間充質(zhì)干細(xì)胞在伊馬替尼耐藥中的作用研究

1、間充質(zhì)干細(xì)胞在伊馬替尼耐藥中的作用研究摘 要背景：伊馬替尼治療無效的慢性粒細(xì)胞白血病已被歸因于靜默白血 病干細(xì)胞對(duì)伊馬替尼無效。通過保護(hù)惡性祖細(xì)胞增殖和自我更新的功 能，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可能導(dǎo)致了白血病的持續(xù)存在和進(jìn)展。方法：從臨床缺鐵性貧血非口血病患者獲取骨髓，以密度梯度離心法結(jié)合 貼壁分離篩選法提取msc；從慢粒慢性期病人取骨髓，在ficoll淋 巴細(xì)胞分離液中離心獲得慢粒單個(gè)核細(xì)胞；用免疫磁珠法分離cd34+ 慢粒祖細(xì)胞；以流式細(xì)胞術(shù)對(duì)上述細(xì)胞進(jìn)行特性鑒定。慢粒細(xì)胞和人 間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)或慢粒細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)，加入1pm或5mm伊馬替尼, 用碘化丙噪染色錨定蛋白v雙重染色定量(pi-ane

2、xin v)測(cè)定伊馬 替尼誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡率。用western-blot法評(píng)價(jià)bcl-xl和bax蛋白 在伊馬替尼誘導(dǎo)凋亡中的保護(hù)作用。用定量遷移實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)msc對(duì)原代 慢粒細(xì)胞的趨化功能。結(jié)果:成功分離出msc及原代慢粒細(xì)胞，所獲取msc純度95%； cd34+細(xì) 胞純度95%。伊馬替尼誘導(dǎo)原代慢粒細(xì)胞凋亡具有劑量依賴性，與 間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，保護(hù)了慢粒細(xì)胞。與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，在 伊馬替尼濃度為1m1時(shí)，慢粒細(xì)胞死亡率從43.4±4.5降至 26.9±61%,在伊馬替尼濃度為5pm時(shí)，慢粒細(xì)胞死亡率從 76. 8 + 6. 3降至56. 5 + 5. 0%o weste

3、rn-blot測(cè)定表明，間充質(zhì)干細(xì) 胞升高了抗凋亡蛋白bel xl的表達(dá)約56倍。msc上清液對(duì)原代慢 粒細(xì)胞具有化學(xué)誘導(dǎo)活性，10.7 ±3.2%的原代慢粒細(xì)胞移向未稀釋 的上清液，遷移也是濃度依賴性的。結(jié)論：人間充質(zhì)干細(xì)胞保護(hù)伊馬替尼誘導(dǎo)的慢粒細(xì)胞凋亡?？赡芘c升高了 抗凋亡蛋白bel xl的表達(dá)有關(guān)。msc上清液對(duì)原代慢粒細(xì)胞具有濃 度依賴性的化學(xué)誘導(dǎo)活性關(guān)鍵詞：間充質(zhì)干細(xì)胞；伊馬替尼；耐藥慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myelocytic 1 eukemia, cml)簡(jiǎn)稱慢 粒，是起源于造血干細(xì)胞的惡性克隆增殖性疾病，冃前認(rèn)為其發(fā)病是 9號(hào)和22號(hào)染色體間相互易位導(dǎo)致，9

4、號(hào)染色體的abl原癌基因片段 與22號(hào)染色體的bcr片段融合產(chǎn)生bcr / abl基因，編碼酪氨酸激酶 活性成分，干擾細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。以前的治療多以 輕基腺為主，甲磺酸伊馬替尼(imatinib)問世后成為了慢粒治療的 首選藥物。伊馬替尼能競(jìng)爭(zhēng)性地抑制酪氨酸激酶與atp結(jié)合，阻止酪 氨酸激酶活化，起到了靶向治療的作用，使相當(dāng)高比例的病人獲得了 持久的緩解，從而改變了慢性粒細(xì)胞白血病的治療1。然而，大多 數(shù)的患者最終還是會(huì)復(fù)發(fā)，其原因?yàn)榈退降臍堄嗖∽儭Ｆ渲新Ｂ?性期患者大約4%對(duì)伊馬替尼存在原發(fā)耐藥，而加速期及急變期耐藥 高達(dá)40%和90%左右2 o伊馬替尼對(duì)慢粒的治療作用點(diǎn)

