第十二章 環(huán)境監(jiān)測(cè)中的微生物學(xué)方法

1、第十二章 環(huán)境監(jiān)測(cè)中的微生物學(xué)方法第一節(jié) 水質(zhì)的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)· 細(xì)菌總數(shù) 細(xì)菌總數(shù)是指將l mL水樣（原水樣或經(jīng)稀釋的水樣）放在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，于37培養(yǎng)24小時(shí)后，所生長(zhǎng)的細(xì)菌菌落總數(shù)。細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定結(jié)果常用“cfu（菌落形成單位）/mL”或“個(gè)/mL”表示。根據(jù)水樣中的細(xì)菌總數(shù)，可將天然水體劃分為幾類：細(xì)菌總數(shù)101102 cfu/mL，極清潔水；102103 cfu/mL，清潔水；103104 cfu/mL，不太清潔水；細(xì)菌總數(shù)104105 cfu/mL，不清潔水；大于105 cfu/mL，極不清潔水。我國生活飲用水的國家標(biāo)準(zhǔn)（GB5749-1985）規(guī)定，生活飲用水中的細(xì)菌總

2、數(shù)不得超過102 cfu/mL。 · 腐生細(xì)菌數(shù) 自然水體中的腐生細(xì)菌數(shù)與有機(jī)物濃度成正比。因此，測(cè)得腐生細(xì)菌數(shù)或腐生細(xì)菌數(shù)與細(xì)菌總數(shù)的比值，即可推斷水體的有機(jī)污染狀況。污水帶的劃分及其特征 污水帶、特征 多污帶 甲型中污帶 乙型中污帶 寡污帶 腐生細(xì)菌數(shù)(個(gè)/mL) 數(shù)十萬至數(shù)百萬 數(shù)十萬 數(shù)萬 數(shù)十至數(shù)萬 有機(jī)物 含大量有機(jī)物，主要是蛋白質(zhì)和碳水化合物 主要是氨和氨基酸有物含量少 有機(jī)物含量極微 溶解氧 極低或幾乎沒有厭氧性 少量，半?yún)捬跣?較多，需氧性 很多，需氧性 BOD5 非常高 較高 較低 很低 細(xì)菌數(shù)與腐生帶的劃分 樣點(diǎn)號(hào) 細(xì)菌總數(shù)（百萬個(gè)/mL） 腐生細(xì)菌數(shù)（千個(gè)/m

3、L） 腐生菌數(shù)總菌數(shù)（） 腐生水 波動(dòng)范圍 平均 波動(dòng)范圍 平均 1 1.73.3 2.5 0.21.9 1.1 0.04 -腐生帶 2 1.63.4 2.4 0.93.0 2.0 0.08 -腐生帶 3 1.93.0 2.5 0.26.0 2.9 0.11 -腐生帶 4 4.35.0 4.6 9.716.5 13.3 0.30 -腐生帶 5 1.83.6 2.6 1.46.2 3.0 0.11 -腐生帶 6 3.56.8 4.8 59.2175.2 116.0 2.42 多-腐生帶 7 3.14.4 3.7 19.220.5 20.0 0.54 -腐生帶 8 2.02.7 2.3 10.33

4、6.2 20.2 0.84 -腐生帶 9 2.36.9 4.0 10.8147.6 64.9 1.62 多-腐生帶 · 糞便污染指示菌 · 指示菌的理想條件 o 該菌大量存在于人糞中，數(shù)量高于病原菌； o 在受人糞污染的水體中該菌易于檢出，而未受人糞污染的水體中則無此菌； o 在水體中該菌不會(huì)自行繁殖； o 在水體中該菌的存活時(shí)間應(yīng)長(zhǎng)于致病菌，對(duì)氯與臭氧等消毒劑以及其它不良因素的抵抗力強(qiáng)于致病菌； o 該菌檢測(cè)方法簡(jiǎn)捷； o 該菌適用于淡水、海水等各種水體。 · 較適宜的指示菌大腸菌群（coliform group，簡(jiǎn)稱coliform）、糞鏈球菌（Strepto

5、coccus faecalis）、產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）常用作糞污指標(biāo)菌。 · 大腸菌群 o 大腸菌群的特征 大腸菌群：指一群需氧、兼性厭氧的，能在37°C培養(yǎng)24小時(shí)使乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣的G無芽孢桿菌。包括大腸埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬等。 大腸菌群的鑒別菌  名吲哚試驗(yàn)甲基紅試驗(yàn)V.P.試驗(yàn) 檸檬酸鈉利用試驗(yàn) 氧化酶試驗(yàn)運(yùn)動(dòng)性大腸埃希氏菌 + + - - - ± 弗氏檸檬酸桿菌- + - + - + 產(chǎn)氣腸桿菌- - + + - + 克雷伯氏菌屬 ± - + + - -

6、o 大腸菌群的檢測(cè)§ 發(fā)酵法  亦稱多管發(fā)酵法或三管發(fā)酵法。以不同稀釋度的樣品分別接種乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基（或其它乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基）各數(shù)管。培養(yǎng)24小時(shí)后，觀察培養(yǎng)結(jié)果。若觀察到乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象，稱為陽性反應(yīng)。記下陽性反應(yīng)的試管數(shù)，查專用統(tǒng)計(jì)表求出大腸菌群的最可能數(shù)（MPN）。 § 濾膜法  選用孔徑為0.450.65mm的微孔濾膜，抽濾一定數(shù)量的水樣，使水樣中的細(xì)菌截留在濾膜上。然后，將濾膜貼在選擇性培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后直接計(jì)數(shù)濾膜上的大腸菌群菌落，算出每100 mL水樣中含有的總大腸菌群數(shù)。 o 大腸菌群指標(biāo)大腸菌群指數(shù)是指每升水中所含的大腸菌

