RecQ解旋酶分子特性的研究

1、recq解旋酶分子特性的研究【摘要】：waston和crick提出dna雙螺旋結(jié)構(gòu)后，不僅引導(dǎo)人們發(fā) 現(xiàn)了 dna聚合酶，它作用于dna以一條鏈為模板聚合形成一條新的 dna鏈;而且也讓科學(xué)家們尋找到一種酶能夠在dna復(fù)制時破壞互 補堿基對的氫鍵結(jié)構(gòu)而打開dna雙螺旋結(jié)構(gòu)。隨后，相似功能的酶在 rna復(fù)制屮也被發(fā)現(xiàn)。這類酶被科學(xué)家稱為解旋酶。解旋酶是一類 能解開核昔酸雙鏈的酶,它廣泛存在于從病毒到人類等多種生物體 中。自1976年人類在大腸桿菌(esherichiacolie.coli)中發(fā)現(xiàn)了第一個 解旋酶，至今已有上百種解旋酶被發(fā)現(xiàn)，而且這一酶家族成員還在不斷 擴大。解旋酶廣泛存在于多種生

2、物體中,有些生物還同時具有多種不 同類型的解旋酶。盡管解旋酶種類繁多，人們在研究過程屮發(fā)現(xiàn)，這類 蛋白酶在其氨基酸序列上有一定的同源性和相似性。分析表明，這些 同源序列在進(jìn)化過程中構(gòu)成了兒個高度保守的區(qū)域，這些區(qū)域執(zhí)行不 同的酶功能。人們根據(jù)酶的二維結(jié)構(gòu)和一級序列，把解旋酶分為幾大 家族來分類研究。經(jīng)過多年的研究，人們發(fā)現(xiàn)解旋酶具有多種功能，在 細(xì)胞內(nèi)它們參與dna復(fù)制、修復(fù)、轉(zhuǎn)錄重組以及rna接拼、核糖 體組裝、蛋白質(zhì)翻譯，端粒穩(wěn)定。最近，還發(fā)現(xiàn)個別解旋酶甚至參與機 體天然免疫反應(yīng)機制。解旋酶已不僅僅只是分開核酸雙鏈結(jié)構(gòu)的一類 酶，它的生物功能遠(yuǎn)不止此。解旋酶第二大家族中的recq解旋酶亞家

3、 族在核酸代謝過程中起了關(guān)鍵的作用,這一家族參與dna復(fù)制、dna 修復(fù)、重組、轉(zhuǎn)錄甚至端粒穩(wěn)定機制。人們發(fā)現(xiàn)在人體中存在recq1、個易找衣冉-a% 厲 www.yit_ 論文發(fā)表專家blm、wrn、recq4和recq5這五種recq解旋酶家族成員。其 中,blm、wrn、recq4編碼基因缺陷會導(dǎo)致人類相應(yīng)的疾病發(fā)生, 它們分別為bloom 綜合癥（bs）、werner綜合癥（ws）、 rothmund-thomson 綜合癥（rts）、rapadilino 綜合癥和 baller-gerold綜合癥。這些疾病雖然在人類中都是極其罕見的隱形遺 傳疾病，但是在分子水平都表現(xiàn)為基因組高度不穩(wěn)

4、定性、染色體異常 （染色體斷裂、缺失、重排、姐妹染色體交換等）和對dna損傷因子 敏感性增加。在臨床上表現(xiàn)為過早衰老、ii型糖尿病、骨質(zhì)疏松、動 脈硬化和極度容易發(fā)生癌癥。大部分病人都是最終發(fā)生不同癌癥而死 亡。這一臨床共同現(xiàn)象引起了人們的關(guān)注和研究熱潮。對解旋酶的結(jié) 構(gòu)功能、作用機制的研究不僅可以認(rèn)清核酸代謝過程，還能幫助我們 揭示癌癥發(fā)病的某些相關(guān)機理。同時了解病毒解旋酶的結(jié)構(gòu)與功能, 為抗病毒藥物的研制提供了新的靶點和思路。解旋酶具有四大基本生 物化學(xué)活性:ntp水解活性、dna或rna結(jié)合活性、核酸鏈解鏈活 性和核酸鏈退火配對活性。在二價金屬離子（比如mg（2+）和ntp的 存在下，解

