western+blotting實(shí)驗(yàn)操作步驟

1、 蛋白免疫印跡雜交（Western Blot, WB）WB是將蛋白樣本通過(guò)聚丙烯酰胺電泳按分子量大小分離，再轉(zhuǎn)移到雜交膜上，然后通過(guò)一抗/二抗復(fù)合物對(duì)靶蛋白進(jìn)行特異性檢測(cè)的方法。WB 是進(jìn)行微量蛋白質(zhì)分析比較成熟的技術(shù)之一。以下是總結(jié)Western Blot 操作方法及常見(jiàn)問(wèn)題分析，有助于成功完成WB。A第一部分：蛋白樣本提取制備蛋白樣品制備是Western Blotting的第一步，更是決定WB成敗的關(guān)鍵步驟，總體原則和注意事項(xiàng)：1. 盡可能提取完全或降低樣本復(fù)雜度只集中于提取目的蛋白（通過(guò)采用不同提取方法或選擇不同的試劑盒產(chǎn)品）；2. 保持蛋白處于溶解狀態(tài)（通過(guò)裂解液的pH 、鹽濃度、表面

2、活性劑、還原劑等的選擇）；3. 提取過(guò)程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修飾等，（低溫操作，加入合適的蛋白酶和磷酸酶抑制劑）；4. 盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子（通過(guò)加入核酸酶或采取不同提取策略）；5. 樣品分裝，長(zhǎng)期于-80中保存，避免反復(fù)凍融。方法的選擇u 自行配制抽提試劑，根據(jù)文獻(xiàn)方法或經(jīng)驗(yàn)提取 ；u 購(gòu)買商品化試劑盒，按其說(shuō)明書的方法提取 。Example 1：實(shí)驗(yàn)中提取腎臟總蛋白，具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下：1. 提前一天4解凍RIPA，一定要完全融化；配PBS（用于細(xì)胞試驗(yàn)則需高壓）；2. 配制裂解液：PMSF:RIPA=1:99,PMSF終濃度為100mM（根據(jù)樣本數(shù)配制所需的量，臨用臨配

3、）；3. 裂解組織：每個(gè)樣品稱取100mg，加1ml裂解液，勻漿后4靜置2h使其充分裂解，14000g，4離心10min，取上清。4. 蛋白定量：取少量上清稀釋30倍蛋白定量，然后計(jì)算出各樣本原液蛋白濃度。注意由于裂解液里含有較高濃度的洗滌劑，蛋白定量不能選用Bradford法，可以選用改良的Lowrys法或者BCA法。5. 樣品蛋白濃度均一化：根據(jù)蛋白定量計(jì)算的結(jié)果將各樣品蛋白濃度調(diào)整一致。具體方法為加入PBS稀釋至樣品濃度一致，本次蛋白濃度為3mg/ml。6. 分裝并存于-80，避免反復(fù)凍融。B 第二部分：相關(guān)試劑的配制：1. 10%的SDS（戴口罩稱?。悍Q取SDS10g，先加雙蒸水80

4、ml，再用磁力加熱攪拌助溶，然后定容至100ml。室溫保存，如在長(zhǎng)期保存中出現(xiàn)沉淀，可在50水浴溶化后，仍可使用。2. 1.5M Tris/HCL（pH8.8）Trisbase 18.17g，溶解于80ml雙蒸水，用濃鹽酸調(diào)pH至8.8，最后定容至100ml，室溫下保存。3. 0.5M Tris/HCL（pH6.8）Trisbase 6.06g，溶解于80ml雙蒸水，用濃鹽酸調(diào)pH至6.8，最后定容至100ml，室溫下保存。4. 30%丙烯酰胺/0.8%N,N-亞甲丙烯酰胺 丙烯酰胺（Acr）75g甲叉雙丙烯酰胺2g加雙蒸水150ml，37加熱溶解后，定容至250ml，查證該溶液pH應(yīng)不大于7

5、.0，4棕色瓶保存。使用時(shí)恢復(fù)至室溫且無(wú)沉淀。Be careful!：丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性并可通過(guò)皮膚吸收，其作用具有累積性。稱量丙烯酰胺和N,N-亞甲丙烯酰胺時(shí)應(yīng)戴手套和口罩?？烧J(rèn)為聚丙烯酰胺無(wú)毒，但也應(yīng)謹(jǐn)慎操作，因?yàn)樗€可能含有少量未聚合材料。5. 上樣緩沖液0.5mM Trisbase(pH6.8)2.5ml甘油2.0ml10SDS4.0ml0.4%溴酚藍(lán)（mw669.97）1ml二巰基乙醇（mw78.14）0.5ml注：配好后分裝-20保存。6. 電泳緩沖液10倍儲(chǔ)存液1倍應(yīng)用液Trisbase30g3g甘氨酸144g14.4gSDS10g1g加水至1000ml，PH值用HCl調(diào)

