阿卡寧衍生物合成產(chǎn)物中乙酰膽堿酯酶抑制劑的篩選-阿卡寧衍

1、中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院第五屆(2004學(xué)年)創(chuàng)新化學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告-左娜娜阿卡寧衍生物合成產(chǎn)物中乙酰膽堿酯酶抑制劑的篩選左娜娜 馬志玲*(中山大學(xué)化學(xué)學(xué)院分析化學(xué)研究所，廣州，510275)摘要 本文以合成得到的乙酰膽堿酯酶抑制劑混合物為研究對(duì)象，通過紫外分光光度法檢測(cè)出混合物是否具有活性，進(jìn)一步通過高效薄層色譜法（HPTLC）確定活性物質(zhì)的個(gè)數(shù)以及位置，接著通過液相質(zhì)譜（LC-MS）聯(lián)用等方法對(duì)活性物質(zhì)定性分析?；旌衔矬w系，通過本實(shí)驗(yàn)的方法，不經(jīng)分離提純即可測(cè)定各種化合物是否具有抑制能力以及抑制活力的大小，包括各種副產(chǎn)物，因而可以獲得合成體系中有關(guān)抑制劑的最大的信息量。關(guān)鍵詞 乙酰膽堿酯酶 抑

2、制劑 篩選 1 前言阿爾茨海默?。ˋlzheimers，AD）是一種多發(fā)生于老年人中的緩慢進(jìn)行性、智能衰退性疾病，俗稱老年性癡呆病。AD的關(guān)鍵性癥狀主要是由膽堿能功能障礙所引起的，治療AD病的主要途徑是尋找新的中樞擬膽堿藥，乙酰膽堿酯酶抑制劑就是其中的一類治療藥物。 傳統(tǒng)的藥物篩選方法是定向合成再定向篩選，即首先通過化學(xué)預(yù)試尋找到藥物先導(dǎo)物，接下來設(shè)計(jì)合成路線，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，最后檢驗(yàn)活性。傳統(tǒng)篩選方法有兩個(gè)主要缺陷，一是傳統(tǒng)活檢只能應(yīng)用于純品，該方法只適用于易分離體系，對(duì)難分離混合物體系暫時(shí)沒有解決辦法；二是傳統(tǒng)定向合成只關(guān)注主合成產(chǎn)物，無視副產(chǎn)物也可能會(huì)有活性等信息。而在本方法中，合成

3、產(chǎn)物不需經(jīng)過分離和純化，可以直接篩選出活性物質(zhì)并對(duì)其定性。本文以合成得到的乙酰膽堿酯酶抑制劑混合物為研究對(duì)象，通過紫外分光光度法檢測(cè)出混合物是否具有活性，進(jìn)一步通過高效薄層色譜法（HPTLC）確定活性物質(zhì)的個(gè)數(shù)以及位置，接著通過高效液相色譜法（HPLC）以及液相質(zhì)譜（LC-MS）聯(lián)用等方法對(duì)活性物質(zhì)定性分析。這種篩選方法，克服了傳統(tǒng)篩選方法的弊端，講求整體性，對(duì)任意的合成體系，可以判斷出產(chǎn)物是否具有活性、活性物質(zhì)的位置以及活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，這對(duì)藥物篩選有重要的指導(dǎo)意義。*基金項(xiàng)目：中山大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院第五屆創(chuàng)新化學(xué)實(shí)驗(yàn)與研究基金項(xiàng)目資助第一作者 左娜娜，女，中山大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院應(yīng)用化學(xué)專業(yè)2

4、001級(jí)指導(dǎo)老師 馬志玲，中山大學(xué)化學(xué)院，副教授， Email：cesmzl2實(shí)驗(yàn)部分2.1抑制劑混合物體系的合成反應(yīng)步驟如下：在兩個(gè)50ml圓底燒瓶中，分別加入50mg原料和5ml甲醇，攪拌溶解；分別加入2-氨基吡啶和2-氨基代苯駢噻唑50mg；室溫狀態(tài)下攪拌72h；用薄層色譜法監(jiān)測(cè)反應(yīng)的進(jìn)行程度，必要時(shí)加入催化劑硼酸（催化量）；反應(yīng)結(jié)束后，用氮?dú)獍讶軇┐蹈?，再用三氯甲烷溶解；轉(zhuǎn)入分液漏斗中，用水洗兩次，每次5ml。合并提取液，用無水硫酸鈉干燥；把干燥后的反應(yīng)液用氮?dú)獍讶軇┐蹈?，?.5ml甲醇溶解。密封，冷凍保存，備用。2.2乙酰膽堿酯酶抑制劑的活力測(cè)定（IC50的測(cè)定）分別吸取一定量的抑