5、旋酶便表現(xiàn)出水解ntp的性質(zhì)，大部分酶水解atp和datp, 一些酶則能水解其他的核昔酸，比如tip和gtpo當(dāng)解旋酶與dna或 rna結(jié)合后，利用水解核昔酸產(chǎn)生的能量,推動酶在核酸鏈上的移動, 從而解開互補的兩條核酸鏈。隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)有些解旋酶 在核酸修復(fù)過程中能促使核酸鏈配對重組。這使得我們意識到解旋酶 在基因穩(wěn)定過程中的作用越來越重要。但是并不是所有的解旋酶成員 都表現(xiàn)出這四種基本生化功能，這與酶自身的結(jié)構(gòu)有密切的關(guān)系，酶的結(jié)構(gòu)決定了它所能表現(xiàn)的作用機制和生化活性。長期以來，科學(xué)家們 一直研究探索解旋酶的結(jié)構(gòu)與其功能間的相互關(guān)系，力求發(fā)現(xiàn)解旋酶 木質(zhì)的運作機制。recq解旋酶家

6、族盡管蛋口種類繁多,在氨基酸序列 上同源性不高，但有限的同源序列構(gòu)成了數(shù)個典型的功能區(qū)域:從n端向c端方向，分別為位于氨基酸序列中間段的解旋酶核心區(qū)域,recqc端區(qū)域(recq-ct)和解旋酶rnased保守區(qū)域(hrdc),這些區(qū)域具有不 同的功能,并相互協(xié)調(diào)共同執(zhí)行解旋酶的運作機制。解旋酶核心區(qū)域 是解旋酶標(biāo)志性結(jié)構(gòu)，它由一段高度保守的氨基酸序列組成，含有7個 保守區(qū)域，負(fù)責(zé)結(jié)合ntp、ntp水解和dna結(jié)合。recq-ct區(qū)域是 recq解旋酶家族唯一含有的結(jié)構(gòu)特征，但不是所有recq成員都含有 這一結(jié)構(gòu)域o recq-ct區(qū)域包含兩個重要的亞結(jié)構(gòu)域:由四個a螺旋和 四個保守的半胱氨酸

7、殘基組成的結(jié)構(gòu)平臺，因能特異結(jié)合鋅離子而被 命名為鋅結(jié)合區(qū)域或鋅指結(jié)構(gòu)nc-bindingmotif,zinefinger,zbm);序 列上不太保守的翼型螺旋亞結(jié)構(gòu)域(winged-helix9wh)。目前發(fā)現(xiàn) recq-ct結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)酶與核酸的結(jié)合、酶自身的折疊作用。hrdc 區(qū)域位于解旋酶氨基酸序列的c端,在部分recq成員中缺失,對這一 結(jié)構(gòu)域的認(rèn)識甚淺,一些研究表明hrdc區(qū)域能夠增強解旋酶對ntp 水解和解鏈活性。雖然解旋酶不同的結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)不同的酶功能，但解 旋酶核心區(qū)域、recq-ct和hrdc區(qū)域并不是各自獨立的，它們互相之間相互作用相互協(xié)調(diào)，共同完成酶的生理作用機制。本文

8、就以recq解旋酶家族屮blm、jiffrecq5 和枯草桿菌 recq(bacillussubtilisrecq)為實驗對彖,來研究解旋酶不同結(jié)構(gòu)域之間是如何相互影響、相互牽jiff制。從而了解解旋酶結(jié)構(gòu)與其功能相互間的關(guān)系，揭示解旋酶的作用 機制。首先我們把焦點放在recq解旋酶的recq-ct區(qū)域，想了解這一 區(qū)域是如何與解旋酶核心區(qū)域相互作用，相互之間存在何種聯(lián)系，來共 同維持解旋酶整體的酶活性平衡。我們以recq5為研究模型,recq5 是人體5種解旋酶之一，雖然至今未發(fā)現(xiàn)它與任何人類疾病有關(guān)，但是 有實驗證明recq5與blm蛋口密切相關(guān)，能協(xié)助blm蛋口維持染 色體的平衡。而且r

