基因工程中細(xì)菌內(nèi)源質(zhì)粒消除研究進(jìn)展

1、基因工程中細(xì)菌內(nèi)源質(zhì)粒消除研究進(jìn)展 041214146 艾熱帕提艾合買(mǎi)提 041214153 吳量 041214154 汪洋 041214155 鄧傳志 041214156 屠以林一、細(xì)菌內(nèi)源質(zhì)粒消除質(zhì)粒是能夠在染色體外自主復(fù)制的遺傳因子。質(zhì)粒上攜帶有多種基因使得細(xì)菌具有某些特殊表型。如:抗生素抗性、致病性、代謝能力、共生能力和接合轉(zhuǎn)移等。內(nèi)源質(zhì)?？梢宰园l(fā)地從細(xì)菌中丟失，但其丟失效率很低。質(zhì)粒消除是鑒定質(zhì)粒和獲得無(wú)質(zhì)粒的重要方法。二、消除細(xì)菌內(nèi)源質(zhì)粒的目的 在研究細(xì)菌內(nèi)源質(zhì)粒時(shí)，為了探究細(xì)菌內(nèi)源質(zhì)粒的功能，包括細(xì)菌耐藥性、細(xì)菌共生、細(xì)菌莢膜形成、細(xì)菌的重金屬抗性等方面，需要對(duì)細(xì)菌的內(nèi)源質(zhì)粒進(jìn)行

2、消除。三、人為干預(yù)消除內(nèi)源質(zhì)粒的方法 如前面所言，內(nèi)源質(zhì)粒可以自發(fā)地從細(xì)菌中丟失，但其丟失效率很低。為了提高內(nèi)源質(zhì)粒的丟失效率，一般采取以下三類(lèi)方法： 1、物理學(xué)方法 2、化學(xué)方法 3、分子生物學(xué)方法1.物理學(xué)方法1）特點(diǎn)：通過(guò)物理手段消除質(zhì)粒是最簡(jiǎn)單的質(zhì)粒消除方法。其優(yōu)點(diǎn)是消除實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單，操作容易且不會(huì)對(duì)細(xì)菌自身的基因組造成影響，不存在突變風(fēng)險(xiǎn)。2）現(xiàn)在使用物理學(xué)手段消除質(zhì)粒有以下幾種：(1)高溫(2)電穿孔法：先用過(guò)夜的 Ecoli 菌液制備電穿孔細(xì)胞，然后將細(xì)胞在2.5 kV，25F 條件下電擊，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)80%的菌株消除了內(nèi)源質(zhì)粒。電穿孔方法消除質(zhì)粒是因?yàn)榧?xì)菌的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁在高電壓下被擊

3、穿，表面形成很多孔洞，內(nèi)源質(zhì)粒從孔洞流出細(xì)胞，造成細(xì)菌質(zhì)粒消除。 (3)原生質(zhì)體形成與再生法：在金黃色釀膿葡萄球菌 ( Staphylococcus aureus) 中利用原生質(zhì)體形成與再生的方法消除了內(nèi)源質(zhì)粒，且消除效率達(dá)80%。原生質(zhì)體形成與再生法消除原理為:在原生質(zhì)體制備的過(guò)程中細(xì)菌的細(xì)胞壁被去除，造成了質(zhì)粒復(fù)制過(guò)程中分配機(jī)制的破壞，從而導(dǎo)致質(zhì)粒消除。2.化學(xué)方法1）特點(diǎn)：利用化學(xué)試劑消除質(zhì)粒的方法使用最為廣泛。該方法消除質(zhì)粒的作用靶位點(diǎn)主要有兩個(gè): 一個(gè)與細(xì)菌的細(xì)胞膜相關(guān)，質(zhì)粒和染色體復(fù)制都需要結(jié)合在細(xì)胞膜上，細(xì)胞膜上質(zhì)粒結(jié)合位點(diǎn)的破壞會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒復(fù)制受阻，造成內(nèi)源質(zhì)粒丟失；另一個(gè)與質(zhì)粒

