2022年血紅蛋白的提取和分離基礎(chǔ)知識(shí)

1、第 15 課時(shí)血紅蛋白的提取和分離1.歸納蛋白質(zhì)多樣性的原因(1)圖甲說(shuō)明：氨基酸的種類(lèi)不同，構(gòu)成的肽鏈不同。(2)圖乙說(shuō)明：氨基酸的數(shù)目不同，構(gòu)成的肽鏈不同。(3)圖丙說(shuō)明：氨基酸的排列次序不同，構(gòu)成的肽鏈不同。(4)圖丁說(shuō)明：肽鏈的數(shù)目和空間結(jié)構(gòu)不同，構(gòu)成的蛋白質(zhì)不同。2.血液包括血細(xì)胞和血漿，血細(xì)胞又分為紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板，其中紅細(xì)胞含有血紅蛋白，使紅細(xì)胞呈現(xiàn)紅色。3.紅細(xì)胞放到低滲溶液中，會(huì)吸收水分，體積膨脹直至漲破。課堂導(dǎo)入蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)不可缺少的物質(zhì)，隨著基因組測(cè)序工作的完成，人們對(duì)蛋白質(zhì)的研究和應(yīng)用工作進(jìn)入了新的時(shí)代，這就需要獲得純度較高的蛋白質(zhì)。因此對(duì)蛋白質(zhì)的分離就是生物

2、學(xué)研究中經(jīng)常要做的工作，下面我們就以血紅蛋白的提取和分離來(lái)學(xué)習(xí)有關(guān)蛋白質(zhì)的一些基本技術(shù)。探究點(diǎn)一蛋白質(zhì)分離技術(shù)生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)多種多樣，按照科學(xué)的需要有時(shí)要把它們分開(kāi)，分離蛋白質(zhì)常使用的方法是凝膠色譜法和電泳法，都是根據(jù)不同蛋白質(zhì)分子的之間的差異來(lái)分離的。1.蛋白質(zhì)特性的差異(1)分子的形狀和大小；(2)所帶電荷的性質(zhì)和多少；(3)溶解度；(4)吸附性質(zhì)；精品學(xué)習(xí)資料 可選擇p d f - - - - - - - - - - - - - - 第 1 頁(yè)，共 15 頁(yè) - - - - - - - - -精品學(xué)習(xí)資料 可選擇p d f - - - - - - - - - - - - - - 第 1

3、 頁(yè)，共 15 頁(yè) - - - - - - - - -(5)對(duì)其他分子的親和力。2.分離的方法(1)凝膠色譜法.概念：凝膠色譜法，也稱做分配色譜法，是根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。.凝膠：是一些微小的多孔球體，大多數(shù)是由多糖類(lèi)化合物構(gòu)成的，內(nèi)含許多貫穿通道，具有多孔的凝膠又稱為分子篩。.凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理(如圖 a)相對(duì)分子質(zhì)量直徑大小運(yùn)動(dòng)方式運(yùn)動(dòng)速度運(yùn)動(dòng)路程洗脫次序大大于凝膠顆?？障吨睆健⒈慌抛柙谀z顆粒的外面垂直向下移動(dòng)較快較短先從凝膠柱洗脫出來(lái)小小于凝膠顆?？障吨睆?，可以進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部垂直向下移動(dòng)，無(wú)規(guī)則擴(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒較慢較長(zhǎng)后從凝膠柱洗脫出來(lái).分離蛋白質(zhì)的過(guò)程

4、(如圖 b)蛋白質(zhì)混合物上柱；洗脫開(kāi)始，相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)擴(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)；相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)則被排阻于凝膠顆粒之外；精品學(xué)習(xí)資料 可選擇p d f - - - - - - - - - - - - - - 第 2 頁(yè)，共 15 頁(yè) - - - - - - - - -精品學(xué)習(xí)資料 可選擇p d f - - - - - - - - - - - - - - 第 2 頁(yè)，共 15 頁(yè) - - - - - - - - -相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)被滯留；相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)向下移動(dòng)；相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子完全分開(kāi)；相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)行程較短，已從層析柱中洗脫出來(lái)，相對(duì)分子質(zhì)量