9、ecq5解旋酶天然存在三種異構(gòu)體:recq5(x、 req5p和recq5*其中req5pm大，含有解旋酶核心區(qū)域和recq-ct 區(qū)域,相對的recq5a最小，只含有解旋酶核心區(qū)域結(jié)構(gòu)。這兩種異構(gòu) 體成為研究recq-ct結(jié)構(gòu)域功能，和解旋酶核心結(jié)構(gòu)域相互關(guān)系最理 想的天然模型。實驗結(jié)果揭示,recq5(x既沒有atp水解能力,也不表 現(xiàn)解鏈活性,卻展示出對互補核酸鏈的退火配對作用。req5p則表現(xiàn) 出較弱的退火配對能力和較強的解鏈活性。一系列實驗證明，其中 recq-ct區(qū)域的保守結(jié)構(gòu)一鋅結(jié)合區(qū)域起到了重要作用，不僅增加酶 對dna的結(jié)合能力,而且起到了分子開關(guān)的作用，能夠通過對dna結(jié)

10、合的增強來抑制解旋酶核心區(qū)域的退火配對活性，同時改變蛋口構(gòu)型 啟動解鏈過程。我們率先提出recq-ct區(qū)域鋅指結(jié)構(gòu)與解旋酶核心區(qū) 域相互作用的機制模型，初步揭示兩者之間的相互聯(lián)系，了解recq解 旋酶結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)之間，結(jié)構(gòu)與功能間的相互關(guān)系。在對recq解旋酶核 心區(qū)域與recq-ct區(qū)域認(rèn)識的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究位于氨基酸序列最jiffc端的hrdc區(qū)域的功能，探究hrdc與解旋酶核心區(qū)域、recq-ct區(qū)域的相互關(guān)系。本文利用recq解旋酶家族中枯草桿菌個易戰(zhàn)抿再-s% 叩 www.yit _ 論文發(fā)表專家recq(bacillussubtilisrecq,subrecq)亞家族為研究模型，它

11、由兩個成 員組成。這兩種recq解旋酶的典型結(jié)構(gòu)差異在于一個含有hrdc區(qū) 域，而另一個則hrdc區(qū)域缺失。為研究提供了理想的天然結(jié)構(gòu)模型。 結(jié)果表明，具有hrdc區(qū)域的subrecq酶,表現(xiàn)出解旋酶基本的生化活 性,并能有效地解開一些dna復(fù)制與修復(fù)中dna錯誤結(jié)構(gòu)甚至是 holliday結(jié)構(gòu)。相對地，subrecq如果缺失hrdc區(qū)域,雖能具有較弱 atp水解活性，解鏈活性，但無法解開某些復(fù)朵的dna復(fù)制與修復(fù)中 間體結(jié)構(gòu),同時也不具有解開holliday結(jié)構(gòu)的能力。兩種解旋酶的 dna結(jié)合活性與dna退火配對活性無明顯差異。分析認(rèn)為,hrdc 結(jié)構(gòu)能輔助增強解旋酶的atp水解活性與解鏈活

12、性，在解開復(fù)雜的 dna結(jié)構(gòu)過程中起到了關(guān)鍵的作用。recq解旋酶家族中的blm蛋 白是迄今在人體中發(fā)現(xiàn)的5種解旋酶之一,blm編碼基因的缺陷會導(dǎo) 致疾病bloom綜合癥的發(fā)生。而且blm蛋白具有recq解旋酶家族 典型的結(jié)構(gòu)特征，因此它成為理想的研究模型。本實驗室致力于blm 蛋白生化活性的研究己有多年，發(fā)現(xiàn)完整的blm蛋白能表現(xiàn)出解旋 酶全部的基本生物功能，也了解了其各個結(jié)構(gòu)區(qū)域負(fù)責(zé)哪些酶功能。 在研究其結(jié)構(gòu)與功能的相互關(guān)系的過程中我們發(fā)現(xiàn),blm蛋白的解旋 酶核心區(qū)域含有高度保守的精氨酸殘基靠近于與其結(jié)合的atpy磷酸 位置,稱為精氨酸指結(jié)構(gòu)。我們推測這一結(jié)構(gòu)負(fù)責(zé)atp的結(jié)合與水解 活性

