引物設(shè)計(jì)實(shí)例推薦課件

1、2021/8/221引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析2021/8/222引物設(shè)計(jì)基本原則 引物長度（primer length） 產(chǎn)物長度（product length） 序列Tm值 (melting temperature) G+C含量（composition） 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu) （duplex formation and hairpin） 閱讀框2021/8/2231. 引物的長度 一般為15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因?yàn)檫^長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74，即Taq酶的最適溫度2021/8/2242.產(chǎn)物的長度 擴(kuò)增片段長度為100600堿基對.2021/8/2253. Tm值 引

2、物的Tm值一般控制在55-60度, 盡可能保證上下游引物的Tm值一致,一般不超過2度. 如果引物中的G+C含量相對偏低,則可以使引物長度稍長,而保證一定的退火溫度. Tm=2(A+T)+4(C+G)2021/8/2264. 引物的GC含量 有效引物中(G+C)的比例為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。2021/8/2275. 引物自身 引物間3端的互補(bǔ)、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗 2021/8/228任務(wù)任務(wù)用綠色熒光蛋白用綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記蛋白標(biāo)記蛋白NR12021/8/229SPBamHIpcDNA3.1NR1Plasmid

3、1:Plasmid 2GFP2021/8/2210SPBamHI(GGATCC)pcDNA3.1NR1-1aGFP2021/8/2211 121 ggggctccta gagaacccgg gggcgcttga ccgcgcgcgg gcggcccgcg ggtcgtacat 181 cgcgaggtcg tcgcactcgc gcaacccaga gccaggcccg ctgtgcccgg agctcatgag 241 caccatgcac ctgctgacat tcgccctgct tttttcctgc tccttcgcc c gcgcggatcc 301 cgaccccaag atcgt

4、caaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgtt 361 ccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgc 421 cacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct 481 catctctagc caggtctacg ctatcctagt tagccacccg cctactccca acgaccactt 541 cactcccacc cctgtctcct acacagctgg ctt

5、ctacaga atccctgtcc tgggactgac 601 tacccgaatg tccatctact ctgacaagag tatccacctg agtttccttc gcacggtgcc 661 gccctactcc caccagtcca gcgtctggtt tgagatgatg cgagtctaca actggaacca 721 catcatcctg ctggtcagcg acgaccacga gggacgggca gcgcagaagc gcttggagac 781 gttgctggag gaacgggagt ccaaggcaga gaaggtgctg cagtttgacc c

6、aggaaccaa NR1的編碼序列的編碼序列(4000bp)紅色紅色為信號肽, 藍(lán)色藍(lán)色為BamHI酶切位點(diǎn), 下劃線下劃線標(biāo)出酶切位點(diǎn)的閱讀框 2021/8/2212ATGGTGAGCAAG GGCGAGGAGC TGTTCACCGG GGTGGTGCCC ATCCTGGTCG AGCTGGACGG CGACGTAAAC GGCCACAAGT TCAGCGTGTC CGGCGAGGGC GAGGGCGATG CCACCTACGG CAAGCTGACC CTGAAGTTCA TCTGCACCAC CGGCAAGCTG CCCGTGCCCT GGCCCACCCT CGTGACCACC TTCG

7、GCTACG GCCTGCAGTG CTTCGCCCGC TACCCCGACC ACATGAAGCA GCACGACTTC TTCAAGTCCG CCATGCCCGA AGGCTACGTC CAGGAGCGCA CCATCTTCTT CAAGGACGAC GGCAACTACA AGACCCGCGC CGAGGTGAAG TTCGAGGGCG ACACCCTGGT GAACCGCATC GAGCTGAAGG GCATCGACTT CAAGGAGGAC GGCAACATCC TGGGGCACAA GCTGGAGTAC AACTACAACA GCCACAACGT CTATATCATG GCCGACA

8、AGC AGAAGAACGG CATCAAGGTG AACTTCAAGA TCCGCCACAA CATCGAGGAC GGCAGCGTGC AGCTCGCCGA CCACTACCAG CAGAACACCC CCATCGGCGA CGGCCCCGTG CTGCTGCCTAC CAGTCCGCCC TGAGCAAAGA CCCCAACGAG AAGCGCGATC ACATGGTCCT GCTGGAGTTC GTGACCGCCG CCGGGATCAC TCTCGGCATG GACGAGCTGT ACAAGTAAGFP序列(700bp)2021/8/2213引物要求 PCR擴(kuò)增GFP GFP兩邊添加B

9、amHI酶切位點(diǎn) 保證NR1的閱讀框不改變2021/8/22145 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3 3 TACCACTCGTTCCCGCTCCTCGAGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5GFP序列5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3 3 TACCACTCGTTCCCGCTCCTCGCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5Primer1: 5ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC.AGAGCCGTACCTGCT

10、CGACATGTTCATT 5 Primer2Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC.Primer2: 5 TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC.Primer2: 5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.第一步：擴(kuò)增第一步：擴(kuò)增GFP基本序列基本序列變性變性, 引物復(fù)性引物復(fù)性2021/8/2215第二步：GC比值；Tm值Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA.Primer2: 5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.Pri

11、mer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA （GC:60%,Tm：64）Primer2: 5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCC （GC:57%,Tm：66）2021/8/2216第三步：酶切位點(diǎn)Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA （GC:60%,Tm：64）Primer2: 5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCC （GC:57%,Tm：66）BamHI: ggatccPrimer1: 5 ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGA Primer2: 5 ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCC 2021/8/2

12、217第四步：閱讀框atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc cgc gcg gat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct.Primer1: 5 ggatccATGGTGA

13、GCAAGGGCGAGGANR1序列：序列：Primer1: 5 ggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA2021/8/2218atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc cgc gcg gat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgc

14、cat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacctNR1序列：序列：5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3 GFP序列cgc gcg gat ccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG ?ggat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct插入插入GFP后的組合序列后的組合序列2021/8/2219Primer2: 5 ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCCPrimer2: 5 g