7、群細(xì)菌的個(gè)數(shù)。大腸菌群值則是指檢出一個(gè)大腸菌群細(xì)菌的最少水樣量（毫升數(shù)）。我國飲用水的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，大腸菌群指數(shù)不得大于3，大腸菌群值不得小于333mL。第二節(jié) 空氣的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)· 空氣中細(xì)菌檢測(cè)方法· 撞擊法  亦稱裂隙式撞擊法。利用抽氣泵的吸引，使一定量空氣強(qiáng)迫通過一狹縫或噴嘴，在出口處形成高速噴射氣流，空氣中攜帶微生物的懸浮顆粒依靠慣性撞擊并粘附于轉(zhuǎn)動(dòng)的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿上，37培養(yǎng)24小時(shí)，計(jì)算菌落數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)果以“cfu/m3”表示。這種采樣法不受氣流影響，采樣量準(zhǔn)確，已成為世界各國首選的空氣細(xì)菌采樣方法。 · 平皿沉降法  靠地心引力

8、將空氣中攜帶微生物的懸浮顆粒沉降到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿中，37培養(yǎng)24小時(shí)，計(jì)算菌落數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)果以 “cfu/皿（9cm2）”表示。平皿沉降法已有100多年的歷史，由于簡(jiǎn)單易行，曾在國際上廣為應(yīng)用，我國至今仍廣泛采用。平皿沉降法的誤差較大，已逐漸被淘汰。 · 空氣中細(xì)菌總數(shù)指標(biāo)前蘇聯(lián)提出的室內(nèi)空氣的細(xì)菌總數(shù)指標(biāo)：清潔空氣的細(xì)菌總數(shù)，冬季4.5×103 cfu/m3，夏季1.5×103 cfu/m3；污染空氣的細(xì)菌總數(shù)，冬季>7×103 cfu/m3，夏季>2.5×103 cfu/m3。日本的細(xì)菌總數(shù)指標(biāo)：清潔空氣的細(xì)菌總數(shù)30 cfu

9、皿；普通空氣的細(xì)菌總數(shù)75 cfu/皿。我國室內(nèi)空氣中細(xì)菌總數(shù)的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（GB/T170931997）為：細(xì)菌總數(shù)4×103 cfum3（撞擊法）或45 cfu皿（沉降法）。 第三節(jié) 污染物毒性的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)· 污染物毒性檢測(cè)（發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)法）     利用某些細(xì)菌的生物發(fā)光現(xiàn)象，可借助于活體細(xì)胞內(nèi)具有的ATP、熒光素（FMN）和熒光素酶發(fā)光。該發(fā)光過程極易受到外界條件的影響，如有毒有害有機(jī)物與發(fā)光細(xì)菌接觸時(shí)，發(fā)光的強(qiáng)度將改變，隨著毒物濃度的增加而發(fā)光減弱。利用發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)儀可測(cè)得發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度，從而得知毒物的毒性大小。磷發(fā)光桿菌美國貝克曼公

10、司發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)儀；中科院南土所DXY2型；華東師范大學(xué)生物系SDJ1型生物發(fā)光光度計(jì)· 污染物致突變性檢測(cè)（Ames試驗(yàn)）     鼠傷寒沙門氏菌的組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株（His-），當(dāng)培養(yǎng)基中不含有組氨酸時(shí)它們不能生長(zhǎng)，但當(dāng)受誘變劑作用后，菌體DNA受到損傷，大量細(xì)胞回復(fù)突變?yōu)橐吧途辏@時(shí)培養(yǎng)基中即使不含組氨酸，該菌也能生長(zhǎng)。利用這個(gè)特性可檢測(cè)被檢物質(zhì)是否具有致突變性。第四節(jié) 應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)環(huán)境微生物美國Cetus公司Mullis等人于1985年建立了無細(xì)胞分子克隆系統(tǒng)（cell-free molecular cloning）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（p

11、olymerase Chain Reaction），簡(jiǎn)稱PCR。該反應(yīng)是在體外合成特異性DNA片段的方法。· PCR技術(shù)的基本原理 反應(yīng)體系:1、引物2、Taq DNA聚合酶3、反應(yīng)緩沖液4、模板DNA5、其它成分反應(yīng)參數(shù):1、變性2、退火3、延伸4、循環(huán)次數(shù)· o 加熱變性，將有待擴(kuò)增的DNA序列（也即模板），在9495的高溫條件下變性，使雙鏈DNA轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂淒NA。 o 退火，將加熱變性后得到的高溫變性DNA反應(yīng)液，緩慢地降溫至55。此時(shí)引物DNA的堿基與變性后單鏈模板DNA上一端堿基互補(bǔ)配對(duì)。 o 延伸，在72和耐熱性Taq DNA多聚酶的作用下，反應(yīng)體系中游離的四種單核苷酸（dNTP），有序地連接到引物上，并沿模板DNA順序方向合成新的DNA，進(jìn)行鏈的延伸。延伸出的DNA堿基與模板DNA堿基成互補(bǔ)關(guān)系。 · 應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)環(huán)境中的致病菌與指示菌 · 利用PCR技術(shù)檢測(cè)環(huán)境中的基因工程菌（GEMs）