13、。蛋白結(jié)構(gòu)分析表明,blm蛋白解旋酶核心區(qū)域還有兩個保守的 精氨酸殘基一r979與r982。突變這兩個殘基位點后，發(fā)現(xiàn)blm對atp 的水解能力明顯下降，同時喪失解鏈能力，但對atp結(jié)合與dna結(jié)合個易找衣冉7 www.yitad_論文發(fā)表專家能力并無影響or982突變體的atp水解和解鏈活性減弱幅度比r979 突變體更為明顯。運用目前公認(rèn)的精氨酸指檢測試劑一原銳酸鹽(vi) 探測blm蛋白的精氨酸指結(jié)構(gòu),vi能與鎂離了、adp和酶形成復(fù)合 物，從而抑制酶對核昔酸亍端三磷酸催化活性,試驗結(jié)果表明vi能非競 爭性抑制r982精氨酸殘基對atp的水解作用，對r979精氨酸無抑制 作用，從而確定bl

14、m蛋口 r982氨基酸殘基形成了精氨酸指結(jié)構(gòu)。我 們還發(fā)現(xiàn)r982精氨酸指能與其周圍其他一些解旋酶核心區(qū)域的重要 殘基相互作用，促進(jìn)對atp的招募和水解。在此我們也從一個新的角 度揭示解旋酶是如何與atp和核酸結(jié)合啟動atp的水解，隨后引起蛋 白構(gòu)型變化并將水解產(chǎn)生的化學(xué)能源用于解鏈過程的作用機制。解旋 酶的結(jié)構(gòu)是其生化活性的前提，不同保守功能區(qū)域分別具有不同的功能，彼此之間相互作用，互相協(xié)調(diào),來完成酶的整個運作機制。除了解旋 酶核心區(qū)域外recq-ct與hrdc區(qū)域也是解旋酶重要的結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)的 缺失與突變會不同程度影響酶的功能,增加或者減弱某些酶活性。解 旋酶結(jié)構(gòu)特征的完整保證了其在細(xì)胞中維

15、持核酸代謝穩(wěn)定的重要地 位。【關(guān)鍵詞】:【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)【學(xué)位級別】：博士【學(xué)位授予年份】：2010【分類號】：q55【目 錄】： summaryinchines玖中文摘要)12" 6summaryinfrench(resume) 16-18summary 18-20a個易戰(zhàn)抿再-s% 叩 www.yit_ 論文發(fā)表專家breviations20-23chapter1generalintroduction23-951.differenthelicasefam1lies25-32superfamily126superf amily226-27superfamily327-

16、29superfamily429-31 others uperfamilies31-322.helicase-generalpropertiesofheli casesandmodeofaction32-392.1 biochemicalproperties ofhelicases32-372.1. lntpbindingandhydrolysisofntp322.1.2nucl eicacidsbinding32-332.3unwindingactivityandmodeofaction33362 .4annealingactivity36-372.2themultiplefunctions

17、ofhelica ses37-39helicaseanddnareplication37-38helicaseanddnarepair38hel icaseandrnametabolism3 8-393.therecqfamilyofdnahelic as es39-753.1generalfeaturesandstructuralorganisati on39-443.2theescherichiacolirecq44-483.2.1geneticbackgro und443.2.2biochemicalandstructuralpropertiesofe.colirecq44-453.2.

18、3r oleingenomicstability45-483.2.4recqhelicasesfromothermicroorganisms 483.3yeastrecqfamilyhelicases48-523.3.1 saccharomycescere visiaesgs 148-5 sgsl cellularphenotype48-4biochemicalp ropertiesofsgsl4interactionpartnersandmodelsfdrgenomeinstabili ty49-513.3.2schizosaccharomyc

19、espomberqh 151-5 biochemicalp roperites5functionintelomeremetabolism51-523.4recqhelica sesinhuman52-753.4.1 humanrecq 152-56humanrecq 1 andgieno mestability52-55biochemicalproperties55structureofhumanrecql 55-56 3.4.2blm-thebloomsyndromehelicase56-62bloom,ssyndrome(bs)56-個易戰(zhàn)抿冉-s% 叩 w

20、ww.yit_論文發(fā)表專家58bsciellularphenotype58blmproteinanditsinteractionpartners58-623.4. 3wrn-thewernersyndromehelicase62-67thewiernersyndrome62-63wscellularphenotype63-65wrnproteinanditsinteractionpartners65-673. 4.4recq4/rts-therothmund-thomsonsyndromeprotein67-71 theroth maund-thomsonsyndrome(rts)67-68r