5、較小的蛋白質(zhì)還在行進(jìn)中。(2)電泳概念：電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的ph 下，這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。原理： 在同一電場(chǎng)下， 由于各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身大小、形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。常用方法a.瓊脂糖凝膠電泳：由于瓊脂糖本身不帶電荷，所以，各種分子在電場(chǎng)中的遷移速率因各種分子帶電性質(zhì)的差異、分子大小和形狀的不同而不同，從而得以分離。b.聚丙烯酰胺凝膠電泳加入 sds 作用： 使蛋白質(zhì)發(fā)生完全

6、變性，解聚成單條肽鏈；sds 能與各種蛋白質(zhì)結(jié)合形成蛋白質(zhì) sds 復(fù)合物， sds 所帶負(fù)電荷的量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)原有的電荷量，因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。(3)緩沖溶液概念：在一定范圍內(nèi)，能夠抵制外界的酸、堿或稀釋的影響，維持ph 基本不變的溶液叫做緩沖溶液。緩沖溶液的配制：緩沖溶液通常由12 種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同ph 范圍內(nèi)使用的緩沖液。小貼士緩沖溶液常見(jiàn)的有三類(lèi)1 弱酸及其對(duì)應(yīng)鹽，如ch3cooh ch3coona， h2co3 nahco3。2 多元弱酸的酸式鹽及其對(duì)應(yīng)的次級(jí)鹽，如：nahco3 n

7、a2co3，nah2po4 na2hpo4。3 弱堿及其對(duì)應(yīng)鹽，如nh3h2o nh4cl。歸納提煉凝膠色譜法和電泳法凝膠色譜法分離分子是依據(jù)分子質(zhì)量大小，利用凝膠色譜柱使大分子優(yōu)先洗脫出來(lái)，而小分子后分離出來(lái)。電泳法分離分子則是依據(jù)各種分子帶電性質(zhì)的差異，以及分子本身的大小、形狀不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)在電場(chǎng)中將各種分子分離?；顚W(xué)活用1.下列各項(xiàng)中，除哪項(xiàng)外均為電泳使樣品中各分子分離的原因()精品學(xué)習(xí)資料 可選擇p d f - - - - - - - - - - - - - - 第 3 頁(yè)，共 15 頁(yè) - - - - - - - - -精品學(xué)習(xí)資料 可選擇p d f -

8、 - - - - - - - - - - - - - 第 3 頁(yè)，共 15 頁(yè) - - - - - - - - -a.分子帶電性質(zhì)的差異b.分子的大小c.分子的形狀d.分子的變性溫度問(wèn)題導(dǎo)析 電泳法是在同一電場(chǎng)下，由于各種分子帶電性質(zhì)的差異及分子本身大小、形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。答案d解析電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。樣品分子的帶電性質(zhì)不同、分子的大小和形狀不同都會(huì)影響帶電粒子在電場(chǎng)中的遷移速度，與分子的變性溫度無(wú)關(guān)，故選 d 項(xiàng)。探究點(diǎn)二血紅蛋白的提取和分離每一種蛋白質(zhì)的分離純化方法因其來(lái)源和性質(zhì)不同會(huì)有很大差異，下面以哺乳動(dòng)物紅

9、細(xì)胞為材料，學(xué)習(xí)初步分離蛋白質(zhì)的方法。1.蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。2.樣品處理(1)紅細(xì)胞的洗滌目的：去除雜蛋白；方法：采集血樣，低速短時(shí)間離心，然后用膠頭吸管吸出上層透明的黃色血漿，將下層暗紅色的紅細(xì)胞液體倒入燒杯，再加入五倍體積的生理鹽水稀釋?zhuān)匐x心，重復(fù)三次，直至上清液中不再呈現(xiàn)黃色，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。(2)血紅蛋白的釋放將洗滌好的紅細(xì)胞倒入燒杯中：加蒸餾水到原血液的體積，其作用是使紅細(xì)胞吸水漲破；加入 40%體積的甲苯，其作用是溶解細(xì)胞膜；置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0 min，其作用是加速紅細(xì)胞破裂；紅細(xì)胞破裂，釋放出血紅蛋白。(3)分離血

