支氣管肺泡灌洗(BAL)的臨床應(yīng)用與實(shí)驗(yàn)室檢查

1、支氣管肺泡灌洗 (BAL) 的臨床應(yīng)用與實(shí)驗(yàn)室檢查一定義：支氣管肺泡灌洗( bronchoalveolar lavage,BAL )是一種經(jīng)纖維支 氣管鏡獲取肺泡的細(xì)胞與生化成份的廣為實(shí)用而安全的方法。注意：BAL的操作規(guī)范BAI灌洗液的處理規(guī)范BAL的非細(xì)胞成份指標(biāo)尚不能作為有用的臨床參考二用途 ： 疾病診斷：特異性診斷；重要診斷工具。 療效與預(yù)后評(píng)價(jià) 治療 研究?對(duì)于某些特殊疾病，BAL可以做出特異性的診斷 機(jī)會(huì)性肺部感染：卡氏肺囊蟲(chóng)性肺炎，巨細(xì)胞病毒性肺炎，肺結(jié) 核，肺真菌感染塵肺，石棉肺，肺出血 鈹肺(陽(yáng)性淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)換試驗(yàn)) 支氣管肺泡細(xì)胞癌，惡性淋巴瘤等(腫瘤細(xì)胞) 肺泡蛋白沉著癥(

2、對(duì)氨基水揚(yáng)酸陽(yáng)性小體) 組織細(xì)胞增多癥 X (Histiocytosis X)?對(duì)于一些間質(zhì)性肺病，BAI是重要診斷手段 結(jié)節(jié)病，外源性過(guò)敏性肺泡炎，閉塞性細(xì)支氣管炎伴機(jī)化性肺炎( BOO)P ，特發(fā)性肺纖維化 (IPF) ，慢性嗜酸細(xì)胞肺炎等。 三應(yīng)用指征1. 間質(zhì)性滲出改變 ： 結(jié)節(jié)病，外源性過(guò)敏性肺泡炎，藥物性肺泡炎，特發(fā)性肺纖維化，膠原血管疾病，組織細(xì)胞增多癥 X，塵肺，癌性淋巴管炎等。2. 肺泡滲出改變：肺炎，肺泡出血，肺泡蛋白沉著癥， BOOP嗜酸細(xì)胞肺炎等3. 免疫缺陷病人并肺滲出病變:HIV感染，化療或放療，免疫抑制劑治療，器官移植四.BAL副反應(yīng)：發(fā)生率為0-2.3%，當(dāng)同時(shí)

3、進(jìn)行經(jīng)支氣管鏡肺活檢（TBLB），副反應(yīng)為 7%尚無(wú)因BAL死亡報(bào)道，因TBLB死亡0.2%,因開(kāi)肺活檢（OLB）死亡 1.8%。1. 副反應(yīng)發(fā)生形式與時(shí)間肺泡滲出<10%多于48小時(shí)后消失爆裂音2 4小時(shí)內(nèi)，于相關(guān)肺野喘息高敏病人1-2周發(fā)燒10-30% BAL幾小時(shí)后，可能與TNF-介導(dǎo)有關(guān)肺功能損害FEV1, VC, PEF, PaO2 短時(shí)降低PaCO短時(shí)增加（COPD支氣管痙攣少，高敏病人相對(duì)多氣胸只發(fā)生在經(jīng)支氣管肺活檢同時(shí)進(jìn)行支氣管反應(yīng)性無(wú)變化上皮完整性支氣管纖毛擺動(dòng)短時(shí)降低，但BAL®行24小時(shí)后，上皮細(xì)胞通透性無(wú)影響出血不明顯2.副反應(yīng)的預(yù)防：副反應(yīng)隨著灌注量及

4、灌注肺段的增加而增加，仔細(xì)操作，特別注意 能使并發(fā)癥減少到最小程度。全面了解病史，進(jìn)行肺功能試驗(yàn)，血?dú)夥治?，血小板?jì)數(shù)，出凝血 時(shí)間，心電圖，胸部放射片ECG氧飽和度監(jiān)測(cè)并予吸氧BAL后 24小時(shí)觀察限制灌洗量到最小需要量適當(dāng)?shù)牟僮髑坝盟?，必要時(shí)使用？-受體激動(dòng)劑等特殊病人嚴(yán)格掌握適應(yīng)征3. BAL時(shí)副反應(yīng)發(fā)生的危險(xiǎn)因素>50%的肺野滲出實(shí)變SaO2<90%，堿FEV1<60預(yù)計(jì)值，或 FEVK1L血小板計(jì)數(shù)低于 20,000/ml 對(duì)鎮(zhèn)靜劑敏感或不能耐受PaO2<60mmHg支氣管反應(yīng)性PC20<2ug/ml乙酰甲膽Prothromb in time<50