5、并非腫瘤干 細(xì)胞。在原代lin-cd34+cd38 -慢粒細(xì)胞中處于靜止期的bcr/abl 陽性的白血病干細(xì)胞是可以被檢測(cè)到的3,在伊馬替尼治療后仍然 存活3-6 o綜述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特性及臨床應(yīng)用進(jìn)展1867年，德國(guó)病理學(xué)家cohnheimt發(fā)現(xiàn)骨髓內(nèi)存在非造血功能的干 細(xì)胞，1976年，friedenstein和petrakova成功分離、培養(yǎng)出骨髓 間充質(zhì)干細(xì)胞，并證實(shí)其具有多向分化潛能lo 1991年caplan將 其定義為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞2。間充質(zhì)干細(xì)胞是中胚層發(fā)育的早期細(xì)胞，具有自我復(fù)制、自我更新 及多向分化能力，除骨髓外，廣泛分布于各種組織中。但因骨髓間充 質(zhì)t纟田胞(bon

6、e marrow derived mesenchymal stem cells, bmscs) 最容易獲取,是目前研究的熱點(diǎn)。在特定的條件下，間充質(zhì)干細(xì)胞可 被誘導(dǎo)分化為骨髓基質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、平 滑肌細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌 細(xì)胞等3, mscs的這種強(qiáng)大的分化潛能使得它在臨床上越來越受到 關(guān)注，目前mscs已成功應(yīng)用于心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、骨及軟骨 疾病等領(lǐng)域4 o mscs對(duì)造血干細(xì)胞起空間位置的機(jī)械支持作用，同 時(shí)還分泌多種生長(zhǎng)因子，對(duì)iiscs的自我更新及造血分化具有支持作 用，有助于維持hscs的未分化狀態(tài)，并在hscs的粘

7、附和歸巢中起重 要作用。此外，mscs對(duì)血液系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展起重要的作用。1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離間充質(zhì)干細(xì)胞存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)，甚至在胎盤絨毛和 羊水中也有mscs,相對(duì)來說以骨髓組織含量最高。骨髓組織中mscs 的含量也很少，約占骨髓單個(gè)核細(xì)胞的1/1041/105,但其擴(kuò)增能 力很強(qiáng)，pittenger等對(duì)mscs的分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增在1999的文章中 做了詳細(xì)報(bào)道3。成年人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞都是從骨盆骼骨中抽取，也可從脛骨、 股骨、脊椎中獲得。目前對(duì)骨髓骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、純化主要 有5種方法，包括貼壁分離篩選法、密度梯度離心法、免疫磁珠法, 特制培養(yǎng)板篩選法、流式細(xì)

8、胞儀分離法5。1）貼壁分離篩選法也稱 全骨髓貼壁培養(yǎng)法，是根據(jù)mscs貼壁生長(zhǎng)而造血干細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)的 特性對(duì)兩者進(jìn)行分離。抽取骨髓后直接加入培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，以 合適的細(xì)胞濃度進(jìn)行培養(yǎng)，早期造血細(xì)胞成分多，隨時(shí)間造血細(xì)胞壞 死，隨換液而不斷清除，培養(yǎng)皿表面包被細(xì)胞外基質(zhì)成分如明膠等可 促進(jìn)mscs貼壁，并得以純化。但所得細(xì)胞成分復(fù)雜，mscs的純度 不足。2）密度梯度離心法是根據(jù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與其他細(xì)胞密度 不同而采用淋巴細(xì)胞分離液將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離出來，再在培 養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，通過換培養(yǎng)基除去懸浮細(xì)胞，得到的細(xì)胞純度達(dá)95%。操作快速，對(duì)細(xì)胞的活性影響較小。3）免疫磁珠分離法即利用msc

9、s 的細(xì)胞表面抗原與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合，在磁場(chǎng)作用下分 離細(xì)胞。4）特制培養(yǎng)板篩選法主要是根據(jù)細(xì)胞大小進(jìn)行分離，r卩利用 一種有3um小孔的塑料培養(yǎng)皿從骨髓中篩選mscs,其均質(zhì)性98%。5） 流式細(xì)胞儀分離法根據(jù)mscs的細(xì)胞表面標(biāo)記,利用相應(yīng)的熒光素標(biāo) 記抗體進(jìn)行篩選。純度高，但細(xì)胞活性損失較大。故采用貼壁與密度 梯度離心相結(jié)合，操作快速，對(duì)細(xì)胞的活性影響較小并每次傳代嚴(yán)格 掌握消化酶的量和消化時(shí)間，保證骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在短暫的作用 時(shí)間內(nèi)與培養(yǎng)瓶底分開，淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞則因貼壁性強(qiáng)仍貼附與 瓶底，從而使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞得到純化。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)呈成纖維樣集落形成單位，