10、紅蛋白溶液將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管中，以2 000 r/min 的速度離心10 min，試管中的溶液分為 4 層：將試管中的液體用濾紙過(guò)濾、除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分離出下層的紅色透明液體，即血紅蛋白溶液。(4)透析精品學(xué)習(xí)資料 可選擇p d f - - - - - - - - - - - - - - 第 4 頁(yè)，共 15 頁(yè) - - - - - - - - -精品學(xué)習(xí)資料 可選擇p d f - - - - - - - - - - - - - - 第 4 頁(yè)，共 15 頁(yè) - - - - - - - - -原理：透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而將大分子保留在袋內(nèi)。過(guò)程： 取

11、1 ml 的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300 ml 的物質(zhì)的量濃度為 20 mmol/l 的磷酸緩沖液中(ph 為 7.0)，透析 12 h。目的： a.除去樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)。b.用于更換樣品的緩沖液。3.凝膠色譜柱的制作(1)取長(zhǎng) 40 cm，內(nèi)徑為1.6 cm 的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。(2)柱底部制作：橡皮塞打孔挖出凹穴安裝移液管頭部覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100 目尼龍紗將橡皮塞上部包好。(3)柱頂部制作：打孔安裝玻璃管。(4)將上述三部分按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體。4.凝膠色譜柱的裝填(1)計(jì)算：根據(jù)色譜柱的內(nèi)體積計(jì)算所需凝膠量(2)凝膠溶脹：凝膠用蒸餾水充分溶脹

12、后，配成凝膠懸浮液(3)固定：將色譜柱垂直固定在支架上(4)裝填：將凝膠懸液一次性裝填入色譜柱內(nèi)(5)洗滌平衡： 用 20 mmol/l 的磷酸緩沖液(ph7.0)洗滌平衡凝膠12 h，使凝膠裝填緊密5.純度鑒定 電泳判斷純化的蛋白質(zhì)是否達(dá)到要求，需要進(jìn)行蛋白質(zhì)純度的鑒定。鑒定的方法中，使用最多的是 sds 聚丙烯酰胺凝膠電泳。歸納提煉實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)(1)紅細(xì)胞的洗滌離心速度與離心時(shí)間十分重要，離心轉(zhuǎn)速要低， 時(shí)間要短， 否則白細(xì)胞等會(huì)一同沉淀，達(dá)不到分離的效果。重復(fù)洗滌三次，如上清液仍有黃色，可增加洗滌次數(shù)，否則無(wú)法清除血漿蛋白。(2)色譜柱填料的處理： 為了加速干凝膠的膨脹，可將加入洗脫液的

13、濕凝膠用沸水浴加熱，通常只需12 h。這種方法不僅節(jié)約時(shí)間，還可除去凝膠中可能帶有的微生物，排出膠粒內(nèi)的空氣。(3)凝膠色譜柱的裝填：在色譜柱中裝填凝膠的時(shí)候要盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。精品學(xué)習(xí)資料 可選擇p d f - - - - - - - - - - - - - - 第 5 頁(yè)，共 15 頁(yè) - - - - - - - - -精品學(xué)習(xí)資料 可選擇p d f - - - - - - - - - - - - - - 第 5 頁(yè)，共 15 頁(yè) - - - - - - - - -在裝填凝膠柱時(shí)，不得有氣泡存在。因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。在凝膠色譜操作過(guò)程中，

14、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。一旦發(fā)生上述兩種情況，凝膠色譜柱需要重新裝填。(4)蛋白質(zhì)的分離：滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，不要破壞凝膠面。根據(jù)紅色區(qū)帶的移動(dòng)狀況判斷收集流出液的時(shí)間。活學(xué)活用2.下列說(shuō)法不正確的是()a.在一定范圍內(nèi)， 緩沖溶液能夠抵制外界的酸和堿對(duì)溶液ph 的影響， 維持 ph 基本不變b.緩沖溶液通常由12 種緩沖劑溶解于水中配制而成c.電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程d.透析袋能使大分子自由進(jìn)出，而將小分子保留在袋內(nèi)問(wèn)題導(dǎo)析 透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而將大分子保留在袋內(nèi)。答案d解析透析袋一般是用硝酸纖維素(又叫玻璃紙 )制成的。透析