5、%明顯異常的 ECG 嚴(yán)重的伴發(fā)癥PC20 FEV降低20%所需的最低乙酰甲膽堿濃度五.EAL操作絕大多數(shù)在局麻下使用纖維支氣管鏡進(jìn)行。BALS、是在其它纖支鏡 操作之前，以免造成BAL的不純。1. 操作前用藥 ：鎮(zhèn)靜劑 : 以便病人合作；膽鹼能受體抑制劑：減低迷走反射，支氣管分泌，可增加BAL回吸收。2. 局部麻醉 ：必須徹底，防止咳嗽，因咳嗽致?lián)p傷，出血及灌洗液丟失。但進(jìn)行BAI前應(yīng)將利多卡因吸走以免影響細(xì)胞回收，活性及功能。3. 灌洗部位：常規(guī)為右中葉，左舌葉。中葉易于操作及嵌頓，回收的BAL較灌洗下葉多20%； 對(duì)于大多數(shù)彌漫性間質(zhì)性肺病病人，一個(gè)部位灌洗應(yīng)該能代表全肺并能 提供足夠的

6、臨床資料； 局部病變?nèi)缒[瘤，炎性滲出等需行局部病變部位灌洗。4. 灌洗液：無(wú)菌生理鹽水，370C或室溫。5. 灌注和回收方法：20-50ml /次，總量100-300ml /肺段。臨床上較實(shí)用而安全的灌洗 量： 5x20ml。6. 回收方法：每次灌注后立刻經(jīng)朔料注射器手動(dòng)回抽或吸引器低壓輕輕吸引 (25-100mmHg；)通常回吸收40-70%, < 25%寸，BAL不可靠； 回收的液體必須收集在朔料或硅化的注射器或容器內(nèi)，防止巨噬細(xì) 胞附著；可借助于導(dǎo)管進(jìn)行灌注,嵌頓后將導(dǎo)管從活檢孔送至支氣管鏡尖 端,再行灌注有利于注射器的變化,同時(shí)降低死腔。7. baL操作關(guān)鍵：局麻充分；防止病人咳

7、嗽；無(wú)急性支氣管炎；支氣管 鏡嵌頓。六.EAL液的實(shí)驗(yàn)室處理1 細(xì)胞計(jì)數(shù)與活性1) 所有回收液經(jīng)兩層紗部過(guò)濾,移去粘液,充分混勻(若使用20ml/次，因第一管回收的液體及細(xì)胞占總量比例很小， 計(jì)入總量?jī)?nèi),對(duì)結(jié)果影響不大)。2) 觀測(cè)性狀,測(cè)定液體量如BAI液呈混濁奶白色，提示肺泡蛋白沉著癥，需進(jìn)行PASfe色，電鏡檢查。如BALI呈橘黃色，提示出血，需行鐵染色。3) 離心 1500rpm x 10min上清液保存在-80 0C冰箱，以作生化成份分析。至目前為止，尚無(wú) 一個(gè)可靠的參考定量標(biāo)準(zhǔn).故尚無(wú)法用于臨床。細(xì)胞沉淀用2mlMB充分混勻后，等分裝在兩個(gè)eppendof管內(nèi)，1管用作細(xì)胞分類計(jì)數(shù)

8、,另 1管用作細(xì)胞免疫分析。*如果是血性BAL，需先進(jìn)行梯度離心分離淋巴細(xì)胞，加1mlFicoll液于前述留作細(xì)胞免疫分析用的1ml細(xì)胞懸液的底部，梯度離心3000rpmx3min+2000rpmx5min,讓離心機(jī)慢慢減速而停止.小 心吸取細(xì)胞環(huán)，用MBE 2ml懸浮，洗滌。* 如懷疑石棉肺：則先混勻所有回收液(過(guò)濾離心前)，從中取出10ml+30ml蒸餾水混勻,室溫靜置約一小時(shí),破壞細(xì)胞,有利于被巨噬細(xì)胞吞噬的 石棉小體釋放。輕輕搖晃,經(jīng)石棉小體過(guò)濾裝置 (Millipore) 真空過(guò)濾,過(guò)濾后, 0.45um微孔膜空氣干燥，注意避免打折小心轉(zhuǎn)移濾膜至圓形玻片上,用 Histokitt 封

