Roche LightCycler 480 中文操作說明

1、LightCycler 480 中文操作說明LightCycler® 480 中文操作說明 羅氏醫(yī)學(xué)儀器公司 / 應(yīng)用科學(xué)部門February 2008 目錄 一. 啟動(dòng)機(jī)器與軟件3二. 軟件設(shè)定 - 開啟新實(shí)驗(yàn)5三. 樣品編輯9四. 結(jié)果分析12五. 報(bào)告18六. 數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移至其它計(jì)算機(jī)(數(shù)據(jù)輸出與輸入)19七. 使用者管理19一 啟動(dòng)機(jī)器與軟件· 啟動(dòng)機(jī)器1. 機(jī)器主開關(guān)位于機(jī)器右后方。 2. 機(jī)器正面兩個(gè)警示燈代表機(jī)器狀態(tài)。待警示燈 (右) 由閃爍橘色燈轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定橘色燈，警示燈 (左) 由橘色轉(zhuǎn)變成綠色 (約三分半鐘)，表示機(jī)器已經(jīng)啟動(dòng)完成。左警示燈右警示燈機(jī)器狀態(tài)橘

2、*閃爍*橘 *閃爍*正在初始化綠橘機(jī)器啟動(dòng)完成96/384孔盤還未放入綠橘 *閃爍*96/384 孔盤正在放入中綠綠機(jī)器啟動(dòng)完成96/384 孔盤已經(jīng)放入綠 *閃爍*綠 *閃爍*實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中3. 按壓機(jī)器正面上唯一的按鈕，放入已經(jīng)封膜完成之 96 或 384 孔盤。放置完成后，左右兩警示燈都呈現(xiàn)綠色。 · 啟動(dòng)軟件1. 開啟計(jì)算機(jī)，并以正確的使用者名稱與密碼登入 Windows。User name: OPERATORPassword: LC4802. 開啟 LightCycler 480 軟件，并輸入正確的使用者與密碼。 二軟件設(shè)定- 開啟新實(shí)驗(yàn)· 設(shè)定新實(shí)驗(yàn)1. 軟件開啟后

3、，會(huì)進(jìn)入主畫面。點(diǎn)選 “New Experiment”。2. 出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)設(shè)定窗口。任何時(shí)候需要回主畫面的話，點(diǎn)選畫面右邊的按鈕。· 設(shè)定實(shí)驗(yàn)v 若要套用設(shè)定好的實(shí)驗(yàn)步驟 (Template)，請(qǐng)?zhí)?6.。1. 在實(shí)驗(yàn)設(shè)定畫面上方，先選擇適當(dāng)?shù)?Detection Format。選項(xiàng)包含: 另外可再點(diǎn)選 “Customize” 勾選所需的濾片組合。2. 輸入反應(yīng)體積: 96 well plate 范圍為 10-100 ul，而 384 well plate 范圍為 5-20 ul。3. 設(shè)定實(shí)驗(yàn)步驟 (Program)· 設(shè)定 program，包含有 Pre-incubati

4、on, Amplification (PCR), Melting curve (optional) 與 Cooling。利用 +與 增加或刪除步驟。· 設(shè)定循環(huán)數(shù)目 (Cycle) 與分析模式。通常 Amplification (PCR) program設(shè)定成 Quantification，而 Melting Curve program 設(shè)定成Melting Curve。4. 設(shè)定詳細(xì)溫度變化 (依照不同實(shí)驗(yàn)方法與設(shè)計(jì)而有所不同)· 點(diǎn)選各個(gè) program 即可設(shè)定詳細(xì)溫度變化步驟，請(qǐng)根據(jù)產(chǎn)品說明書來設(shè)定，利用 +與 增加或刪除步驟。需要設(shè)定的參數(shù)包含 Target ()

5、 目標(biāo)溫度，Acquisition Mode (熒光偵測(cè)模式)，Hold (hh:mm:ss) 停留時(shí)間。Ramp Rate (/s) 為升降溫速度，范圍如下：Ramp Rate (/s)Heating upCooling down96-well Block1.0 4.4 /s1.0 2.2 /s384-well Block1.0 4.8 /s1.0 2.5 /sv 若設(shè)定溫度低于 50，請(qǐng)把 Ramp Rate 調(diào)整成 1.5/s (96 well) 或 2.0/s (384 well)。5. 將實(shí)驗(yàn)步驟儲(chǔ)存成 Template以便下次進(jìn)行套用。點(diǎn)選左下角 “Save As Template