5、制劑溶液（1mg/ml），20lL4mg/ml的DTNB溶液，5L0.1mg/ml乙酰膽堿酯酶溶液和 pH8.0磷酸鹽緩沖溶液，置于酶反應(yīng)管中，于37下恒溫30分鐘，加入20L2mg/ml氯化乙酰膽堿，迅速混和均勻后，倒入500L的比色皿，測(cè)試=432nm處的吸光度，記錄吸光度隨反應(yīng)時(shí)間的變化。以抑制劑溶液的濃度為橫坐標(biāo)，乙酰膽堿酯酶活力（OD432）為縱坐標(biāo)作圖。2.3薄層色譜法篩選乙酰膽堿酯酶抑制劑2.3.1分離乙酰膽堿酯酶抑制劑混合物將抑制劑混合物配成1mg/ml的甲醇溶液，吸取2 µL在2.5×10 cm的薄層板上進(jìn)行點(diǎn)板，然后在下列展開劑體系中展開。三氯甲烷：石油

6、醚：乙酸乙酯1.0：2.9：1.1； 0.4 ml的0.1 mol/L的HCl甲醇溶液；流動(dòng)相走過的距離為8.0 cm。2.3.2鑒別具有抑制能力的化合物乙酰膽堿在乙酰膽堿酯酶存在的條件下發(fā)生的水解反應(yīng)如下：Acetylthiocholine + H2O acetate + thiocholineThiocholine+DTNB2-nitrobenzoate-5-mercaptothiocholine+5-thio-2-nitrobenzoate(yellow）將抑制劑混合物配成1 mg/ml的甲醇溶液，取2 µL在2.5×10 cm硅膠板上進(jìn)行點(diǎn)板，然后在2.3.1中的展

7、開劑體系中展開，逐次噴上2 mg/ml的氯化乙酰膽堿和4 mg/ml的DTNB溶液，使得整塊硅膠板被飽和而其上的樣品斑點(diǎn)不至于脫落。自然放置5 min，使硅膠板晾干。最后噴上0.1 mg/ml的酶溶液。大概5 min后可以看到硅膠板黃色背景上出現(xiàn)白色圓圈，該現(xiàn)象應(yīng)在15 min內(nèi)觀察記錄，20-30 min內(nèi)會(huì)自然消失。2.4 液相質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定各種抑制劑化合物的分子量及分子結(jié)構(gòu)將抑制劑樣品配成1 mmol/L的甲醇溶液，經(jīng)高速離心機(jī)離心后，吸取上層清液進(jìn)樣，在下列色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。色譜柱：Thermo 150 mm×2.1 mm 3 um；毛細(xì)管溫度：270 ；噴射電壓：24.0

8、8 V；輔氣：鞘氣；進(jìn)樣量：10L；流動(dòng)相：甲醇、1的甲酸3結(jié)果與討論3.1 .乙酰膽堿酯酶抑制劑混合物抑制活力的測(cè)定（1）2-氨基吡啶合成的抑制劑混合物的IC50的測(cè)定圖一2-氨基吡啶合成的抑制劑混合物的IC50測(cè)定結(jié)果結(jié)論：2-氨基吡啶抑制劑混合物的IC50值為8.5µg，換算成體系中的濃度為2.8µg/ml。（2）2-氨基苯并噻唑合成的抑制劑混合物的IC50測(cè)定圖二2-氨基苯并噻唑合成抑制劑混合物的IC50測(cè)定結(jié)論：2-氨基苯并噻唑抑制劑混合物的IC50值為16.27µg，換算成體系中的濃度為5.43µg/ml。3.2高效液相色譜分離混合物并測(cè)定其

9、各自的相對(duì)含量經(jīng)過對(duì)一系列梯度進(jìn)行條件實(shí)驗(yàn), 綜合考慮出峰時(shí)間、峰形和分離度，得出如下梯度下分離效果最佳：05min 80%85%、515min 85%95%、1520min 95%100%。（1）2-氨基吡啶合成的乙酰膽堿酯酶抑制劑混合物 圖三 2-氨基吡啶合成抑制劑混合物經(jīng)HPLC分離的色譜圖（2）2-氨基苯并噻唑合成的乙酰膽堿酯酶抑制劑混合物圖四 2-氨基苯并噻唑合成的抑制劑混合物經(jīng)HPLC分離的色譜圖結(jié)論：由圖可知，兩個(gè)抑制劑混合物體系中各個(gè)的物質(zhì)都得到了較好的分離。3.3 薄層色譜法初步篩選乙酰膽堿酯酶抑制劑3.3.1 最佳展開劑體系的確定在實(shí)驗(yàn)過程中，分別對(duì)100 %的石油醚、10