9、片因用Histokitt封片后，亮度足夠鏡下觀察，故沒(méi)有必要用丙酮溶 解濾膜。光鏡（10x或40x）下計(jì)數(shù)整張濾膜上的所有石棉小體.被過(guò)濾的BAL毫升數(shù)（如10）除，得結(jié)果：石棉小體數(shù)/mIBAL4）細(xì)胞總數(shù)與活性測(cè)定細(xì)胞總數(shù)：10ul上述細(xì)胞混懸液+ 200ml Turck 溶液，充分混勻，取適量填充于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板內(nèi)計(jì)數(shù)或采用自動(dòng)計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板（Neubauer cell chamber） 數(shù)四角大方格（16 x 4 個(gè)小方格）內(nèi)細(xì)胞數(shù)，計(jì)算公式為：細(xì)胞總數(shù) = 細(xì)胞數(shù) x 52.5（ 計(jì)數(shù)板溶積）x 2000ul （含所有細(xì) 胞）106= 細(xì)胞數(shù)x 0.105 = ? （x 10

10、6細(xì)胞）細(xì)胞活性：50ul上述細(xì)胞混懸液+ 10ul臺(tái)盼藍(lán)（Typan blue ）溶 液，充分混勻，取適量填充于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板內(nèi)，5-10分鐘內(nèi)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞內(nèi)存活細(xì)胞的百分率，死細(xì)胞染成藍(lán)色。通常于320倍放大下計(jì)數(shù)。通?；钚栽?0-95%, < 50 %細(xì)胞活性，細(xì)胞形態(tài)及功能明顯受影 響。2. 細(xì)胞分類檢查：1）細(xì)胞涂片方法：常規(guī)手推片：簡(jiǎn)單，能適用于大多數(shù)需要，尤其適應(yīng)于要進(jìn)行腫瘤 細(xì)胞鑒定的BAL及血性BAL將上述留作細(xì)胞學(xué)檢查的細(xì)胞混懸液離 心后進(jìn)行涂片，空氣干燥。合格涂片細(xì)胞密度適當(dāng)，細(xì)胞分布均勻。細(xì)胞離心涂片：每張片5-20X104細(xì)胞。細(xì)胞保存液，離心速度，時(shí) 間均可

11、影響細(xì)胞分類。細(xì)胞離心涂片降低淋巴細(xì)胞分類。當(dāng)細(xì)胞總 數(shù)<1x106時(shí)，通常采用細(xì)胞離心涂片，當(dāng)細(xì)胞總數(shù) <1x106時(shí)，經(jīng)驗(yàn)稀 釋法如下：細(xì)胞總 數(shù)（x106）細(xì)胞懸 液+MBE< 0.50.6500ul+250ul0.7400ul+300ul0.8350ul+350ul0.9350ul+400ul1.0300ul+450ul將細(xì)胞充分混合后，每管200ul于細(xì)胞離心機(jī)離心650rpm x 2min微孔過(guò)濾：每張過(guò)濾紙200,000細(xì)胞，讓其進(jìn)行重力引流(gravity drai nin g)涂片。保持樣本濕化是關(guān)鍵，干燥將產(chǎn)生嚴(yán)重的細(xì)胞變性.適合于改良的 Haematox

12、ylin-eosin, Papanicolaou 染色，后者 較好地顯示細(xì)胞核與細(xì)胞漿，有利于瘤細(xì)胞，病毒包含體的鑒別， 與細(xì)胞離心涂片比較，淋巴細(xì)胞比例增加，嗜中性粒細(xì)胞比例降低 點(diǎn)吸涂片：將上述留作細(xì)胞學(xué)檢查的細(xì)胞混懸液離心后，調(diào)節(jié)細(xì)胞6數(shù)不要>10細(xì)胞/ul進(jìn)行點(diǎn)吸涂片，取一滴(約10ul )細(xì)胞液滴于玻 片，即刻回吸，形成一細(xì)胞圈；重復(fù)上述操作，做成四個(gè)細(xì)胞圈排 列于玻片一端，空氣干燥。*每份BAI樣本通常做3張涂片，一張做普通染色，另二張備做特殊 染色。當(dāng)懷疑機(jī)會(huì)性肺部感染，需做抗酸染色，甲苯胺藍(lán)染色時(shí)， 應(yīng)加做點(diǎn)吸涂片二張.2) 細(xì)胞染色：常規(guī)染色(供做細(xì)胞分類)：May-G

13、ru nwald-Giemsa(MGG染色 特殊染色：Fe染色(Berlin blue stain)PASfe色，過(guò)碘酸雪弗染色(Periodic acid Schiff's sta in)甲苯胺藍(lán)染色(Toluidine stain )蘇丹染色，脂肪染色(Sudan III stain )抗酸染色(Ziehl-Neelsen stain for acid-fast bacilli stai n)3) 細(xì)胞分類計(jì)數(shù)：MGG染色涂片于光學(xué)顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)至少6 0 0個(gè)白細(xì)胞求 分類百分比。半定量估計(jì)上皮細(xì)胞，紅細(xì)胞，如上皮細(xì)胞 >5%提示支氣管成份的混 入。另外觀察細(xì)胞形態(tài)，巨

