葛根素對東莨宕堿致小鼠恐懼記憶障礙的作用及腦內(nèi)SOD和MDA的影響

1、葛根素對東罠宕堿致小鼠恐懼記憶障礙的作用及腦內(nèi)sod和mda的影響萬剛玉季微魏文龍徐朝娜戴翔翔張信波俞朝陽通訊作者紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院浙江紹興312000【摘 要】fi的：探討葛根素對東董若堿致小鼠恐懼記憶障礙的作用及機制。 方法：用電刺激建立恐懼記憶模型小鼠,用東萇若堿建立恐懼記憶障礙模型，隨 機分成5組：空片對照組、模型組、葛根素低、屮、高劑量組。ig給予葛根素 300 mg?kg-l> 450 mg?kg-l 600 mg?kg-l,正常組及模型組則給予等量的生理鹽 水，連續(xù)灌胃5次，以葛根素半衰期為給藥間隔時間。于末次給藥結(jié)束后30 min 除空白對照組腹腔注射生理鹽水，其他各組注

2、射東萇若堿2mg?kg-l, 30 min后 用明暗箱檢測記憶能力,各組取4只小鼠處死并測腦組織中sod和mda的含量。 各組剩下的小鼠再用上述方法連續(xù)給藥5次再測潛伏期及取腦測sod和mda 含量。結(jié)果：與模型組比較，葛根素組小鼠進洞潛伏期明顯延長;葛根素能提高 小鼠腦組織內(nèi)sod含量以及降低mda的含量。結(jié)論：葛根素可以改善恐懼記憶 障礙小鼠的記憶能力，且以預(yù)防結(jié)合治療性處理組效果更好?！娟P(guān)鍵詞】葛根素；東萇若堿；恐懼記憶障礙；超氧化物歧化酶；丙二醛【中圖分類號j r285 【文獻標(biāo)識碼1b【文章編號】1674-8999 (2015 )8-0421-02effects of puerari

3、n on fear memory deficits and the role of sod and mda in brain of mice induced by scopolaminegangyu wan, wei ji, wenlong wei, zhaona xu, xiangxiang dai，xinbo zhang, chaoyang yu*(medical college of shaoxing, zhejiang shaoxing 312000)abstract objective: to investigate the effects of puerarin on fear m

4、emory impairment and the role of sod and mda in brain of mice induced by scopolamine and its mechanism.methods： electrical stimulation established mouse model of fear memory, and fear memory impairment model established by scopolaminel,the rats were randomly divided into five groups： the blank contr

5、ol group, the model control group, puerarin high-does group(300mg?kg-l), puerarin medium-dose group(450mg?kg-l)and puerarin lowdose group(600mg?kg-l) respectively.the high-does group,the mediun-does group and the low-does group was given with puerarin by intragastric administration for 5 times with

6、half-life of the dosing interval,the blank control group and the model control group was given with normal saline by the same way. all the groups except the normal control group were given with 2mg?kg-l scopolamine by intraperitoneal injection after 30 minutes at the end of the last administration a

7、nd use dark and light box to check the memory ability after 30 minutes.take four mice from each groups were sacrificed and measured the levels of sod and mda from brain tissue.use the above method of continuous administration of 5 times , then to measure incubation period and the levels of sod and m

8、da from brain tissue.results： compared with the model group, incubation period of puerarin group of mice was prolonged ; puerarin can improve the levels of sod and reduced the levels of mda from the brain tissue of mice.conclusion： puerarin can ameliorate the ability of memorizing of the fear memory

9、 impairment mice,a nd preve ntion combi nation with treatme nt group have better results.【key words puerarin;scopolamine;fear memory deficits;superoxide dismutase;malo ndialdehyde阿爾茨海默病(alzheimer's disease, ad)是一種發(fā)生在老年期的以認知和記憶 障礙為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其認知和記憶障礙與海馬結(jié)構(gòu)萎縮和功能 障礙密切相關(guān)，而海馬的部分功能由“恐懼中樞”杏仁核的調(diào)節(jié)來實現(xiàn)。此

10、外犬 量實驗證明抗氧化劑對ad的發(fā)病有延緩和保護作用k但是大多數(shù)合成的抗氧 化劑并沒有嚴格的毒理實驗驗證，所以人們更青睞天然的抗氧化劑。葛根素是從中藥葛根中提取的一種單體。屬于黃酮類化合物，此外有研究2 發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物具有較強的清除自由基的能力，提高機體抗氧化應(yīng)激能力。本 實驗對葛根素能否通過氧化應(yīng)激途徑來改善恐懼記憶障礙進行研究，從而為ad 的治療提供實驗依據(jù)。1材料1.1動物icr清潔級雄性小鼠（3月齡,24±2g） 75只由浙江杭州醫(yī) 科大學(xué)實驗動物中心提供合格證號:scxk（浙）20080033。室溫（20±2）°c, 顆粒飼料喂