6、8.3(不調(diào)PH亦可用，為什么？)。已經(jīng)配制了1000ml的儲(chǔ)存液。電泳緩沖液用應(yīng)老師的電泳槽應(yīng)用液300ml。用10倍的儲(chǔ)存液30ml加入水270ml。7. 轉(zhuǎn)移緩沖液（臨用臨配，鐵盒子里攪拌混勻并4預(yù)冷）：Tris base甘氨酸H2O（ml）甲醇（ml）終體積（ml）0.606g2.88g160402002.424g11.52g6401608002板膠轉(zhuǎn)移緩沖液的用量約為200ml。8. 洗滌緩沖液（TBS）10倍儲(chǔ)存液1倍應(yīng)用液Tris base24.2g2.42gNaCl80g8g加水800ml，用HCL調(diào)整PH為7.6，再加水至1000ml，已經(jīng)配制了1000ml的TBS液，臨用時(shí)

7、再加0.1%的Tween-20。一般做兩板膠要用洗滌緩沖液500ml；用儲(chǔ)存液50ml加入450ml水，后加0.5ml Tween-20。9. 封閉緩沖液（5%脫脂奶粉）10ml/膜脫脂奶粉2g洗滌緩沖液40ml兩板膠4張膜要用封閉緩沖液40ml。具體實(shí)驗(yàn)步驟：準(zhǔn)備：準(zhǔn)備器材：10%過(guò)硫酸銨；冰盒；預(yù)熱恒溫加熱器；拿出試劑（雙丙和TEMED提前從冰箱拿出平衡，否則凝膠過(guò)程產(chǎn)生的熱量會(huì)使低溫時(shí)溶解于儲(chǔ)存液中的氣體析出而導(dǎo)致氣泡）；電泳儀器；洗干凈的板子和梳子；濾紙條用于吸水；剪刀；尺子；剪好的膜（根據(jù)目的蛋白分子量以及樣品個(gè)數(shù)決定）及比膜稍大些的干凈濾紙；脫脂奶粉；干凈的裝封閉液的容器約50ml

8、大小；提前清洗玻璃板并晾干：注意不要用清潔球之類的粗糙物品清洗玻璃板，可用洗潔精泡約2h，用自來(lái)水沖洗后再用蒸餾水沖洗干凈，置于架子上晾干。做膠分離膠：1. 先稱取過(guò)硫酸胺，配兩板膠用10的過(guò)硫酸胺150l，一般要稱取過(guò)硫酸胺0.2-0.3mg，溶解到相應(yīng)量的雙蒸水中，混勻。分離膠（括號(hào)里為2板膠的用量）試劑7.5101215水(ml)4.9 (7.35)4.1(6.15)3.4(5.1)2.4(3.6)(ml)1.5MTris/HCl(pH=8.8)2.5(3.75)2.5(3.75)2.5(3.75)2.5(3.75)丙/雙丙烯酰胺2.5(3.75)3.3(4.95)4.0(6.0)5.0

9、(7.5)10%SDS100,(150)100,(150)100,(150)100,(150)10%過(guò)硫銨(µl)50,7550,7550,7550,75TEMED10,1510,1510,1510,15適用蛋白分子量100kDa60-100kDa20-60kDa20kDa玻板間夾上膠條，用夾子將兩塊玻板夾緊。按以上方法配膠，加入TEMED 后立即搖勻即可灌膠。灌膠時(shí)，可用10ml 槍吸取5ml 膠沿玻璃放出，將膠加入到玻璃板的夾層中。加入的量略高于夾子的最高處（或者膠面升到綠帶中間線高度時(shí)即可）加好后加入1ml的水壓膠。做分離膠時(shí)，凝固時(shí)間大約為2540分鐘，要根據(jù)溫度來(lái)確定。一般

10、可以依據(jù)剩下在離心管中的膠的凝固情況來(lái)確定膠的凝固。當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說(shuō)明膠已凝了。再等3min 使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。注意：v 舊的1.0mm的板子短的玻璃在里面，新的在外面。v 過(guò)硫酸銨一般現(xiàn)配現(xiàn)用。v 注意各種試劑加入的順序，“三大三小”，后面加過(guò)硫酸銨，最后加TEMED。v 配制過(guò)程中每加入一種試劑要充分混勻，防止膠出現(xiàn)濃度不均的情況。v 要根據(jù)溫度調(diào)整TEMED的使用量。夏天凝結(jié)的快，冬天凝結(jié)的慢。冬天如果凝結(jié)的慢，兩板膠可以加TEMED 20-30µl。v 水封的時(shí)候水要慢慢加入，太快會(huì)導(dǎo)致膠面不平，封膠后切記勿動(dòng)。v 膠通常在0.51