15、袋能使小分子自由進(jìn)出，而將大分子保留在袋內(nèi)。透析可以除去樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)，或用于更換樣品的緩沖液。1.用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)()a.路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢b.路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較快c.路程較短，移動(dòng)速度較慢d.路程較短，移動(dòng)速度較快答案d解析凝膠顆粒內(nèi)部有許多貫穿的通道，當(dāng)相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)，相精品學(xué)習(xí)資料 可選擇p d f - - - - - - - - - - - - - - 第 6 頁(yè)，共 15 頁(yè) - - - - - - - - -精品學(xué)習(xí)資料 可選擇p d f - - - - - - - - - - - - - - 第 6 頁(yè)，共

16、 15 頁(yè) - - - - - - - - -對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢；而相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速度較快。2.在血紅蛋白分離過(guò)程中，使用緩沖液的作用是()a.維持溶液濃度不變b.維持溶液酸堿度不變c.催化蛋白質(zhì)分離過(guò)程順利完成d.無(wú)實(shí)際意義答案b解析分離蛋白質(zhì)時(shí)加入緩沖液，其原因是緩沖液在一定范圍內(nèi)能抵制外界酸和堿對(duì)反應(yīng)溶液 ph 的影響，保持ph 基本不變。3.下列關(guān)于蛋白質(zhì)提取和分離實(shí)驗(yàn)中樣品處理步驟的敘述，正確的是()a.紅細(xì)胞的洗滌：加入蒸餾水，緩慢攪拌，低速短時(shí)間離心b.血紅蛋白的

17、釋放：加入生理鹽水和甲苯，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢鑓.分離血紅蛋白：將攪拌好的混合液離心，過(guò)濾后，用分液漏斗分離d.透析：將血紅蛋白溶液裝入透析袋，然后置于ph 為 4.0 的磷酸緩沖液中透析12 h答案c解析紅細(xì)胞洗滌步驟中應(yīng)加入生理鹽水而不是蒸餾水，血紅蛋白釋放中加入蒸餾水，透析時(shí)緩沖液ph 應(yīng)為 7.0 而不是 4.0。4.凝膠色譜柱制作成功的標(biāo)志是()a.凝膠裝填緊密、均勻b.凝膠色譜柱中有氣泡c.洗脫中，紅色區(qū)帶均勻一致地移動(dòng)d.洗脫中，紅色區(qū)帶偏向左邊移動(dòng)答案c解析洗脫過(guò)程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致地移動(dòng)，說(shuō)明色譜柱制作成功。5.凝膠色譜技術(shù)是六十年代初發(fā)展起來(lái)的一種快速而又簡(jiǎn)單的分

18、離技術(shù)，由于設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便，不需要有機(jī)溶劑，對(duì)高分子物質(zhì)有很高的分離效果，目前已經(jīng)被生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程學(xué)、分子免疫學(xué)以及醫(yī)學(xué)等有關(guān)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，不但應(yīng)用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，而且已經(jīng)大規(guī)模地用于工業(yè)生產(chǎn)。據(jù)圖回答下列問(wèn)題：精品學(xué)習(xí)資料 可選擇p d f - - - - - - - - - - - - - - 第 7 頁(yè)，共 15 頁(yè) - - - - - - - - -精品學(xué)習(xí)資料 可選擇p d f - - - - - - - - - - - - - - 第 7 頁(yè)，共 15 頁(yè) - - - - - - - - -(1)a 、 b 均 為 蛋 白 質(zhì) 分 子 ， 其 中 先 從 層 析

19、 柱 中 洗 脫 出 來(lái) 的 是 _ ， 原 因 是_ 。(2) 自 己 制 作 凝 膠 色 譜 柱 時(shí) ， 在 色 譜 柱 底 部d位 置 相 當(dāng) 于 多 孔 板 的 結(jié) 構(gòu) 可 由_ 替代。(3) 裝 填凝 膠 色 譜 柱時(shí) ， 色 譜 柱 內(nèi) 不能 有 氣 泡 存 在 ， 原 因 是_ 。(4)若選用 sephadex g100，則“ g”表示 _ ，100 表示 _。答案(1)aa 相對(duì)分子質(zhì)量大，無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速度較快(2)尼龍網(wǎng)和尼龍紗(3)氣泡會(huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果(4)凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍凝膠得水值

