乙型肝炎病毒核酸免提取熒光定量PCR方法應(yīng)用研究

1、    乙型肝炎病毒核酸免提取熒光定量pcr方法應(yīng)用研究    高潔嚴(yán) 敏付婷 邵中軍【摘要】目的：應(yīng)用免提取熒光定量pcr方法檢測(cè)乙型肝炎病毒核酸的含量，以研究分析熒光定量pcr方法在乙型肝炎疾病中的防治、確診、治療康復(fù)及分析病況等的醫(yī)療價(jià)值。方法：隨機(jī)將研究數(shù)據(jù)分成a、b、c 3個(gè)小組，采用酶聯(lián)免疫一吸附劑測(cè)定（elisa法）與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（pcr法）對(duì)乙型肝炎病毒核酸的含量水平進(jìn)行測(cè)定。第1組記為a組：hbsag（陽(yáng)性）、hbeag（陽(yáng)性）、hbcab（陽(yáng)性）的患者。第2組記為b組：hbsag（陽(yáng)性）、hbeab（陽(yáng)性）、hbcab（陽(yáng)性）的患者

2、，第3組記為c組：hbsag（陽(yáng)性）、hbcab（陽(yáng)性）的患者，組間進(jìn)行乙型肝炎病毒核酸的陽(yáng)性率及乙型肝炎病毒核酸含量的t檢驗(yàn)。結(jié)果：a組患者乙型肝炎病毒核酸的陽(yáng)性率為100%，明顯高于b組和c組的乙型肝炎病毒核酸的陽(yáng)性率，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p0.05）。c組患者的乙型肝炎病毒核酸的陽(yáng)性率為51. 83%，與a組的乙型肝炎病毒核酸的陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p0.0 5），患者的hbv-dna含量為7.7×l07copy/ml，與第a、b組的乙型肝炎病毒核酸的陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.0 5）。結(jié)論：免提取熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（pcr法）所測(cè)的乙型肝炎病毒核

3、酸的陽(yáng)性率比酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（elisa法）結(jié)果效果更好，在臨床中靈敏度高，具有一定的特異性，能夠精準(zhǔn)的反映出乙型肝炎患者體內(nèi)核酸的復(fù)制狀況，在臨床上對(duì)于研制抵抗病毒的藥物以及對(duì)于高效的選出最佳的抗病毒藥物，并且在患者的康復(fù)以及預(yù)后都具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值?！娟P(guān)鍵詞】乙型肝炎病毒；核酸；免提取熒光定量pcr檢測(cè)法；elisa法乙型肝炎病毒（hbv）簡(jiǎn)稱乙肝病毒，是一種dna病毒，是乙型肝炎的病原體，對(duì)人和猩猩具有極強(qiáng)易感性，且增長(zhǎng)率逐年增加，hbv是目前己知的感染人的最小的dna病毒之一，也是最難治愈的病毒之一，它長(zhǎng)期潛伏在細(xì)胞核中，具有很強(qiáng)的隱蔽性，即使抗病毒治療也很難完整清除，一旦患者長(zhǎng)

4、期使用免疫抑制劑或化療、放療將導(dǎo)致機(jī)體免疫力低下。hbv感染人體是一個(gè)連續(xù)、動(dòng)態(tài)的過(guò)程，常用的酶聯(lián)免疫一吸附劑測(cè)定（elisa法）檢測(cè)免疫標(biāo)志物可以顯示病毒的復(fù)制狀態(tài)，但其局限性也非常明顯，而免提取熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（pcr法）對(duì)于乙型肝炎病毒核酸含量水平的檢測(cè)過(guò)程可將hbv復(fù)制過(guò)程直接體現(xiàn)出來(lái)，該方法在敏感性和特異性方面表現(xiàn)突出。本文通過(guò)對(duì)乙肝患者血清中的病毒核酸進(jìn)行研究以期找到其與免疫標(biāo)志物的相關(guān)性進(jìn)而為hbv-dna檢測(cè)在乙型肝炎早期診斷、傳染性識(shí)別、病毒復(fù)制及臨床治療效果中提供以參考。1 材料與方法1.1 一般資料樣本來(lái)源：從2015年乙肝防治示范區(qū)的乙型肝炎患者中選取255例，以