11、養(yǎng)，自由飲水。1.2藥物與試劑純度為98%的注射用葛根素（西安天豐生物科技有限公司, 批號nf-20130924）；葛根素混懸液（稱適量注射用葛根素，加蒸惚水制成濃度 為20mg/ml的葛根素混懸液供灌胃用，灌胃前須搖勻）；氫澳酸東萇著堿（上海禾 豐制藥有限公司生產(chǎn)'批號h31021519）；超氧化物歧化酶（sod）、丙二醛（mda）試 劑盒、考馬斯亮藍試劑盒均為南京建成生物工程研究所提供；0.9%的生理鹽水、 無水灑精、蒸徭水、雙蒸水、冰醋酸均為市售分析純。1.3儀器722型分光光度計（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；sc-2542 低速臺式離心機（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）;z

12、d-420電熱恒溫水槽（嘉興市 中新醫(yī)療儀器有限公司）;ja1003型電子分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限 公司）；小鼠zh-dsx2型明暗箱（安徽淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）；研缽。2方法2.1恐懼記憶模型的建立 動物適應(yīng)環(huán)境2d,于第3 d進行足底板敏感性測 試，篩選出敏感性好的小鼠，于第4 d讓小鼠在穿梭箱中適應(yīng)5 min,然后將小 鼠放入明箱，測試小鼠進入暗箱的吋間（主動冋避反應(yīng)潛伏期，其值<5min, 如果5 min內(nèi)沒有進入暗箱潛伏期記為300 s）,等進入暗箱后給予0.5 ma的電刺 激，小鼠則發(fā)生被動冋避反應(yīng)跑向明箱。每只小鼠一天訓(xùn)練2次，持續(xù)一周， 從而建立

13、起恐懼記憶模型。再次剔除反應(yīng)性過于遲鈍的小鼠。2.2動物分組、給藥與造模 小鼠按體重均衡及隨機原則分組,分別為空白對 照組、東萇著堿模型組、葛根素300、450、600 mg?kg-l組，每組15只。東萇著 堿前給藥的各組以葛根素半衰期38min3為給藥間隔時間連續(xù)灌胃5次。于末次 給藥結(jié)束后30min除空白對照組腹腔注射生理鹽水，其他各組注射東萇著堿2 mg?kg-l, 30 min后用明暗箱檢測記憶能力。檢測結(jié)束后各組取4只小鼠處死并 測定腦組織中sod和mda的含量。各組剩下的小鼠即東萇著堿前后給藥組，再 以葛根素半衰期38 min為給藥間隔時間，連續(xù)灌胃5次。于末次給藥結(jié)束后30 mi

14、n后用明暗箱檢測記憶能力。檢測結(jié)束后各組取4只小鼠處死并測定腦組織中 sod和mda的含量。2.3小鼠明暗箱法 應(yīng)用明暗箱裝置，以小鼠主動冋避反應(yīng)為指標(biāo)測定記憶 能力。明箱用白熾燈光照亮，暗箱底部置銅柵可電擊動物，兩箱之間有一小洞(7 cm*5cm)相通供小鼠通過。測定吋將小鼠置于明箱，利用小鼠趨暗性，記錄小鼠 四肢全部進入暗箱的時間，即為進洞潛伏期(主動冋避反應(yīng)潛伏期，其值<5 min, 如果5 min內(nèi)沒有進入暗箱潛伏期記為300 s)o當(dāng)小鼠進入暗箱后即刻通電 (0.5ma4交流電)屯擊動物，小鼠逃至明箱后取出。2.4采集樣品及相關(guān)物質(zhì)的測定 行為學(xué)測試結(jié)束后，立即脫頸處死

15、，迅速 在冰上剝離大腦，稱重，加入腦重的9倍量生理鹽水勻漿，在3500 r/min, 4°c 條件下離心10 min,取上清置于一20°c凍存。按試劑盒說明書測定腦勻漿上清液 中sod和mda含量。2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)&plusnw;標(biāo)準差(x&plusnw;s)表示；采 用prism5.0 demo畫圖軟件進行繪圖，采用spss17.0統(tǒng)計軟件處理,多個組比較 采用單因素方差分析，p<0.05為差異有顯著性；p>0.05為差異不具有顯著 性。3結(jié)果3.1對明暗箱試驗中潛伏期的影響與對照組比較，東萇著堿模型組小鼠的

16、潛伏期明顯降低且有顯著差異(p<005),與模型組比較，東董君堿前低中劑量 給藥組和東萇若堿前后中劑量給藥組潛伏期明顯延長口有顯著差異(p<0.05), 東萇君堿前高劑量給藥組和東萇君堿前后低、高劑量給藥組潛伏期有所延長但與 模型組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(p&gt；0.05)o結(jié)果見表1和圖2。1,3與空白對照組比較p<00524與東萇著堿模型組比較p<0.051,34討論隨著全球人口老齡化，ad的發(fā)病率日趨上升，ad其最終影響生活質(zhì)量的關(guān) 鍵因素是學(xué)習(xí)記憶和認知功能的障礙，而現(xiàn)在已經(jīng)證實膽堿能系統(tǒng)的活性與人的 學(xué)習(xí)記憶和認知功能密切相