11、h內(nèi)凝集最好，過(guò)快膠太硬易龜裂，而且電泳時(shí)容易燒膠。下一步實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備a 準(zhǔn)備樣品：1 預(yù)熱微量恒溫器（98）；2 準(zhǔn)備一套中EP管并標(biāo)記，以用于混勻樣品和上樣緩沖液；3 取出樣品，marker，上樣緩沖液置于冰上；4 樣品：上樣緩沖液=3:1混勻，置于微量恒溫器上98 5min變性；b 配制電泳緩沖液；c 配4濃縮膠，TEMED臨用時(shí)加。濃縮膠（括號(hào)里為2板膠用量）水3.00ml(4.5ml)0.5MTris/HCl(PH=6.8)1.25ml(1.875ml)丙/雙丙烯酰胺（30%/0.8%）0.67ml(1.005ml)10%SDS50µl(75l)過(guò)硫酸胺（10）50l(75l)

12、TEMED5l(15l)膠凝固后，迅速向上將梳子拔下，將玻璃板夾上電泳架，完整的玻璃板在外圍。電泳槽中倒入電泳緩沖液（約300ml）。加足夠的電泳液后開(kāi)始準(zhǔn)備上樣。（電泳液至少要漫過(guò)內(nèi)側(cè)的小玻璃板）。注意：濃縮膠的加入很重要，由于其硬度比分離膠小，而且還要加入梳子，掌握其凝固的時(shí)機(jī)很重要。太遲膠要粘住梳子，太早膠凝固不好。用Bio-Rad的玻璃板用TEMED 15l，在溫度為22時(shí)凝固的時(shí)間為10分鐘左右，溫度再高一些可以達(dá)到89分鐘，低一些可以延長(zhǎng)一些。膠的凝固很快，主要是加入TEMED后的動(dòng)作要迅速，以免在離心管中凝固了。加入的量要與玻璃板的最高線平行。灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有

13、氣泡產(chǎn)生。插梳子時(shí)要使梳子保持水平。由于膠凝固時(shí)體積會(huì)收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過(guò)程中要經(jīng)常在兩邊補(bǔ)膠（其實(shí)說(shuō)經(jīng)常有點(diǎn)過(guò)了，補(bǔ)12 次就行了，不補(bǔ)膠問(wèn)題也不大）。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。插梳子要用力均勻，一次成型，且要注意梳子插入時(shí)哪面朝內(nèi)哪面朝外。加樣（加變性后的樣品）：用微量進(jìn)樣器或加樣吸頭吸入樣品20l，加入到加樣孔中。用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出時(shí)不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。）加入下一個(gè)樣品時(shí)，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次，以

14、免交叉污染。在第一孔和最后一孔加20µl上樣緩沖液以避免邊緣效應(yīng)，第二孔加3µl marker，其他孔加20µl樣品（樣品加樣20-30µl都可以，但不超過(guò)30µl,加樣量取決于蛋白濃度），保證每個(gè)上樣孔蛋白濃量為30-50µg。電泳：100V，電泳2小時(shí)，電泳時(shí)要注意電泳槽上的電泳緩沖液的量，較少時(shí)，要從下槽中吸取一部分轉(zhuǎn)移到上槽。有時(shí)電泳的時(shí)間用不到2小時(shí)，要依據(jù)溴酚藍(lán)的位置確定是否要停止電泳。通常電泳時(shí)溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。轉(zhuǎn)膜：蛋白因結(jié)合SDS 而帶電荷，在電場(chǎng)下從膠中轉(zhuǎn)至膜上，轉(zhuǎn)膜操作根椐電轉(zhuǎn)儀制造商的說(shuō)明書

15、進(jìn)行轉(zhuǎn)膜方式分為半干和濕轉(zhuǎn)兩種，半干式轉(zhuǎn)膜速度快，而濕式成功率高并特別適合用于分子量大于100 kDa的蛋白。要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時(shí)候動(dòng)作要輕，要在兩個(gè)邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會(huì)兒玻璃板便開(kāi)始松動(dòng)，直到撬去玻板。（撬時(shí)一定要小心，膠很易裂，要用巧勁）除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調(diào)整使其與濾紙對(duì)齊，輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜蓋于膠上，要蓋滿整個(gè)膠，（膜蓋下后不可再移動(dòng)）并去除氣泡。準(zhǔn)備：1. 電泳期間，剪好濾紙和膜，寬度由marker及目的蛋白分子量確定，長(zhǎng)由加樣孔數(shù)決定；2. 配置轉(zhuǎn)膜緩沖液并預(yù)冷；3. PVDF膜