6、” 即可把此步驟儲(chǔ)存起來。6. 若要進(jìn)行套用時(shí)，請(qǐng)直接點(diǎn)選窗口左下角 “Apply Template” ，選擇欲套用之實(shí)驗(yàn)步驟即可。7. 設(shè)定完成后點(diǎn)選 “Start Run” 開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。8. 跳出檔案儲(chǔ)存窗口，請(qǐng)輸入欲儲(chǔ)存之文件名稱。v 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中會(huì)進(jìn)入另一個(gè) Data窗口，窗口下方按鍵功能如下：ü End Program : 結(jié)束此 Program, 進(jìn)入下一個(gè) Program。ü + 10 Cycles : 實(shí)時(shí)增加循環(huán)數(shù)目。ü Abort Run: 馬上結(jié)束此實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)注意，若按此鍵，則此次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果將不儲(chǔ)存。三樣品編輯· 將樣品分群1. 點(diǎn)選

7、窗口左邊的 “Subset Editor”。2. 點(diǎn)選 “New” 新增新的群組，并將其命名。3. 利用鼠標(biāo)選取此群組之樣品位置，點(diǎn)選窗口右下角 “Apply” ，此時(shí)被選取的樣品位置會(huì)呈現(xiàn)實(shí)心的藍(lán)色，如下圖。 4. 以此方式依序?qū)⑺袠悠啡航M編輯完畢。v 樣品必須分群才能夠獨(dú)立分析，但是樣品是否分群并不影響樣品的 Cp 值。· 編輯樣品名稱1. 點(diǎn)選窗口左邊的 “Sample Editor”。2. 輸入每個(gè)位置之樣品名稱 (Name)與重復(fù) (Repl. Of)。3. 若要更快速輸入，可直接在左邊的圖上點(diǎn)選欲編輯之樣品：v 若 A1, A2 與 A3 為三重復(fù)，在A2 與 A3 R

8、epl. Of 字段上都填上A1 即為三重復(fù)。v 在編輯過程中，可利用Ctrl+C復(fù)制文字，Ctrl+V貼上文字。4. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)分析模式，編輯 Abs Quant (絕對(duì)定量)，Rel Quant (相對(duì)定量)，或 Genotyping 分頁(yè)，設(shè)定 Sample Type。20絕對(duì)定量 (Abs Quant)： Unknown:未知濃度樣品Standard: 已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)定量 (Rel Quant)：Target: 目標(biāo)基因Reference: 參考基因Calibrator: Control 樣品Standard: 已知濃度的樣品Unknown:未知濃度樣品v 其它分析模式之分頁(yè)在此不贅

9、述，請(qǐng)自行參考 LightCycler 480 Instrument Operators Manual。5. 若設(shè)定成 Standard之樣品請(qǐng)輸入濃度。6. 若想要將此樣品編輯儲(chǔ)存成 Template，可點(diǎn)選窗口左下角 “Save As Template” 即可，下次實(shí)驗(yàn)時(shí)可點(diǎn)選 “Apply Template” 進(jìn)行套用。四結(jié)果分析· 點(diǎn)選左邊的 “Analysis”，選取分析模式，并選擇所需分析之群組，如下圖：3.2.1.分析模式說明Abs Quant / 2nd Derivative Max絕對(duì)定量 (自動(dòng)法)Abs Quant / Fit Points絕對(duì)定量 (手動(dòng)法)C

10、olor Compensation色差校正 (多色實(shí)驗(yàn)校正用)Gene Scanning基因掃描 (適用于High Resolution Melting Curve, HRM 分析)Genotyping基因分型 (適用于 HybProbe 之基因分型實(shí)驗(yàn))Relative Quantification相對(duì)定量Tm CallingTm 分析· 絕對(duì)定量 (Absolute Quantification)1. 點(diǎn)選下方的 “Calculate” 即可得到樣品之 Cp 與標(biāo)準(zhǔn)曲線。各個(gè)樣品之 Cp 值與濃度重複樣品平均後之Cp值與濃度, 並自動(dòng)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差2. 數(shù)值之?dāng)?shù)據(jù)輸出: 在數(shù)值分析表

