PEG誘導細胞融合

1、peg誘導細胞融合李卓王慧琴楊佳慧王鐘秀細胞融合 自發(fā)條件下或人工誘導下，兩個或兩個以上的同種基因型或異種基因型的細胞融合成一個細胞的過程稱為細胞融合，也稱細胞雜交。 同種細胞能夠自發(fā)融合，是機體重要的生命活動，如有性生殖時配子的融合。 異種細胞的融合必須經(jīng)過誘導劑處理，進行誘發(fā)融合。細胞融合技術 是指細胞通過誘導和培養(yǎng)，在離體條件下用人工方法使不同種細胞發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合從而形成雜種細胞，使其同時具有兩種細胞的遺傳和生物特性。 常用的人工誘導方法包括：病毒誘導法、電刺激法、聚乙二醇誘導法。細胞融合發(fā)展史1. 自然發(fā)生的細胞融合 早在19 世紀人們就發(fā)現(xiàn)在自然條件下生物界中有自發(fā)的細

2、胞融合現(xiàn)象。muller 1838 年在腫瘤中觀察到了多核細胞此后在由病毒感染的病料組織中如天花膿皰的周圍、受水痘損害的皮膚、在麻疹病人的扁桃體中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多核細胞這些多核細胞可能是病毒作用的結(jié)果：但當時還沒有人認識到這一點。1875 年lange 首先觀察到脊椎動物蛙類血液細胞合并，繼之又有一些研究者在無脊椎動物中也發(fā)現(xiàn)了融合細胞。2.peg作為促融劑引起的革命、 由于病毒誘導細胞融合存在著病毒制備困難、操作復雜、滅活病毒的效價差異大等原因,科學家們又嘗試尋找比病毒簡便、快速和高效且比病毒更易制備和控制、活性穩(wěn)定、使用方便的化學peg加拿大華裔科學家高國楠等( 1974 年) 的研究取得重大突

3、破他發(fā)現(xiàn)高分子量的聚乙二醇( peg) 在ca2 +存在時能促使植物原生質(zhì)體融合顯著提高融合率從而迅速推動了原生質(zhì)體技術的基礎研究和應用研究。至此應用原生質(zhì)體和發(fā)展操縱它們的方法已引起實驗生物學的“無聲革命”。 , 同時, pontecorvo ( 1975 年)發(fā)現(xiàn)peg能誘導哺乳動物細胞融合并產(chǎn)生雜交細胞。1976 年davidson等對此作了進一步證實。以后的研究工作表明, peg不僅可以促使植物、動物、微生物的細胞融合,而且還能促使動物細胞與植物的原生質(zhì)體發(fā)生融合,促使微生物原生質(zhì)體與動物細胞融合, 使植物原生質(zhì)體攝入微生物。1975 年ahkono報道用peg將母雞的紅血球細胞和酵母

4、菌的原生質(zhì)體融合成功1976 年dudus等報道人的細胞能和胡蘿卜的原生質(zhì)體發(fā)生融合。davey ( 1972 年)和vasil( 1977 年)用植物原生質(zhì)體攝取了細菌細胞。 1975 年，在動物體細胞雜交技術的基礎上又創(chuàng)立了淋巴細胞雜交瘤技術。同體細胞融合一樣, 雜交瘤工作早期使用的促融劑滅活的仙臺病毒, 已逐漸為化學促融劑peg 所取代。davidson 等于1976年建立的以peg誘發(fā)哺乳類細胞融合的方法, 也同樣適用于淋巴細胞同瘤細胞的融合。由于淋巴細胞雜交瘤技術能制備純度高、專一性強的抗體,適于由未純化的抗原大量制備,因而在短短幾年時間里,即已被廣泛用于制備各種單克隆抗體。peg誘