16、用甲醇活化（目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時(shí)多加甲醇也是這個(gè)目的）。Ø 半干法轉(zhuǎn)膜：電泳完畢后，用卡片從一角的縫隙撬下一塊玻璃板，注意用力適度，用刀將沒(méi)用的膠切除：濃縮膠，加樣孔以外的膠，和溴酚藍(lán)下方的膠。先將PVDF膜和海綿泡在轉(zhuǎn)移緩沖液中，將PVDF膜做好標(biāo)記：剪刀剪下其一邊的兩角，一大，一小。將上述東西置于半干轉(zhuǎn)膜儀器上，“三明治”從下往上的順序依次是：（）濾紙-膠-膜-濾紙（）。用電轉(zhuǎn)緩沖液稍微潤(rùn)濕，轉(zhuǎn)膜100mA 1.5h。注意防止轉(zhuǎn)膜時(shí)電源插反。Ø 濕法轉(zhuǎn)膜：“三明治”從下往上的順序依次為：()海綿-濾

17、紙-膠-膜-濾紙-海綿()，三明治安放的方向確認(rèn)正確，負(fù)極方為帶負(fù)電的膠里的蛋白，向正極方（膜）的電遷移。100mA轉(zhuǎn)膜一個(gè)半小時(shí)即可。夾的黑面對(duì)槽的黑面，夾的白面對(duì)槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來(lái)降溫。蛋白帶負(fù)電，膜要靠近正極注意：1. 避免用手直接接觸膜，應(yīng)使用鑷子，手指上的油脂與蛋白會(huì)封閉轉(zhuǎn)膜效率并易產(chǎn)生背景污斑；2. 用卡片把玻板撬開(kāi)時(shí)注意用力要輕以免損壞玻板；3. 把膠從玻板上剝離時(shí)要保持膠的完整性，以及膠和膜之間不能有氣泡。若有氣泡則可用小玻棒輕輕滾下趕走氣泡；4. 濾紙膠膜之間的大小，一般是濾紙膜膠。5. 轉(zhuǎn)膜前要在轉(zhuǎn)膜緩沖液里平衡一下防止膠變形，也有助于進(jìn)一步去掉

18、可能有礙于轉(zhuǎn)膜的雜質(zhì)。還有人在這一步浸泡幫助蛋白復(fù)性，可以直接在膠上檢測(cè)蛋白活性。封閉：轉(zhuǎn)膜完成后，將膜從轉(zhuǎn)膜夾中取下，將膜用TBS從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉 1h。注意要將貼膠的一面朝上（正面）比如半干轉(zhuǎn)膜時(shí)拿出的要反過(guò)來(lái)封閉，在后面洗脫，孵抗體，顯影時(shí)都是正面朝上的放在封閉盒子中，加入封閉液。4過(guò)夜。注意：如果選用AP作為顯色方法，封閉時(shí)就要選擇Tris緩沖系統(tǒng)，不要用PBS，因?yàn)镻BS滋擾AP。洗脫（10mim/次，洗脫3次）：第二天，將封閉液倒掉，加入洗脫緩沖液，室溫下?lián)u10分鐘，倒掉；再加入洗脫緩沖液，室溫下?lián)u10分鐘，倒掉；加入洗脫緩沖液，搖1

19、0分鐘，倒掉。一抗孵育：準(zhǔn)備：l 拿出配制抗體的新管子并標(biāo)記（抗體名稱，稀釋比例，配制日期及所有人）；l 抗體的稀釋：用洗脫緩沖液稀釋eg.1:200，則10µl加2ml洗脫緩沖液；l 一抗原液用之前要12000rpm離心20s或者用手輕彈使蛋白混勻。步驟：加入一抗每小盒2ml（皿用5ml），室溫下?lián)u動(dòng)孵育2小時(shí)。2h后回收一抗。洗脫：步驟同前（10mim/次，洗脫3次）。二抗孵育：準(zhǔn)備：l 拿出配制抗體的新管子并標(biāo)記（抗體名稱，稀釋比例，配制日期及所有人）；l 二抗的稀釋直接依照稀釋倍數(shù)用洗脫液稀釋；l 二抗原液用之前要12000rpm離心20s或者用手輕彈使蛋白混勻。步驟：加入二