10、貼壁生長(zhǎng)。 采用全骨髓培養(yǎng)法，剛貼壁的細(xì)胞呈圓形、紡錘形或梭形，胞核居中， 有2個(gè)以上核。之后細(xì)胞增大，克隆形成并有突起，部分細(xì)胞呈三角 形或多角形。體外增殖迅速，生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定，而且隨著換液次數(shù)和傳 代次數(shù)的不斷增加，細(xì)胞純度不斷增加，均質(zhì)性不斷提高，細(xì)胞呈均 勻有序的成纖維細(xì)胞樣。2.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表而標(biāo)志間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)很多表面標(biāo)志，但并不是單一的，兼有間充質(zhì)、 內(nèi)皮和肌肉細(xì)胞的特征，包括粘附因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、受體 和整合素。但還沒有發(fā)現(xiàn)mscs獨(dú)特的表面標(biāo)志。目前mscs表面標(biāo)記大體可分為以下幾類6-9: 1）粘附分子：整合 素- q v 0 3、整合素- q v0 5、整合

11、素鏈q 1 q 5、整合素b 1 b 5、 icam-l、icam-2、vcam-l、laf-3、alcam-1、l-選擇素、內(nèi)皮素、cd44；2）細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子 il-1 a、il-6、il-7、il-8、il-ik il-12、 il14、il15、lif、scf、flt-3 配體、gm-csf、g-csf、m-csf； 3） 細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子受體：il-1r、il-7r、il-4r、il-6r、lifr、scfr、 g-csfr、ifnr、tnf-i r、tnf-iir、tgf-0 1r、tgf-b2r、bfgfr、 pdfgr、egfr； 4）相對(duì)特異性抗原：sh2、sh3、sh

12、4、stro-l、a- 平滑肌肌動(dòng)蛋口、mab1740； 5）細(xì)胞外基質(zhì)：膠原iiv型、蛋口聚 糖、纖維結(jié)合素、透明質(zhì)酸聚糖。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與造血干細(xì)胞共同存在于骨髓中，不表達(dá)典型造 血細(xì)胞表面抗原cd34、cd38、cd45、cd14等10,而只表達(dá)cd29、 cd44、cd90、cd105、cd166等表面標(biāo)志。部分研究檢測(cè)到成纖維細(xì) 胞和內(nèi)皮細(xì)胞的抗原標(biāo)志，可能與標(biāo)本來源、細(xì)胞傳代次數(shù)及培養(yǎng)調(diào) 節(jié)不同有關(guān)。組織來源、分離培養(yǎng)方法及種屬的不同，間充質(zhì)干細(xì)胞 的標(biāo)志物也有所不同。且間充質(zhì)干細(xì)胞所表達(dá)的這些抗原，在其他類 型的細(xì)胞中也有表達(dá)，并沒有特異性，這就使其研究、應(yīng)用存在很大 障礙。我

13、們?cè)趯?shí)際培養(yǎng)出的細(xì)胞不一定純凈，有報(bào)道稱表達(dá)cd45和 cdllb的b細(xì)胞祖細(xì)胞、粒系和單核細(xì)胞祖細(xì)胞會(huì)一直存在于培養(yǎng)過 程中。3 間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定由于mscs表面標(biāo)志的非特異性，對(duì)于mscs的鑒定還沒有較好的辦 法，dominici m于2006年發(fā)表了關(guān)于人mscs鑒定的最低標(biāo)準(zhǔn)11, 包括三個(gè)方而的內(nèi)容：1）在標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)條件下mscs能貼塑料瓶壁生 長(zhǎng);2) mscs 能表達(dá) cd105、cd73、cd90,不表達(dá) cd45、cd34、cd14 或 cdllb、cd79alpha 或 cd19、及 hla-dr 表面分子；3) mscs 在體外 能向骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及軟骨細(xì)胞分化。4

14、間充質(zhì)干細(xì)胞的分化潛能12-13骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在一定誘導(dǎo)條件下具有向中胚層細(xì)胞分化的能 力，如分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等，還具 有向外胚層的神經(jīng)元細(xì)胞及內(nèi)胚層的肝卵圓細(xì)胞分化的能力。1)向骨細(xì)胞分化用抗壞血酸、b-磷酸甘油、地塞米松孵育混合生長(zhǎng)的單層間充質(zhì)干 細(xì)胞2-3周，間充質(zhì)干細(xì)胞形成集落，其堿性磷酸酶表達(dá)增高，隨時(shí) 間發(fā)生鈣蓄積。2)向脂肪細(xì)胞分化與地塞米松、胰島素、口引口朵美辛、異丁基-甲基黃卩票吟孵育，可誘 導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化。細(xì)胞內(nèi)脂肪泡蓄積，最終脂肪泡融 合并填滿細(xì)胞，形成脂肪細(xì)胞。3）向肌細(xì)胞分化5-azacytidine可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向胚