14、噬細(xì)胞內(nèi)吞噬體，塵粒，石棉小體，紅細(xì)胞 片段，CM包含體，卡氏肺囊蟲(chóng)（PCP，細(xì)菌，霉菌，異形上皮及 腫瘤細(xì)胞。3. 免疫細(xì)胞學(xué)分析免疫細(xì)胞化學(xué)法，如過(guò)氧化酶抗過(guò)氧化酶反應(yīng)免疫熒光或流式細(xì)胞儀分析 （Im muno fluoresce nee or flow cytometry）免疫熒光優(yōu)點(diǎn)：流式細(xì)胞儀自動(dòng)測(cè)定，雙標(biāo)計(jì)有利于研究?jī)煞N不同 表面抗原的平行表達(dá)免疫熒光缺點(diǎn)：非參數(shù)計(jì)錄，非細(xì)胞形態(tài)顯示，巨噬細(xì)胞的自動(dòng)熒 光干擾免疫化學(xué)方法優(yōu)點(diǎn)：光學(xué)顯微鏡，永久保存，形態(tài)學(xué)觀察，敏感性 高免疫化學(xué)方法缺點(diǎn)：雖雙標(biāo)記可能，但耗時(shí)間4. 過(guò)氧化酶抗過(guò)氧化酶方法（perioxidase-antiperiox

15、idase method）是進(jìn)行BAL細(xì)胞免疫分析常使用的方法。優(yōu)點(diǎn)：所需細(xì)胞少，20,000細(xì)胞/反應(yīng)區(qū)，所需用抗體少細(xì)胞形態(tài)保存好（因?yàn)楸苊饬烁稍?，離心，丙酮固定，因此優(yōu)于經(jīng)空氣干燥的細(xì)胞離心涂片所進(jìn)行的免疫化學(xué)染色 ）1）細(xì)胞的準(zhǔn)備：將前述留作免疫細(xì)胞分析的細(xì)胞用MBE洗 3次，離心1500rpmx3min 再用MEM洗3次，離心1500rpm x 3min稀釋至適當(dāng)?shù)募?xì)胞濃度，一般10x106/ml，若巨噬細(xì)胞多，使用二倍 ME稀釋，若淋巴細(xì)胞細(xì)胞多，使用1/2倍ME稀釋2）細(xì)胞附著：吸附玻片用溫水洗去綠色保護(hù)層，再用NKH溶液沖洗（注意不要 損壞反應(yīng)區(qū)帶正電的薄膜，因其吸附帶負(fù)電的細(xì)

16、胞）。將混勻的細(xì)胞懸液10ul（20,000細(xì)胞）加于每個(gè)反應(yīng)區(qū)，顯微鏡下監(jiān) 控細(xì)胞密度.如細(xì)胞層過(guò)厚，需進(jìn)一步稀釋，如太薄，需加更多細(xì) 胞.細(xì)胞于濕合內(nèi)室溫下靜置10分鐘，防止細(xì)胞干燥。3）細(xì)胞固定: 真空吸去MEM加10ul 0.05%戊二醛于每個(gè)反應(yīng)區(qū)，讓其反應(yīng) 5分 鐘，吸走固定液，用NKf洗三次。（固定有利于細(xì)胞形態(tài)保存， 細(xì) 胞附著，阻止細(xì)胞表面的Fc受體）。4）加10ul準(zhǔn)備好的MAG-Swein于每反應(yīng)區(qū)，震蕩浮化15分鐘，吸走 MAG-Swei ne （以避免免疫球蛋白連接于玻片表面）5）加特異的單克隆抗體10ul，震蕩浮化15分鐘。*到此，反應(yīng)可以斬停，細(xì)胞片放于40C冰箱

17、保存。6）過(guò)氧化酶抗過(guò)氧化酶反應(yīng)：*用NK噴霧清洗多于抗體，相繼先后在三個(gè)盛有 NKH勺玻璃器皿內(nèi) 漂洗 3次，仔細(xì)從側(cè)邊吸走過(guò)剩的 NKH。加10ul準(zhǔn)備好的RAMU每個(gè)反應(yīng)區(qū)， 于震蕩器上震蕩浮化5分鐘，用 NK清洗玻片同上述。加10ul準(zhǔn)備好的SAR溶液于反應(yīng)區(qū)，于震蕩器上震蕩浮化 5分鐘，用 NK清洗玻片同上述。加10ul準(zhǔn)備好的PA溶液于每反應(yīng)區(qū)，震蕩浮化5分鐘，同前用NK清 洗后，再讓玻片留于第三瓶NK內(nèi)震蕩清洗5分鐘。7）DA反應(yīng)：移去過(guò)度的NKH加DAB 10ul于每反應(yīng)區(qū)，反應(yīng)10分鐘，用NK噴霧 洗去DAB再將玻片放于新鮮的NK溶液鐘震蕩清洗5分鐘。（注意：DAB是致癌物，