20、解析用凝膠色譜法分離各種大分子物質(zhì)時(shí)，大分子物質(zhì)先洗脫出來(lái)，然后是小分子物質(zhì)。大分子物質(zhì)由于直徑較大，不易進(jìn)入凝膠顆粒的微孔，而只能分布于顆粒之間，所以向下移動(dòng)的速度較快。小分子物質(zhì)除了可在凝膠顆粒間隙中擴(kuò)散外，還可以進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中，在向下移動(dòng)的過(guò)程中，從一個(gè)凝膠內(nèi)擴(kuò)散到顆粒間隙后再進(jìn)入另一個(gè)凝膠顆粒，如此不斷地進(jìn)入和擴(kuò)散，小分子物質(zhì)的下移速度落后于大分子物質(zhì)，從而落后于大分子物質(zhì)洗脫出來(lái)。在色譜柱中裝填凝膠的時(shí)候要盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。一是在裝填凝膠柱時(shí)，不得有氣泡存在，因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。二是凝膠色譜操作過(guò)程中，不能發(fā)生洗脫液流干，露出

21、凝膠顆粒的現(xiàn)象。一旦發(fā)生上述兩種情況，凝膠色譜柱需要重新裝填。精品學(xué)習(xí)資料 可選擇p d f - - - - - - - - - - - - - - 第 8 頁(yè)，共 15 頁(yè) - - - - - - - - -精品學(xué)習(xí)資料 可選擇p d f - - - - - - - - - - - - - - 第 8 頁(yè)，共 15 頁(yè) - - - - - - - - -基礎(chǔ)過(guò)關(guān)知識(shí)點(diǎn)一蛋白質(zhì)分離技術(shù)1.利用凝膠色譜法先洗脫出來(lái)的蛋白質(zhì)是()a.相對(duì)分子質(zhì)量大的b.溶解度高的c.相對(duì)分子質(zhì)量小的d.所帶電荷多的答案a解析相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)能進(jìn)入凝膠內(nèi)部通道，路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢；相對(duì)分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)

22、，路程較短，移動(dòng)速度較快，首先洗脫出來(lái)。2.凝膠色譜法是分離蛋白質(zhì)分子的一種常用方法，但并非所有的蛋白質(zhì)都可以用此方法進(jìn)行分離，能分離的蛋白質(zhì)分子之間必須()a.具有相同的相對(duì)分子質(zhì)量b.相對(duì)分子質(zhì)量不同，但都是相對(duì)分子質(zhì)量較大的分子c.相對(duì)分子質(zhì)量不同，但都是相對(duì)分子質(zhì)量較小的分子d.具有不同的相對(duì)分子質(zhì)量答案c解析若在每種凝膠分離范圍之外的分子，在不改變凝膠種類(lèi)的情況下是很難分離的。對(duì)于分子大小不同，但同屬于凝膠分離范圍內(nèi)的各種分子，在凝膠床中的分布情況是不同的，分子較大的只能進(jìn)入孔徑較大的那一部分凝膠。3.凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時(shí)，凝膠的種類(lèi)較多，但其作用的共同點(diǎn)是()a.改變蛋白質(zhì)分子通

23、過(guò)凝膠時(shí)的路徑b.吸附一部分蛋白質(zhì)，從而影響蛋白質(zhì)分子的移動(dòng)速度c.將酶或細(xì)胞固定在凝膠中d.與蛋白質(zhì)分子進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，從而影響其移動(dòng)速度答案a解析凝膠的種類(lèi)較多，但每種凝膠內(nèi)部都有孔隙。相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子可以進(jìn)入凝膠內(nèi)部，通過(guò)的路程較長(zhǎng)，洗脫時(shí)從凝膠柱中出來(lái)的較晚，相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子則可以較早地洗脫出來(lái)，從而達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的。精品學(xué)習(xí)資料 可選擇p d f - - - - - - - - - - - - - - 第 9 頁(yè)，共 15 頁(yè) - - - - - - - - -精品學(xué)習(xí)資料 可選擇p d f - - - - - - - -