15、胎和成年肌細(xì)胞分化。4）向神經(jīng)樣細(xì)胞分化小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞來源的成骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞自身在神經(jīng)生 長(zhǎng)因子和5-氮胞莒的作用小，分化為神經(jīng)細(xì)胞，表達(dá)成熟神經(jīng)元的 特異標(biāo)志，但這些神經(jīng)樣細(xì)胞缺乏產(chǎn)牛動(dòng)作電位的電壓門控通道。5）向軟骨細(xì)胞分化在三維培養(yǎng)模式下，在無血清營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基加入tgf-b成分，間充 質(zhì)干細(xì)胞會(huì)向軟骨細(xì)胞分化。5 間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫性特性mscs表達(dá)低水平主要組織相容性復(fù)合物ii類分子和fas配體，不表 達(dá)與人類口細(xì)胞抗原識(shí)別有關(guān)的共刺激分子b7-1. b7-2及主要組織 相容性復(fù)合物i類分子，因而不能識(shí)別異體基因抗原，并且因缺乏免 疫激活信號(hào)傳導(dǎo)中兩條共刺激通道，而導(dǎo)致免疫耐受，

16、故mscs是一 種免疫缺陷細(xì)胞，研究表而異基因mscs移植不存在hla屏障14, 從而為mscs廣泛用于造血干細(xì)胞移植提供了分子基礎(chǔ)。骨髓mscs除 具有低免疫原性及可移植性外，還具有免疫調(diào)節(jié)特性15-16 o mscs 對(duì)t淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的抑制作用與mscs的數(shù)量有關(guān)。研究表明mscs 可通過多種途徑發(fā)揮其對(duì)機(jī)體免疫細(xì)胞牛物活性的調(diào)節(jié)作用,mscs 能抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中或植物血凝素刺激引起的t淋巴細(xì)胞的 增殖，且這種抑制效應(yīng)是劑量依賴性大，mscs數(shù)量越大，其抑制作 用越強(qiáng)，但少量的mscs可增強(qiáng)t細(xì)胞的增殖能力，其表面抗原與 hla-dr抗原協(xié)同增強(qiáng)。agganwal等將人mscs和

17、無關(guān)供者來源的骨髓 單個(gè)核細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性t細(xì)胞比例增高，而treg細(xì)胞具有 潛在的免疫調(diào)節(jié)作用,可阻止gvhd的發(fā)生，故mscs可通過提高treg 細(xì)胞而誘導(dǎo)免疫耐受。6.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在血液病中的應(yīng)用1）骨髓mscs在血液病的發(fā)生、發(fā)展中的作用mscs能分化成骨髓微環(huán)境中的各種細(xì)胞成分并分泌多種細(xì)胞因子, 與造血細(xì)胞之間相互作用，對(duì)血液疾病的發(fā)展起了重要的作用。近年 的研究發(fā)現(xiàn)，mscs在口血病細(xì)胞惡性克隆的增殖、分化利凋亡中發(fā) 揮重要作用，骨髓基質(zhì)細(xì)胞能抑制化療藥物所致的白血病細(xì)胞凋亡 17,對(duì)白血病細(xì)胞起保護(hù)作用，可能是因?yàn)閙scs使白血病細(xì)胞阻 滯于g0/g1期，抑制了白血病

18、細(xì)胞的自然增殖，從而使白血病細(xì)胞得到保護(hù)，與化療藥物耐藥有一定關(guān)系。傳統(tǒng)認(rèn)為，慢性粒細(xì)胞性白血病是起源于造血干細(xì)胞的惡性克隆性 疾病，但有研究者18從cml源骨髓中分離出flk-1+mscs,其能在 單細(xì)胞水平分化為cml細(xì)胞，將其移植入小鼠體內(nèi)后，小鼠體內(nèi)可檢 測(cè)到bcr/abl基因，說明該群細(xì)胞可能作為cml腫瘤干細(xì)胞參與了疾 病的發(fā)生。再生障礙性貧血的發(fā)病也可能與mscs的異常相關(guān)19-20 o aa-mscs 與正常mscs在形態(tài)學(xué)和免疫表型上一致，但前者的生物學(xué)特性有所 不同。研究發(fā)現(xiàn)有以下特點(diǎn)：®aa-mscs體外增殖能力減弱；其抑 制mlr和植物血凝素誘導(dǎo)t細(xì)胞增殖的能力明顯降低；抑制t細(xì)胞 活化過程中ifn-丫的分泌能力也明顯減低；mscs下調(diào)t細(xì)胞對(duì)克 隆形成細(xì)胞的抑制效應(yīng)的作用消失。從而造成患者體內(nèi)細(xì)胞毒性t細(xì) 胞過度增殖，破壞再行干細(xì)胞，減少造血干細(xì)胞池，最終導(dǎo)致再障的 發(fā)生。2）骨髓mscs在造血干細(xì)胞移植中的應(yīng)用研究表明，在放化療及移植前的預(yù)處理中，骨髓微環(huán)境受到破壞， mscs受損，減弱了其對(duì)造血的支持及調(diào)控作用21-22 o骨髓mscs 與hscs共移植可促進(jìn)造血重建，并降低gvhd的發(fā)生率及程度，保留gvl效應(yīng)