18、需保護(hù)性操作，一定要在排風(fēng)裝置下，戴口 罩，手套操作，DA廢物特殊存放，特殊處理）8）Osmiun反應(yīng)：移走多余的NKH加10ulOsmium于每反應(yīng)區(qū)，置于濕合內(nèi)于冰上反應(yīng) 10分鐘進(jìn)行后固定，用蒸餾水清除過(guò)剩的 Osmium玻片短時(shí)置于蒸 餾水的器皿中。（注意：Osmiun是有毒物，需保護(hù)性操作，一定要在排風(fēng)裝置下， 戴口罩，手套操作，Osmiun廢物特殊存放，特殊處理）9）封蓋玻片： 移走過(guò)量的蒸餾水，滴玻片覆蓋液適量，加蓋玻片，輕輕擠壓移去 多量覆蓋液，不要留氣泡，不要擠壓細(xì)胞，清洗表面，輕輕試干， 用無(wú)色指甲油封片。10) 光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)至少 200個(gè)淋巴細(xì)胞或巨噬細(xì)胞(包括陽(yáng)性和

19、陰性 細(xì)胞)，求出陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞的百分率。5. 細(xì)胞染色方法1) May-Gru nwald-Giemsa(MGG染色：空氣中涼干的細(xì)胞涂片于濃縮的 May-Grunwald 溶液中染色 3-5 分鐘 蒸餾水短時(shí)沖洗1：100 Giemsa 蒸餾水混合液中染色 15分鐘 自來(lái)水短時(shí)沖洗，空氣中涼干，加 Histokitt 封片2) Fe染色(Berlin blue 染色)：注意：禁止使用含F(xiàn)e的鑷子和容器空氣中涼干的細(xì)胞涂片于純甲醇 (methanol) 中固定 5分鐘配制 Potassium Hexacyanoferrate II 溶液：1g Potassium hexacyanoferrat

20、e II 3H2O+100ml蒸餾水+ 1ml 37% HCL(鹽酸加入使之易氧化，由無(wú)色清亮變?yōu)榫G色 , 特殊廢品處理) 玻片于新鮮的 Potassium Hexacyanoferrate II 溶液中作用 8分鐘 于Mayer氏蘇木精明磯(Mayer's haemalaun )染液中染色2-5分鐘 (染核)蒸餾水中清洗最多 10分鐘顯藍(lán)色空氣干燥，滴玻片覆蓋液如 Histokitt ，加蓋玻片。3) 甲苯胺藍(lán) (Toluidine blue) 染色：點(diǎn)吸細(xì)胞涂片空氣干燥至少半小時(shí)準(zhǔn)備醋酸硫酸混合液：30ml 濃醋酸(concen trated acetic acid)+10ml 濃

21、硫酸(concen trated sulphic acid)使用前冷卻 10分鐘細(xì)胞涂片放于準(zhǔn)備好的醋酸硫酸混合液中浮化 5分鐘，輕輕搖晃至少 3次，以促進(jìn)細(xì)胞更好溶解。自來(lái)水流動(dòng)清洗 5分鐘甲苯胺藍(lán)瓶中封蓋染色 5分鐘自來(lái)水流動(dòng)清洗 3分鐘玻片先后在 96%和100%乙醇 (ethanol) 中浸蘸約 10秒 空氣干燥，滴玻片覆蓋液如 Histokitt ，加蓋玻片PAS染色涂片空氣干燥至少 2小時(shí)蒸餾水短暫沖洗玻片于過(guò)碘酸 (periodic acid)溶液中浸泡 5分鐘蒸餾水短暫沖洗放玻片于 Schiff's 試劑中 10分鐘蒸餾水短暫沖洗放玻片于SO水中5分鐘蒸餾水短暫沖洗Ma

22、yer's haemalaun 染液中 30秒對(duì)照染色自來(lái)水中清洗 5分鐘至顯藍(lán)色蒸餾水短暫沖洗玻片先后于 96%和100%乙醇各 5秒鐘脫水 空氣中涼干，加 Histokitt 封片S02K 配制：0.6 g Na-disulphite+ 100ml 自來(lái)水+ 5ml 1N HCL4) Sudan III 染色(脂肪染色) 細(xì)胞涂片空氣干燥至少半小時(shí)蒸餾水中短暫浸蘸，50%乙醇(etha nol)中固定5分鐘Sudan III 溶液中封蓋染色 30分鐘50%乙醇(etha nol)中固定10秒，蒸餾水短暫沖洗Mayer's haemalaun 染液中 5分鐘對(duì)照染色封片蒸餾水