20、抗每小盒2ml（皿用5ml），室溫下?lián)u動(dòng)孵育2小時(shí)。1h后回收二抗。洗脫：步驟同前（10mim/次，洗脫3次），注意洗第三遍后，不要立即將洗脫緩沖液倒掉。顯影：辣根過(guò)氧化物酶HRP-ECL發(fā)光法：1) 配置顯影液：2張膜配A和B液各700µl并混勻。2) 準(zhǔn)備U盤或者刻錄盤，1000槍，槍頭，籃子，方蓋子，鑷子，濾紙，1.5EP管，顯影液。3) 將膜從盒中夾出，濾紙貼角吸干，正面朝上平整的放在方蓋子里，將顯影劑用槍打到膜上，盡量不要讓膜在盒子里挪動(dòng)，均勻的在膜上澆顯影液35min，倒掉顯影液，并用濾紙拭干周圍。4) 把膜放入機(jī)器（正面朝上），打開(kāi)電腦，snap軟件，此時(shí)再推進(jìn)機(jī)器，按

21、鈕變成藍(lán)色，界面中間部分有2個(gè)圖標(biāo)，左邊為單個(gè)拍照，時(shí)間在其下調(diào)試；另一個(gè)為連續(xù)拍照，點(diǎn)擊圖標(biāo)后輸入曝光時(shí)間（推薦30s，可跟據(jù)試劑情況延長(zhǎng)到幾分鐘），3次即可，顯影后，另存為As，再保存張export as TIFF格式。AP-NBT/BICP顯色法：原理：本試劑盒采用BCIP和NBT為底物，可由標(biāo)記于二抗上的AP催化，產(chǎn)生化學(xué)顯色反應(yīng) ，在蛋白轉(zhuǎn)印膜陽(yáng)性蛋白條帶處形成藍(lán)紫色沉淀，適用于使用AP標(biāo)記抗體的Western blot。與化學(xué)發(fā)光類試劑相比，本產(chǎn)品使用方便，可快速獲得結(jié)果；但檢測(cè)靈敏度不及化學(xué)發(fā)光類試劑。使用方法：用平頭鑷子將膜取出，膜的下緣輕輕接觸吸水紙，去除膜上多余的漂洗液；正

22、面朝上平整的放在干凈的方蓋子上，將顯影劑用槍均勻澆到膜上，盡量不要讓膜在盒子里挪動(dòng)，并用不透明物體（如報(bào)紙）遮擋光線，室溫孵育515min，顯色20s后每10s觀察一次，至條帶明顯或有本底出現(xiàn)時(shí)用蒸餾水洗滌12次即可終止顯色反應(yīng)，放濾紙上晾干即可觀察與掃描。WB過(guò)程中常見(jiàn)的問(wèn)題及可能原因分析 問(wèn)題 可能原因驗(yàn)證或解決辦法轉(zhuǎn)膜不充分膜沒(méi)有完全均勻濕透使用100% methanol浸透膜靶蛋白分子量小于10,000選擇小孔徑的膜，縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間靶蛋白等電點(diǎn)等于或接近轉(zhuǎn)移緩沖液pH值可嘗試使用其他緩沖液如CAPS緩沖液（pH 10.5)或使用低pH值緩沖液如乙酸緩沖液甲醇濃度過(guò)高過(guò)高甲醇濃度會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)與SDS分離，從而沉淀在凝膠中，同時(shí)會(huì)使凝膠收縮或變硬，從而抑制高分子量蛋白的轉(zhuǎn)移。降低甲醇濃度或者使用乙醇或異丙醇代替轉(zhuǎn)移時(shí)間不夠Thick gel對(duì)于厚的膠以及高分子量蛋白需要延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間背景高膜沒(méi)有完全均勻濕透使用100% methanol浸透膜洗膜不充分增加洗液體積和洗滌次數(shù)阻斷不充分增加封閉液孵育時(shí)間，或者提高溫度。選擇合適的封閉試劑（脫脂奶粉，BSA，酪蛋白等）二抗?jié)舛冗^(guò)高降低二抗?jié)舛葯z測(cè)過(guò)程中膜干燥保證充分的反應(yīng)液，避免出現(xiàn)干膜現(xiàn)象曝光過(guò)度縮短曝光時(shí)間抗體與阻斷蛋白有交叉反應(yīng)檢測(cè)抗體與阻斷蛋白的交叉反應(yīng)性，選擇無(wú)交叉反應(yīng)的封閉劑。洗滌液中加入Tween-20可