24、 - - - - - - 第 9 頁(yè)，共 15 頁(yè) - - - - - - - - -4.已知某樣品中存在甲、乙、丙、丁、戊五種物質(zhì)，其分子大小、電荷的性質(zhì)和數(shù)量情況如圖所示。下列敘述正確的是()a.將樣品裝入透析袋中透析12 h，若分子乙保留在袋內(nèi)，則分子甲也保留在袋內(nèi)b.若五種物質(zhì)為蛋白質(zhì)，則用凝膠色譜柱分離時(shí)，甲的移動(dòng)速度最快c.將樣品以2 000 r/min 的速度離心10 min，若分子戊存在于沉淀中，則分子丙也存在于沉淀中d.若五種物質(zhì)為蛋白質(zhì)，用sds 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品中的蛋白質(zhì)分子，則分子甲和分子戊形成的電泳帶相距最近答案c解析透析的原理是相對(duì)分子質(zhì)量小的物質(zhì)能透過(guò)半

25、透膜，相對(duì)分子質(zhì)量大的物質(zhì)不能透過(guò)，乙保留在袋內(nèi)，甲則不一定保留在袋內(nèi)；凝膠色譜柱分離時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量小的物質(zhì)路程長(zhǎng)、移動(dòng)慢；離心時(shí)相對(duì)分子質(zhì)量大的物質(zhì)先沉淀，戊沉淀，則乙、丁、丙均已沉淀；用 sds 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)時(shí)，電泳遷移率主要取決于分子大小。知識(shí)點(diǎn)二血紅蛋白的提取和分離5.洗滌紅細(xì)胞時(shí)，離心所采用的方法是()a.低速長(zhǎng)時(shí)間離心b.低速短時(shí)間離心c.高速長(zhǎng)時(shí)間離心d.高速短時(shí)間離心答案b解析高速或長(zhǎng)時(shí)間離心，會(huì)導(dǎo)致白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，得不到純凈的紅細(xì)胞，而影響后面血紅蛋白的提取純度。6.對(duì)在凝膠柱上加入樣品和洗脫的操作，不正確的是()a.加樣前要使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液

26、下降到與凝膠面平齊b.讓吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)，貼壁加樣至色譜柱頂端，不要破壞凝膠面c.打開(kāi)下端出口，待樣品完全進(jìn)入凝膠層后，直接連接緩沖液，洗脫瓶開(kāi)始洗脫d.待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5 ml 收集一管，連續(xù)收集流出液答案c解析打開(kāi)下端出口，待樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口，再用同樣的方法小心加入適量的20 mmol/l 的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，然后連接緩沖液洗脫瓶，打開(kāi)下端出口，開(kāi)始洗脫。7.在蛋白質(zhì)的提取和分離中，關(guān)于對(duì)樣品處理過(guò)程的分析正確的是()精品學(xué)習(xí)資料 可選擇p d f - - - - - - - - - - - - - - 第 10 頁(yè)，共 15

27、 頁(yè) - - - - - - - - -精品學(xué)習(xí)資料 可選擇p d f - - - - - - - - - - - - - - 第 10 頁(yè)，共 15 頁(yè) - - - - - - - - -a.洗滌紅細(xì)胞的目的是去除血漿中的葡萄糖、無(wú)機(jī)鹽b.洗滌時(shí)離心速度過(guò)小，時(shí)間過(guò)短，白細(xì)胞等會(huì)沉淀，達(dá)不到分離的效果c.洗滌過(guò)程選用0.1%的生理鹽水d.透析的目的是去除樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)答案d解析洗滌紅細(xì)胞的目的是去除血漿中除血紅蛋白以外的雜蛋白；洗滌時(shí)離心速度過(guò)大，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，白細(xì)胞等會(huì)沉淀，達(dá)不到分離的效果；洗滌過(guò)程選用0.9%的生理鹽水。8.將處理破裂后的紅細(xì)胞混合液以2 000 r/min