23、中清洗 5分鐘至顯藍(lán)色，空氣中涼干，加 Histokitt5) 抗酸染色：手推細(xì)胞涂片或點(diǎn)吸涂片空氣中干燥至少半小時(shí)，加熱固定 玻片用濃縮的石炭酸品紅液 (carbolfuchsin) 覆蓋，加熱蒸發(fā)過(guò)多染 料至少 5分鐘自來(lái)水沖洗，玻片用鹽酸酒精 (HCL-alcohol) 徹底脫色 用自來(lái)水沖洗，美藍(lán)( Methylene blue )對(duì)照染色至多 45秒 自來(lái)水沖洗，空氣中涼干，加 Histokitt 封片6) 肥大細(xì)胞染色：細(xì)胞涂片空氣中干燥至少 1小時(shí)， 10分鐘固定固定液組成：50ml純酒精(100% ethanol )+40ml氯仿(chloroform )+10ml醋酸(ace

24、tic acid )自來(lái)水流動(dòng)沖洗 5分鐘甲苯胺藍(lán) (Toluidine blue) 溶液中染色 20分鐘自來(lái)水流動(dòng)沖洗 5分鐘在96%乙醇( ethanol )中浸蘸 2次，空氣中涼干，加 Histokitt 封片6. 試劑配制1) 正常人血清 (AB serum) 分離非抗凝血于560C浮育30分鐘40C冰箱靜置2小時(shí)，離心5000rpmx20min分離的血清按200ul分裝，置于-200C冰凍保存2) 兔抗鼠免疫球蛋白原液( rabbit anti-mouse, RAM stocksolution) 1:5050ul 兔抗鼠免疫球蛋白( RAM)+200ul 正常人血清( AB seru

25、m)+200ul 豬血清( swine serum )+2500ul MAG40C冰箱儲(chǔ)存可用二周3) 豬抗兔免疫球蛋白( swine anti-rabbit, SAR )50ul 豬抗兔免疫球蛋白( SAR)+100ul 人血清( AB serum)40C冰箱孵化至少一天后待用，可存放4周4) DAB排風(fēng)裝置下，戴口罩，手套操作)0.5 g DAB+ 50ml NKH (無(wú) Hepes,無(wú)酚紅)+ 5ml Hepes (pH 8.0)+ 2ml明膠(gelantine ) 370C加熱溶化混合后，按2ml分裝，置于-20 0C保存DA使用液：2ml DAB + 20ul 3%H 2QDAB-

26、PA探針試驗(yàn)：5ul PAP + 50ul DAB 反應(yīng)顯棕色，4°C冰箱保 存可使用二天。5) Qsmiu m排風(fēng)裝置下，戴口罩，手套操作)250mg Qsmium+100ml Sorensen-PBS (0.1M/L,pH 7.4)避光封裝，40C冰箱保存6) Latex1000ul MEM (應(yīng)用液)+ 50ul 22%BSA + 5ul Latex 溶液于370C水浴預(yù)熱15分鐘7) BAL細(xì)胞轉(zhuǎn)送液50ml MEM (應(yīng)用液)+ 2.5ml 22%BSA8) 抗體各種凍干抗體按說(shuō)明溶解分裝：20ul抗體液 + 10ul液體石蠟，-200C冰凍保存 應(yīng)用時(shí)，抗體室溫解凍后，用

27、MA進(jìn)行稀釋，稀釋倍數(shù)因抗體而 異,如 1：50 或1：1009) 鹽酸酒精溶液( HCL-alcohol)270ml 蒸餾水+700ml 酒精 + 30ml 37%HCL10) 過(guò)碘酸溶液( Periodic acid solution )3.75 g過(guò)碘酸(HIQ6)+500ml蒸餾水11) 甲苯胺藍(lán) (Toluidine blue) 溶液0.15 g 甲苯胺藍(lán) 0(Toluidine blue 0)+ 30ml蒸餾水+ 70ml純乙醇(100% ethanol )+ 1ml 37%HCL12) Sudan III 溶液1 g Sudan III +100ml 70% 乙醇(etha no

28、l)于35°C水浴震蕩溶解，冷卻后過(guò)濾，避光保存13) MAG(M=MEM, A=Albumin, G=Gelatine)50ml 濃縮 MEM+2ml Hepes (pH 8.0)+500ul 22%BSA (牛血清白蛋白)+2ml 5%Gelatine (明膠)(需水浴溶化)+500ul 10%NaN3(疊氮鈉)(有害物，注意保護(hù)性操作)配制好的MA于40C冰箱保存可用一周左右14) 5% EDTA5 g Titriplex III 先用 70-80ml NKH(無(wú)Hepes,無(wú)酚紅，pH4-5) 溶解，用NaO調(diào)節(jié)pH為7.4，用同上NK配成100ml. 4°C冰箱保