10、0 %的氯仿、100 %的苯等單相展開劑體系，不同物質(zhì)組成的兩相展開劑體系，不同比例的石油醚與乙酸乙酯等兩相展開劑體系，以及在石油醚與乙酸乙酯體系中，加入了鹽酸的甲醇溶液和三乙胺的甲醇溶液的多相展開劑體系作了比較，考察了其對(duì)分離的影響。本實(shí)驗(yàn)選擇的石油醚：乙酸乙酯7.75：2.25（1.45：0.55）。在兩相體系的選擇過程中，發(fā)現(xiàn)氯仿體系對(duì)混合物體系的分離也有較好的結(jié)果，因此對(duì)比石油醚/乙酸乙酯兩相體系和石油醚/乙酸乙酯/氯仿三相體系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明氯仿的加入對(duì)分離有好的影響。固定石油醚和乙酸乙酯兩組分含量的基礎(chǔ)上，改變氯仿的量，從而確定氯仿的最佳加入量。最終確定展開劑體系中各租大風(fēng)含量比為：

11、三氯甲烷：石油醚：乙酸乙酯1.0：2.9：1.1。通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)加入了鹽酸的甲醇溶液后，比移值會(huì)有進(jìn)一步改善。分離該抑制劑混合物的最佳的鹽酸的量為0.4mL。3.3.2薄層色譜法鑒別具有抑制活力的化合物氯化乙酰膽堿在乙酰膽堿酯酶存在條件下，水解生成acetate和thiocholine，thiocholine和顯色劑DTNB反應(yīng)生成黃色物質(zhì)5-thio-2-nitrobenzoate，所以待樣品溶液用薄層色譜法分離，再逐次噴上底物、顯色劑以及新鮮的酶液后，整個(gè)硅膠板呈現(xiàn)黃色背景。而在有抑制劑化合物存在的地方，由于抑制劑抑制了底物的水解，則呈現(xiàn)白色。所以，硅膠板上的白點(diǎn)即代表著具有抑制能

12、力的化合物。利用上述現(xiàn)象，本實(shí)驗(yàn)可以粗略用薄層色譜法來篩選出具有乙酰膽堿酯酶抑制劑的化合物。3.4液相質(zhì)譜法分別測(cè)定各種抑制化合物的分子量及確定其分子結(jié)構(gòu)通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，得到了該抑制劑混合物體系的液相色譜圖和質(zhì)譜圖。對(duì)于各個(gè)不同保留時(shí)間的物質(zhì)，同時(shí)也分析了其各自的質(zhì)譜圖，從而得到了其各自的分子量。為了得到各種物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，還分析了其各自的二級(jí)質(zhì)譜，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下類圖。以2-氨基吡啶為例說明：圖八 保留時(shí)間t12.09min時(shí)物質(zhì)所對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖圖九 保留時(shí)間tr12.32min時(shí)物質(zhì)所對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖圖十保留時(shí)間t12.47min時(shí)物質(zhì)所對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖圖十一 保留時(shí)間t11.86min時(shí)物質(zhì)所對(duì)應(yīng)的

13、質(zhì)譜圖圖十二 保留時(shí)間t10.32min時(shí)物質(zhì)所對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖結(jié)論：從圖七圖十二可以得知，保留時(shí)間分別為12.09min時(shí)的化合物分子量為461；保留時(shí)間為12.32min時(shí)的化合物的分子量為362；保留時(shí)間為12.47min時(shí)的化合物分子量為463；保留時(shí)間為11.86min時(shí)的化合物分子量為461；保留時(shí)間為10.32min時(shí)的化合物的分子量為393。根據(jù)氫譜以及其二級(jí)質(zhì)譜裂分情況可以得到不同的保留時(shí)間所對(duì)應(yīng)的物質(zhì)的結(jié)構(gòu)分別如下。（1）（2）（3） （4） （5）參考文獻(xiàn)：1 王淑月，劉亞妹，姚道魯，高記華. 乙酰膽堿酯酶抑制劑的研究現(xiàn)狀. 承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào).19（2002）042 李春德編譯

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