11、上按鼠標(biāo)右鍵，點(diǎn)選 “Export” 即可輸出成 .txt 檔案格式。可直接以 Microsoft Excel 軟件開啟。3. 圖形輸出: 在圖形上按鼠標(biāo)右鍵，點(diǎn)選 “Export” 即可輸出成各種圖形檔案格式。4. 標(biāo)準(zhǔn)曲線儲(chǔ)存: 點(diǎn)選窗口下方 Std Curve之 “Save as external” ，輸入適合檔名后即可儲(chǔ)存在數(shù)據(jù)庫(kù)中。· 相對(duì)定量 (Relative Quantification)1. 在選擇相對(duì)定量分析后，出現(xiàn)下面窗口： v Reference Sample Location: 若 Reference (Housekeeping gene) 之樣品在同一盤上

12、請(qǐng)選擇 “In-Run”，否則請(qǐng)選擇 “External” 可輸入另一次實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)一起分析。v 建議將 Auto Pair 打勾讓計(jì)算機(jī)自動(dòng)將樣品配對(duì)。2. 進(jìn)入 Target與 Reference分頁(yè)，右下角顯示 “Eff = 2” 表示將目標(biāo)基因與參考基因的 PCR 效率以 2.0 來計(jì)算。 3. 若需要校正目標(biāo)基因與參考基因之 PCR 效率，則需要輸入標(biāo)準(zhǔn)曲線。在Target與 Reference分頁(yè)之右下角，輸入 (import) 標(biāo)準(zhǔn)曲線。 v Use in run：輸入 (import) 同一盤上之標(biāo)準(zhǔn)曲線。v Use external：輸入 (import) 之前已儲(chǔ)存于數(shù)據(jù)庫(kù)中

13、之標(biāo)準(zhǔn)曲線。4. 點(diǎn)選 Pairing分頁(yè)，檢查計(jì)算機(jī)自動(dòng)配對(duì)結(jié)果是否正確。其中，紅色表示 Unknown樣品，綠色表示 Calibrator 樣品。若欲外加配對(duì)，則可直接以鼠標(biāo)點(diǎn)選樣品后按 “Add” 即可增加配對(duì)。5. 點(diǎn)選 Results分頁(yè)，點(diǎn)選 “Calculate” 即可得到計(jì)算結(jié)果。 6. 數(shù)值和圖形輸出與絕對(duì)定量相同。(請(qǐng)參考絕對(duì)定量)· 基因分型 (Genotyping)1. 進(jìn)入基因分型的窗口中。 2. 窗口右下角可設(shè)定分類方式v Auto Group：自動(dòng)分組v In-run：標(biāo)準(zhǔn)品包含在本次實(shí)驗(yàn)中v External：標(biāo)準(zhǔn)品在之前已儲(chǔ)存之實(shí)驗(yàn)中3. 點(diǎn)選 “Calculate” 即可得到分型結(jié)果。· Tm 分析 (Tm Calling)1. 進(jìn)入 Tm 分析窗口 2. 確認(rèn)波峰數(shù)目3. 選擇檢測(cè)模式4. 點(diǎn)選 “Calculate即可得到每個(gè)樣品之 Tm 值。五報(bào)告 (Report)1. 將分析后結(jié)果儲(chǔ)存后即可點(diǎn)選報(bào)告鍵。 數(shù)據(jù)儲(chǔ)存報(bào)告2. 勾選想要呈現(xiàn)的報(bào)告內(nèi)容。3. 點(diǎn)選 “Generate” 即可產(chǎn)生報(bào)告。4. 點(diǎn)選 “PDF” 即可將此報(bào)告儲(chǔ)存成 .pdf 檔案格式。 六數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移至其它計(jì)算機(jī) (數(shù)據(jù)輸出與輸入)· 數(shù)據(jù)輸出1. 點(diǎn)選 (navigator)2. 點(diǎn)選所要輸出的實(shí)驗(yàn)檔案，點(diǎn)選 即可將