29、 存可達(dá)4-8周。15) 05%戊二醛 (glutaraldehyde)200ul 25%戊二醛(有毒性)+100ml Soerensen PBS (pH 7.8)+2.5ml 40%葡萄糖4°C冰箱保存16) 5%明膠 (Gelatine)5 g明膠先用80ml蒸餾水于50°C溶解，加1ml NaN3,用1N NaO調(diào) 節(jié)pH至7.4，用蒸餾水配成100ml，按2ml分裝，4°C冰箱保存17) 1M/L Soerensen 磷酸緩沖液，Soerensen PBS (Soerensen phosphate buffer)3.4 g KH2PO4+250ml 蒸餾水

30、7.7 g Na2HPO4 +500ml 蒸餾水加磷酸二氫甲溶液( 0.1M/L) 到磷酸氫二鈉溶液至所需要的 pH值(如 pH7.8，加約 87ml)* pH 7.4為配制Osmiumffi玻片覆蓋液準(zhǔn)備* pH7.8為配制戊二醛準(zhǔn)備 分裝，-200C冰凍保存18) Hepes緩沖液 1M/L23.83 gHepes先用80ml蒸餾水溶解用1M/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4或8.0，用蒸餾水配成100ml* Hepes pH7.4為配制NKH溶液準(zhǔn)備，Hepes pH8.0為配制ME使 用液準(zhǔn)備19) 免疫細(xì)胞片覆蓋液 (cover solution)80ml甘油(Glycerin )+ 1

31、5ml Soerensen PBS (0.1M/L ， pH 7.4)+5ml 25%戊二醛(glutaraldehyde)( 毒性，排風(fēng)裝置下操作)20) 需每天新鮮配制的應(yīng)用液a) MEM (minium essential medium) 應(yīng)用液5ml濃縮MEM2ml Hepes (pH8.0) 加蒸餾水配制成 50mlb) MBE (M=MEM, B=BSA, E=EDTA)30ml MEM應(yīng)用液250ul 22%BSA (牛血清白蛋白) 600ul 5%EDTAc) NKH (N=Natriumchlorid, K=Kaliumchlorid, H=Hepes)8 g NaCL 0.

32、4g KCL+ 1L蒸餾水溶解，加1ml Hepes pH7.4，加400ul酚紅使其 顯淡粉色d) SandwichesM + S (MAG + Swine serum) : 100ul 豬血清 +1000ulMAGRAM (Rabbit anti-mouse immunoglobulin) 應(yīng)用稀釋液 1:250200ul 人血清 +200ul RAM原液 1:50+600ulMAGSAR (Swine anti-rabbit immunoglobulin)150ul經(jīng)40C冰箱孵化的SARf人血清混合液(50ul SAR+100u人血清)+ 1000ulMAGPAP (rabbit pe

33、roxidase anti-peroxidase immunocomplex)50ul PAP+1000ul MAG7. 試劑與器材acetic acid 100% 醋酸acetone 丙酮Adhesion slides with 12 reaction squares per slide BSA 22%,Beef serum albumin 牛血清白蛋白 Carbolfuchsin solusion 石炭酸品紅液 DAB, diaminobenzidine 聯(lián)苯胺Ethanol (95%, 100%) 乙醇FicollGelatine 明膠Giemsa吉姆薩染劑Glucose 40%葡萄糖G

34、lutaraldehyde 25% 戊二醛Glycerine 甘油HCL 37%Hepes buffer (pH 7.4, 1M/L)HistokittHuma n serum AB serum人血清H2O2 30%過(guò)氧化氫(C6FeK4N6 3H2O,Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrateM=422.41g/mol)KCLKH2PO4Lofler's methylene blue 呂弗勒氏亞甲藍(lán)Mayer's haemalun 蘇木精明礬May-Grunwald solutionMEM (10x),minium essential

35、 mediumMethanol 甲醇NaCLNa2HPO4NaN3(sodium azide) 疊氮鈉NaOHOsmium (OsO4) 俄PAP, peroxidase antiperoxidasePeriodic acid (H5IO6) 過(guò)碘酸Phenol red 酚紅RAM, Rabbit anti-mouseSAR, Swine anti-rabbitSchiff's reagentSodium disulphiteSulphuric acid (95-97%) 硫酸Swine serumSudan IIITitriplex III (C10H14N2Na2O8 2H2O)T

36、oluidine blue 甲苯胺藍(lán)醋酸Trypan bleu 臺(tái)盼藍(lán)(C34H24NNaO4S), 0.5% W / V in NS Turck's solution, acetic acid gentian violet solution 龍膽脂液Latex, Latex beads, Polystyrene 乳膠RPMI 1640L-GlutaminePenicillin/Streptomycin 配有排風(fēng)裝置的實(shí)驗(yàn)操作臺(tái) 冰箱滿足不同的溫度要求如 40C，-20 0C，-70 0C 震蕩器 Agitator(Heidolph Reax3) 臺(tái)式離心機(jī)適應(yīng)于 eppendorf