5、上255名患者對(duì)本次樣本實(shí)驗(yàn)知情并自愿參加。1.2 試劑與方法（1）以免提取熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（pcr法）對(duì)乙型肝炎病毒核酸進(jìn)行檢測(cè)，試劑盒從蘇州科銘生物技術(shù)有限公司采購(gòu)，擴(kuò)增儀型號(hào)為proflex，檢測(cè)方法以試劑盒說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)并嚴(yán)格執(zhí)行操作，按照常規(guī)方法提取患者血清hbv_dna3。（2）乙型肝炎免疫標(biāo)志物采用采用酶聯(lián)免疫一吸附劑測(cè)定（elisa法）法進(jìn)行檢測(cè)，試劑盒從北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)有限公司采購(gòu)，酶標(biāo)儀型號(hào)為hbs1096b，檢測(cè)方法以試劑盒說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)并嚴(yán)格執(zhí)行操作。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析對(duì)所有數(shù)據(jù)用spss 19.o進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。計(jì)量資料以（x±s）進(jìn)行描述，以t檢驗(yàn)為檢驗(yàn)水準(zhǔn)

6、；計(jì)數(shù)資料記為（%），組間比較以x2檢驗(yàn)。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。2 結(jié)果hbv-dna的檢測(cè)情況（見(jiàn)表1）。3 討論乙型病毒性肝炎（ viral hepatitis type b）是由乙型肝炎病毒引起的以肝臟病變?yōu)橹鞯囊环N傳染疾病，臨床上常出現(xiàn)食欲減退、惡心、嘔吐、上腹部不適、肝區(qū)疼痛、乏力等主要表現(xiàn)，部分患者還伴有黃疸發(fā)熱、肝功能損傷等，有些患者甚至?xí)l(fā)展成肝硬化、肝癌等危及生命。臨床醫(yī)務(wù)工作者為了能夠減少乙型病毒性肝炎的發(fā)病率同時(shí)也為了能夠提高疾病的治療效果，他們以此為研究目的，通過(guò)對(duì)乙型肝炎病毒核酸陽(yáng)性率的測(cè)定以及平均含量的測(cè)量來(lái)提高臨床工作效率。本次研究中發(fā)現(xiàn)a組患者

7、血清中檢測(cè)出乙型肝炎病毒核酸的平均含量為7.5xl08copy/ml（陽(yáng)性率為100%），同時(shí)也反映了乙型肝炎病的核酸免提取熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)pcr定量檢測(cè)結(jié)果有著相對(duì)較高的陽(yáng)性率，可將hbv的復(fù)制過(guò)程更為直觀的體現(xiàn)出來(lái)。而對(duì)b組128例患者的血清中對(duì)hbv-dna檢測(cè)結(jié)果顯示其平均含量為9.5×l07copy/ml（陽(yáng)性率為52.4%），可明顯看出b組較a組陽(yáng)性率顯著減低，同時(shí)乙型肝炎病毒核酸的平均含量與a組差異度也較明顯（p<0.05），這表明與elisa模式相比，hbv-dna所具有的特異性和敏感性均較高，c組32例患者中對(duì)hbv-dna檢測(cè)結(jié)果顯示其平均含量為7.7xl07copy/ml（陽(yáng)性率為51.8%），說(shuō)明不能僅以elisa法的結(jié)果（陰性）就判定體內(nèi)乙型病毒性肝炎不發(fā)生復(fù)制，而pcr對(duì)于hbv-dna的含量的檢測(cè)能夠?qū)bv復(fù)制狀況更精準(zhǔn)的判斷進(jìn)而提供給臨床更好的服務(wù)。另外，在實(shí)際診斷中不能片面的將乙型病毒性肝炎的傳染性及病情嚴(yán)重程度用hbv-dna的含量去描述（二者不呈正相關(guān)），它也不是對(duì)治療效果進(jìn)行判斷的“金指標(biāo)”，臨床醫(yī)務(wù)工作者也應(yīng)該清醒地認(rèn)識(shí)到這一點(diǎn)。而以pcr法對(duì)hbv-dna的定量檢測(cè)增添了對(duì)體內(nèi)hbv變化的了解的一類新方法，其可將乙型肝炎免疫標(biāo)志物（兩對(duì)半）檢測(cè)的不足有效彌補(bǔ)。綜上