4、的復(fù)制相關(guān)，涉及質(zhì)粒的復(fù)制、分配和分離。在復(fù)制過(guò)程中任何一個(gè)環(huán)節(jié)質(zhì)粒或者質(zhì)粒復(fù)制所需的酶被抑制，都將導(dǎo)致質(zhì)粒復(fù)制異常，進(jìn)而造成質(zhì)粒丟失。2）方法：（1）吩噻嗪類(lèi) 吩噻嗪類(lèi)化合物可以與細(xì)菌的DNA結(jié)合。在細(xì)胞中與細(xì)菌DNA的結(jié)合效率依次為質(zhì)粒DNA、線性或者開(kāi)環(huán)質(zhì)粒、最后為染色體DNA。將質(zhì)粒 DNA和吩噻嗪類(lèi)化合物混合進(jìn)行電泳分析，發(fā)現(xiàn)超螺旋的質(zhì)粒消失，而開(kāi)環(huán)或者線性質(zhì)粒的比率增加。推測(cè)此類(lèi)化合物結(jié)合質(zhì)粒以后，會(huì)在質(zhì)粒上形成切口，造成質(zhì)粒解螺旋，從而導(dǎo)致質(zhì)粒不能復(fù)制。2.化學(xué)方法（2）抗生素類(lèi) 因?yàn)榇蠖鄶?shù)質(zhì)粒消除試劑都具有抗菌性質(zhì)，因此抗生素對(duì)質(zhì)粒消除的作用亦被廣泛研究。很多抗生素類(lèi)藥物都可用

5、于質(zhì)粒消除，如新生霉素、曲伐沙星、利福平、絲裂霉素 C 等。其中新生霉素的運(yùn)用最為廣泛，消除效率為4.6%。它們作為DNA促旋酶抑制劑，能抑制促旋酶活性，使得質(zhì)粒復(fù)制中間體在細(xì)菌體內(nèi)大量積累，造成質(zhì)粒復(fù)制異常從而導(dǎo)致質(zhì)粒丟失。（3）表面活性劑 表面活性劑如脫氧膽酸、Tween 80、SDS等也被用于質(zhì)粒消除。其中SDS是最常用的表面活性劑消除試劑。表面活性劑可以溶解膜蛋白，破壞細(xì)胞膜，從而破壞細(xì)胞膜上質(zhì)粒復(fù)制所必需的結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致質(zhì)粒不能正常復(fù)制，造成分裂時(shí)質(zhì)粒丟失。3.分子生物學(xué)方法1)特點(diǎn)：分子生物學(xué)消除方法的優(yōu)點(diǎn)是作用機(jī)理和作用靶點(diǎn)明確，消除效率高。2）方法：主要包括兩類(lèi):一類(lèi)為借助轉(zhuǎn)座

6、子消除質(zhì)粒;另一類(lèi)為利用質(zhì)粒不相容性消除質(zhì)粒。 四、應(yīng)用實(shí)例（1） 谷氨酸非依賴型 -PGA 產(chǎn)生菌解淀粉芽胞桿菌。全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)該菌株中含有 1個(gè)6758 bp 的內(nèi)源質(zhì)粒。為了探明其功能，需要對(duì)內(nèi)源質(zhì)粒進(jìn)行消除，采用SDS和吖啶橙結(jié)合高溫對(duì)細(xì)菌進(jìn)行處理，傳代多次以后沒(méi)有檢測(cè)到質(zhì)粒消除的突變菌株。選擇使用質(zhì)粒不相容性消除方法，分別將質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)和復(fù)制蛋白基因連接到溫敏型質(zhì)粒 pKSV7 上，獲得不相容質(zhì)粒 pKSV7rep-ori。利用不相容質(zhì)粒成功消除了內(nèi)源質(zhì)粒 pMC1，消除效率高達(dá)93%。四、應(yīng)用實(shí)例（2） 鑒定根瘤菌質(zhì)粒功能的方法主要是消除該質(zhì)粒和將其轉(zhuǎn)移到其他菌株中去以考察其性狀的改變。由于大多數(shù)根瘤菌質(zhì)粒十分穩(wěn)定且難于消除,并且只有極少數(shù)質(zhì)粒具有自我轉(zhuǎn)移功能,所以迄今有關(guān)根瘤菌非共生質(zhì)粒的功能所知甚少。已有的研究結(jié)果表明,根瘤菌的某些非共生質(zhì)粒與菌株的結(jié)瘤競(jìng)爭(zhēng)能力、固氮效率、胞外多糖產(chǎn)生以及對(duì)抗生素降解等有關(guān)。某些根瘤菌的內(nèi)源質(zhì)粒,包括共生質(zhì)粒和非共生質(zhì)?？梢栽诓煌N屬的根瘤菌之間、根瘤菌與土壤桿菌之間以一