28、的速度離心10 min 后，離心管中的溶液分為四層，從上到下的順序依次是()a.血紅蛋白、甲苯層、脂質(zhì)物質(zhì)層、紅細(xì)胞破碎物沉淀層b.甲苯層、紅細(xì)胞破碎物沉淀層、血紅蛋白、脂質(zhì)物質(zhì)層c.脂質(zhì)物質(zhì)層、血紅蛋白、甲苯層、紅細(xì)胞破碎物沉淀層d.甲苯層、脂質(zhì)物質(zhì)層、血紅蛋白、紅細(xì)胞破碎物沉淀層答案d解析混合液經(jīng)離心后按密度大小排列，在離心管中從上到下的順序依次是：第1 層為無(wú)色透明的甲苯層，第2 層白色薄層固體是脂溶性物質(zhì)沉淀層，第3 層紅色透明液體是血紅蛋白水溶液，第4 層暗紅色沉淀物主要是紅細(xì)胞破碎物沉淀。能力提升9.使用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)中，相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)在凝膠中的行進(jìn)過(guò)程，可表示

29、為圖中()答案b解析相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)留在顆粒外面，相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)進(jìn)入顆粒內(nèi)部；相對(duì)分子質(zhì)量大的通過(guò)凝膠間隙先被洗脫，相對(duì)分子質(zhì)量小的進(jìn)入凝膠內(nèi)部而后被洗脫。10.蛋白質(zhì)的分離與純化是蛋白質(zhì)研究的重要技術(shù)。下列有關(guān)敘述不正確的是()a.根據(jù)蛋白質(zhì)分子不能透過(guò)半透膜的特性，可將樣品中各種不同的蛋白質(zhì)分離b.根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷性質(zhì)的差異及分子大小等，可通過(guò)電泳法分離蛋白質(zhì)c.根據(jù)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小，可通過(guò)凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)d.根據(jù)蛋白質(zhì)的分子大小、密度不同，可通過(guò)離心沉降法分離蛋白質(zhì)答案a精品學(xué)習(xí)資料 可選擇p d f - - - - - - - - - - - - - -

30、 第 11 頁(yè)，共 15 頁(yè) - - - - - - - - -精品學(xué)習(xí)資料 可選擇p d f - - - - - - - - - - - - - - 第 11 頁(yè)，共 15 頁(yè) - - - - - - - - -解析蛋白質(zhì)分子是生物大分子，都不能通過(guò)半透膜， 因此不能利用半透膜分離蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)分子所帶電荷性質(zhì)的差異及分子大小可以使蛋白質(zhì)分子在電場(chǎng)中獲得不同的遷移速度，因此可以利用電泳法分離蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小不同，通過(guò)凝膠柱的時(shí)間不同，可通過(guò)凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)的分子大小、密度不同，具有不同的離心力，可通過(guò)離心沉降法分離蛋白質(zhì)。11.凝膠柱制作的順序一般是()橡皮塞打孔

31、挖凹穴裝玻璃管蓋尼龍網(wǎng)蓋尼龍紗將橡皮塞插入玻璃管接尼龍管、裝螺旋夾柱頂插入安裝玻璃管的橡皮塞a.b.c.d.答案b解析凝膠柱制作的一般流程是：選擇玻璃管選擇合適的橡皮塞打孔 挖凹穴 蓋尼龍網(wǎng) 蓋尼龍紗 將橡皮塞插到玻璃管接尼龍管 裝螺旋夾 柱頂插入安裝玻璃管的橡皮塞。12.下列關(guān)于電泳的說(shuō)法，不正確的是()a.電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程b.帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)c.蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少d.用 sds 聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于分子的大小答案c解析蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少

32、以及分子的大小等因素， sds 能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)sds 復(fù)合物， sds 所帶負(fù)電荷的量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差異，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。13.下列操作正確的是()a.分離紅細(xì)胞時(shí)采用低速長(zhǎng)時(shí)間離心b.紅細(xì)胞釋放出血紅蛋白只需要加入蒸餾水即可c.分離血紅蛋白溶液是低速短時(shí)間離心d.透析時(shí)要用20 mmol/l 的磷酸緩沖液，透析12 h答案d解析分離紅細(xì)胞時(shí)，采用低速短時(shí)間離心，如500 r/min 離心 2 min；分離血紅蛋白溶液時(shí)，離心時(shí)間較長(zhǎng)，如2 000 r/ min 離心 10 min。釋放血紅蛋白時(shí)，加入蒸餾水和40%