21、tscellularphenotype68-69recq4protein69-713.4.5recq571 -75discoveryofrecq571 -72biochemical propertiesofrecq572-75recq5andsces754.propose75-784theenzymaticregulationroleofzincfingermotifinrecqfamilyhelicase75-764.2thefunctionalaspectsofhrdcdomaininrecqhelicasefamily764.3thespecialstructuralfeatureofa

22、rgininefingerinrecqfamilyhelicase76-78references78-95chapter2results95-219izincbindingmotifinrecq5bactsasamolecularswitchturningstrand annealingintodnaunwinding96-128acknowledgements97-98summary98-99introduction99-10 2materialsandmethods102-109proteinsanddnasubstr ates 102-105quantificationoftheprot

23、ein-boundzn (2+)1ons105atpbindingassay105-106atpaseassay106dnabindingassay106-107dnahelicaseactivityassay107-108dnastrand-annealingassay108-109resultsanddisscussion109-124recq5helicasedomainalonecatalyzesstrandannealinqbutnotstrandseparation109-116therecq5helic個易戰(zhàn)抿冉-s% 叩 www.yit_ 論文發(fā)表專家asedomainbind

24、satpefficiently5butdisplaysapooratpaseactivity116-117azinc-bindingmotifisessentialforthehelicaseactivityofrecq5b117-120molecularmechanismofintramolecularstimulationofcatalyticactivitymediatedbythezincbindingmotif120-121modelfortheroleofthezinc-bindingmotifinthefunctionofrecqhelicases121-124concludin

25、gremarks124-125references125-128iibiochemicalcharacterizationofhelicaseactivityanddnasubstratespecificityofbacillussubtilisrecqhelicases128-174acknowledgement129-130summary130-1311ntroducton131 -133materialsandmethods133-141reagents 133nuleicacidsubstrates133templateselectionand aminoacidsequenceali

26、gnment 133-136proteinexpression 136-137proteinpurific ation137quantificationofzincionboundtosublandsubshelicases137-138sizeexclusionchromatographyofsubl13 8atpaseassay13 8dnahelicaseassay138-139protein-dnabindingassaybyemsa139dnastrand-annealingandstrand-exchangeassay139-141 results 141-165molecular

27、modelling141-143cloning.productionandpurificationofrecqhelicasefrombacillussubtilis143-145dna-dependentatpase activity 145-148個易戰(zhàn)抿再-s% 叩 www.yit_論文發(fā)表專家dnaunwindingactivitiesassayversusb.subtilisrecqh elicasesconcentration148polarityandprocessivityo ftheb.subtilisrecqhelicases148-153b.subtilisrecqhel

28、i caseactivityonblunt-endedandgappeddnasubstrate s153-155b. subtilisrecqhelicaseactivityonforkeddupl exdnawithincreasing3'and5'taillength155b.subtilis recqhelicasestargetdnarepl1cationandrepair1nter mediates 155-160bindingoftheputativeb.subtilisrecqt odnasubstrates160-162b.subtilisrecqhelica

29、sesposses sdnastrand-annealingactivityandpromotednaexch angeweakly162-165discussion165-170references170-174tit .theargininefingerofthebloomsyndromeprotein:it sstructuralorganizationanditsroleinenergycoupli ng 174-219 acknowledgements 175-176summary176-177int roduction177-182materialsandmethods182-18

30、9plasmid constructionandsite-directedmutagenesis182protei nexpressionandpurification182-183dnasubstratespre paration183atpaseassay183-184dnaunwindingactivity assay 184-185dnabindingassay185-186dnaannealingact ivitybyemsa186atp-b1ndingassays186-188preparationo forthovanadatesolutions188-189results189-211 design,expression，andpurificationofblmmutations189-191vii-a% ' _論文發(fā)表專家nhibitsanduncouplesatpaseanddnaunwindingactivitiesofblm191-194helicaseandatpaseactivitiesofthemutantenzymes194-199allmutantsdisplaynormalatpanddnab1ndingabilities199-206arginineresiduesmutantsdisplaynormalannealingabili