng)混合物屮加入300wssk溶液，置37°c繼續(xù)作rj 60 min0 向反應(yīng)混合物中加入2倍體積的無(wú)水乙醇，搖勻后置-20

8、°c,2h. 12 000 r/min 心15 min, 收集沉淀，室溫晾干后將沉淀物溶于100-30011無(wú)菌去離子水或te緩沖液中備用。如果是純培養(yǎng)的菌落，即將菌落挑入100pl無(wú)菌去離了水中，加熱煮沸l(wèi)min,即可作為 pcr模板。2. 引物設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)的引物來(lái)自e. coli的加z和cim b基因。lac z 引物 1： zl-1675 (5'atgaaagctggctacaggaaggcc3)引物 2： zr-2025 (5,-ggtttatgcagcaacgagacgtca-3*)lam b 引物 1： bl-4910(5,-ctgatcgaatggctgccaggctcc-3,)引物 2： br-5219 (5*-caaccagacgatagttatcacgca-3*)3. pcr擴(kuò)增體系按以下次序，將各成分加在().5mlpcr薄壁管內(nèi)混合:10x擴(kuò)增緩沖液5卩120mmol/l4 種 dntp 混合液(ph&o) 1川20|imol/l ie向引物 2.5|il20|imol/l 反向引物 2.5|11模板 dna5l()pltaq dna聚合酶12單位補(bǔ)足h2o至總體積50)114. pcr循環(huán)按以下方法進(jìn)行pcr擴(kuò)增，典型的程序有變性、復(fù)性和聚合(延伸反