33、體積的甲苯；透析時(shí)用物質(zhì)的量濃度為20 mmol/l 的磷酸緩沖液，以除去相對(duì)分子質(zhì)量精品學(xué)習(xí)資料 可選擇p d f - - - - - - - - - - - - - - 第 12 頁(yè)，共 15 頁(yè) - - - - - - - - -精品學(xué)習(xí)資料 可選擇p d f - - - - - - - - - - - - - - 第 12 頁(yè)，共 15 頁(yè) - - - - - - - - -較小的雜質(zhì)。14.血紅蛋白是人和其他脊椎動(dòng)物紅細(xì)胞的主要組成成分，負(fù)責(zé)血液中 o2或 co2的運(yùn)輸。請(qǐng)根據(jù)血紅蛋白的提取和分離流程圖回答問(wèn)題。(1) 將 實(shí) 驗(yàn) 流 程 補(bǔ) 充 完 整 ： a為 _ ， b為_(kāi) 。

34、凝膠色譜法是根據(jù)_而達(dá)到蛋白質(zhì)分離的有效方法。(2)洗滌紅細(xì)胞的目的是去除_，洗滌次數(shù)過(guò)少，無(wú)法除去_；離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使_一同沉淀，達(dá)不到分離的效果。洗滌干凈的標(biāo)志是_ 。 釋 放 血 紅 蛋 白 的 過(guò) 程 中 起 作 用 的 是_ 。(3)在洗脫過(guò)程中加入物質(zhì)的量濃度為20 mmol/l的磷酸緩沖液(ph 為 7.0)的目的是_ 。如果紅色區(qū)帶_，說(shuō)明色譜柱制作成功。答案(1)血紅蛋白的釋放樣品的加入和洗脫相對(duì)分子質(zhì)量的大小(2)雜蛋白 (血漿蛋白 )血漿蛋白白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞離心后的上清液中沒(méi)有黃色蒸餾水和甲苯(3)準(zhǔn)確模擬生物體內(nèi)的生理環(huán)境，保持體外的ph 和體內(nèi)一致均勻一致地

35、移動(dòng)解析凝膠色譜法是根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法，在蛋白質(zhì)提取與分離過(guò)程中包括樣品的處理、粗分離、純化和純度鑒定四步，每一步均應(yīng)用了不同的操作技術(shù)，需要注意。15.如圖表示血紅蛋白提取和分離的部分實(shí)驗(yàn)裝置，請(qǐng)據(jù)圖回答下列問(wèn)題。(1)血紅蛋白是人和其他脊椎動(dòng)物紅細(xì)胞的主要組成成分，它在紅細(xì)胞中的作用體現(xiàn)了蛋精品學(xué)習(xí)資料 可選擇p d f - - - - - - - - - - - - - - 第 13 頁(yè)，共 15 頁(yè) - - - - - - - - -精品學(xué)習(xí)資料 可選擇p d f - - - - - - - - - - - - - - 第 13 頁(yè)，共 15 頁(yè) - - - - - - - - -白質(zhì)具有 _功能。(2)甲裝置中，b 是血紅蛋白溶液， 則 a 是_ ；乙裝置中， c 溶液的作用是 _ 。(3)甲裝置用于 _，目的是 _ 。用乙裝置分離蛋白質(zhì)的方法叫_，是根據(jù) _分離蛋白質(zhì)的有效方法。(4)用乙裝置分離血紅蛋白時(shí)，待_ 時(shí)，用試管收集流出液，每5 ml 收集一管，連續(xù)收集。答案(1)運(yùn)輸(2)磷酸緩沖溶液洗脫血紅蛋白(3)透析 (粗分離 )去除樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)凝膠色譜法相對(duì)分子質(zhì)量的大小(4)紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端解析用透析法 (如圖