17、關(guān)。故腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)元的退化是導(dǎo)致ad的重要原 因之一。而膽堿能受體阻滯劑東罠著堿建立動物學(xué)習(xí)記憶障礙模型是常用的觀察 藥物對學(xué)習(xí)記憶障礙改善的試驗方法56。本試驗用東萇若堿建立恐懼記憶障礙模型，用明暗箱法觀察不同劑量葛根索對恐懼記 憶模型小鼠恐懼記憶的影響。行為學(xué)結(jié)果顯示葛根素450 mg?kg-l具有改善東萇 君堿所致恐懼記憶障礙的作用。sod是體內(nèi)清除氧自由基的重要酶之一，能夠清除氧自由基而對機體細胞產(chǎn) 生保護作用；mda是機體發(fā)生脂質(zhì)過氧化作用的產(chǎn)物，氧自由基可通過過氧化作 用引起細胞損傷。徐曉虹7研究發(fā)現(xiàn)葛根素可以通過提高sod活性同吋降低mda 活性來改善d半乳糖致衰老小鼠抗氧化能

18、力；王麗娟等8研究發(fā)現(xiàn)葛根素是通 過減少sod的消耗來提高抗氧化酶的活性從而改善u14宮頸癌小鼠的氧化功能; 楊東旭等9對b淀粉樣ad模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的研究發(fā)現(xiàn)葛根素明顯改善模 型小鼠的學(xué)習(xí)記憶，使小鼠腦及血中的sod增多、mda減少；此外研究還發(fā)現(xiàn) 10-11葛根素還可以通過增強sod、gsh-px活力和gsh含量，降低mda含量來拮 抗醉灑小鼠體內(nèi)的氧化反應(yīng)和緩解過氧化氫引起的大鼠心肌細胞氧化應(yīng)激損傷; 能夠抑制脂質(zhì)過氧化物所致的衰老退行性變12；本實驗發(fā)現(xiàn):葛根素450 mg?kg-l 無論是預(yù)防性處理組還是預(yù)防結(jié)合治療性處理組，均不同程度的增加sod含量 和減少mda含量。相比之下

19、，預(yù)防結(jié)合治療性葛根素450 mg?kg-l處理組升高 腦內(nèi)sod含量和降低mda含量的效果更佳。陳煒13等在葛根素對阿爾茨海默癥的治療作用及機制初探的研究中發(fā)現(xiàn) 葛根素在治療ad患者中能降低脂質(zhì)過氧化物酶的含量、增加sod活性，本實驗 進一步驗證了葛根素可以提高類似ad小鼠的抗氧化能力，故可為臨床通過提高 機體抗氧化能力途徑治療阿爾茨海默癥提供實驗依據(jù)。葛根為豆科植物野葛的干燥根，味甘辛，性涼。祖國醫(yī)學(xué)認為，葛根歸脾、 胃經(jīng)，具有解表退熱、生津止渴、升陽止瀉、透疹發(fā)表等功效，可用于治療外感 發(fā)熱頭痛、津液匱乏、消渴、發(fā)疹不透、熱痢、高血壓頭暈、頸項強痛等病證。 臨床上常用于治療高血壓、冠心病

20、、心絞痛、心肌梗死、腦缺血、腦淤血、腦梗 死等心腦血管病，但它對東萇君堿誘發(fā)的恐懼記憶障礙是否有改善作用還缺乏研 究。通過本實驗可發(fā)現(xiàn)，葛根素能明顯改善東罠著堿誘發(fā)的小鼠恐懼記憶障礙且 預(yù)防結(jié)合治療性葛根素450 mg?kg-l效果更佳，同吋這一改善作用可能是通過抗 氧化途徑實現(xiàn)。參考文獻：lpriticxo d. evidenee of oxidative stress in alzheimer's dis-ease brain and antioxidant therapycj. annals of the new york academy of sciences, 2008, (

21、12)： 1147： 70-78.趙保路氧自由基和天然抗氧化劑m生物物理學(xué)報,2010,26:263-2743吳燕紅，蘇子仁，陳建南，等從小鼠體內(nèi)血藥濃度時間曲線與組織分布特 征評價葛根素的給藥途徑j(luò) 中藥新藥與臨床理.2005, 16:112-115宋海濱，李春林，金毅，等兩種小鼠恐懼記憶模型建立的比較研究j中 國行為醫(yī)學(xué)科學(xué),2006,15:1076-10775 chaoya ng yao s, lisha x, et a i. effect of en doge nous histami ne in the ven tral hippocampus on fear memory deficits induced by scopolamine as evaluated by step-through avoidanee response in ratsj.phy