37、管 離心機(jī)適應(yīng)于不同規(guī)格管的需要如 2ml，10ml，50ml 細(xì)胞離心機(jī) (Cytospin) 微量加樣器不同規(guī)格及匹配的吸頭(5ul, 10ul, 20ul, 50ul, 100ul, 200ul, 400ul, 500ul,1000ul)微量加樣器支架Multi-pipettes(to give 10ul aliquots)及匹配的吸管微量天瓶 震蕩水浴pH測(cè)定儀細(xì)胞分類計(jì)數(shù)器 光學(xué)顯微鏡 真空水泵 倒置顯微鏡 Eppendorf 管及支架 50ml Falcon 管 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板 (Neubauer cell chamber)滴定燒瓶100ml, 500ml, 1000ml 朔料瓶，帶

38、噴霧頭 濕合紗布 吸附片 玻璃實(shí)驗(yàn)器皿DAB廢物瓶，Osmiun廢物瓶0.45um微孔膜，匹配玻片 石棉小體過(guò)濾裝置細(xì)胞培養(yǎng)所需部分相關(guān)材料 消毒吸管及 Pipette vibrator 細(xì)胞培養(yǎng)盤消毒 Eppendorf tips, Eppendorf tubes 消毒 50ml Falcon tubes 消毒紗布 低溫離心機(jī)CO培養(yǎng)箱Lipopolysaccharide(LPS) Herbimycin ADexamethosone PentoxifyllineAnti-CD14Anti-FasRAnti-TNFR1Anti-TNFR2Anti-Fas ligandELISA kits fo

39、r sFasR, sTNFR1, sTNFR2, bcl-2, TNF-, IL- 1,IL-6, Il-8, IL-10, etcAnnexin V-FITC kit detecting early phase of apoptotic cellsApoptosis in-situ kit免疫熒光分析 Analysis by immunofluorescene 用Ha nk's液洗BAL細(xì)胞6懸浮于RPMI-1640中，調(diào)節(jié)濃度10x10細(xì)胞/ml 細(xì)胞活性 >95%100ul 細(xì)胞懸液(1x106細(xì)胞)和適量的 fluorescein-isothiocyanate, FITC

40、,綠色，phytoerycerin, PE ，紅色連接的抗體孵化30分鐘 對(duì)照：不加抗體孵化后，用2ml冷Hank's液洗3次，離心300gx10min間接方法：加免疫標(biāo)記的抗鼠免疫球蛋白(包括對(duì)照)，孵化30分鐘， 用2ml冷Hank's液洗3次，離心300gx10min直接方法：對(duì)照：同型非特異單克隆抗體懸浮細(xì)胞熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率注：巨噬細(xì)胞可以有自身免疫熒光，尤其在吸煙著雙標(biāo)記免疫分析流式細(xì)胞儀(Flow cytometry )BAL的正常細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果健康非吸煙者健康吸煙者細(xì)胞總數(shù)x 1067 + 323 + 12巨噬細(xì)胞 %> 8096 + 3淋巴細(xì)

41、胞 %< 15< 7嗜中性細(xì)胞 %< 3< 2嗜酸性細(xì)胞 %< 0.5嗜鹼性細(xì)胞 %< 0.5? BAL中淋巴細(xì)胞亞類正常范圍健康非吸煙者健康吸煙者T 細(xì)胞(CD3)%63 - 8363 - 83Th-T 細(xì)胞(CD4+) %40 - 7020 - 50Ts-T 細(xì)胞(CDS) %20 - 4030 - 70CD4/CD81.1 - 3.50.5 - 1.5Nk細(xì)胞(CD57+) %2 - 141 - 11hla-dR %< 5< 5IL2R(CD25+)%< 6< 6B-細(xì)胞(CD2CI) %< 4< 4朗罕細(xì)胞(CD1+) %< 3< 4（細(xì)胞總數(shù)）? BAL的細(xì)胞分類異常與疾病關(guān)系淋巴細(xì)胞增多嗜中性細(xì)胞增多嗜酸性細(xì)胞增多過(guò)敏性肺泡炎IPF嗜酸細(xì)胞肺炎結(jié)節(jié)病ARDSChurg-Strauss 綜合癥BOOPWegner's肉芽腫IPF鈹肺膠原血管病ABPA結(jié)核石棉肺藥物性肺泡炎HIV感染塵肺支氣管哮喘病毒性肺炎支氣管肺部感染藥物性肺泡炎肺泡蛋白沉著癥淋巴瘤癌性淋巴管炎石棉肺，塵肺膠原血管病Crohn's 病原發(fā)性膽汁性肝硬變淋巴細(xì)胞f +中性