5、導細胞融合peg作用機制 聚乙二醇（peg）是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚體。peg是一種特殊的脫水劑，可與水借氫鍵結(jié)合，導致細胞脫水而發(fā)生質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的變化，使細胞相互接觸部位的膜脂雙層中磷脂分子發(fā)生疏散，進而使其結(jié)構(gòu)發(fā)生重排，再加上膜脂雙層的相互親和以及彼此間表面張力的作用，引起相鄰的重排質(zhì)膜在修復時相互合并在一起，使細胞的胞質(zhì)溝通，從而造成相互接觸的細胞之間發(fā)生融合。peg的最適使用條件 細胞的融合效果與peg的相對分子質(zhì)量及其體積分數(shù)成正比，但peg的相對分子質(zhì)量越大、體積分數(shù)越高，對細胞的毒性也就越大。實驗時常選用peg相對分子質(zhì)量為4000-6000，體積分數(shù)為50%

6、時，細胞破碎較少，融合率較高。其他影響細胞融合的因素 鈣離子可以使帶微弱負電荷的peg與細胞膜表面分子相互作用，引起細胞膜表面電子分布的改變，從而使接觸處的質(zhì)膜形成局部融合，出現(xiàn)凹陷，構(gòu)成原生質(zhì)橋，成為細胞間通道并逐漸擴大，直到兩個細胞全部融合。當鈣離子濃度為50mmol/ml時，融合效果最好。實驗結(jié)果： 觀察到兩個或多個細胞發(fā)生質(zhì)膜融合但核尚未融合，有的則是細胞間不僅發(fā)生質(zhì)膜融合，而且細胞核也發(fā)生了融合。 剛開始融合 開始進行核融合分析討論 聚乙二醇分子能改變各類細胞的生物膜結(jié)構(gòu)，使兩細胞接觸點處質(zhì)膜的脂類分子發(fā)生疏散和重組，使細胞發(fā)生融合，形成融合細胞。本次實驗用聚乙二醇處理雞紅血細胞并制

7、片利用顯微鏡觀察。 由實驗結(jié)果可得，雞血紅細胞兩個或者更多出現(xiàn)不同程度的相互融合，但總體來說融合率還是不錯的。經(jīng)分析主要是以下原因： 由于peg與雞血紅細胞懸濁液接觸時間適宜， peg與雞血紅細胞充分接觸，從而融合率比較高。實驗注意事項：1. 由于離心時紅細胞的數(shù)量很少，吸取的時候要小心，盡量把吸附在管壁上的紅細胞都吸出來。此外吸取的動作不能太大，否則會破壞離心形成的分層。2. peg處理時間不宜過長，最多不能超過90s，否則會有多個細胞彼此融合形成巨大的合胞體，或者細胞膜破裂導致細胞質(zhì)外泄。3. 經(jīng)peg處理后加液混勻時應輕輕洗打，以免剛剛?cè)诤系募毎珠_。4. 加peg應該在37c水浴加，這

8、樣可以防止peg凝固，導致離心失敗。5. 注意每次離心的時間和速度，否則得不到想要的紅細胞。新的細胞融合方法 細胞融合技術在生物科學各領域取得進展的同時,從事細胞融合研究的科學工作者一直沒有放棄尋找具有更高融合效率的方法。雖然用peg 作介質(zhì)誘導細胞融合具有上述優(yōu)點,但peg 誘導細胞融合也存在一些內(nèi)在的問題,如peg 在有效的濃度范圍內(nèi)( 50 % 55 % )對細胞毒性很大,因此人們又試圖尋找新的方法來替代peg 介導細胞融合法。 電脈沖誘導細胞融合技術 激光融合技術 空間細胞融合技術 離子束細胞融合技術 非對稱細胞融合技術 縱觀細胞融合技術的發(fā)展歷史, 細胞融合技術的不斷改進一方面表現(xiàn)在

9、融合劑上, 另一方面體現(xiàn)在新方法上, 再者體現(xiàn)在融合對象的不斷擴展上。融合劑走過了從活病毒,滅活病毒生物階段到peg 化學物質(zhì)階段; 新方法不斷涌現(xiàn), 從生物學, 化學方法,物理學方法過渡到各種方法的綜合應用乃至應用空間技術。融合對象從動物,植物到微生物,從種內(nèi)擴展到種間, 從近緣擴展到遠緣。每一次技術上的更新和改進都會帶來應用上的巨大革命和創(chuàng)新, 達到為人類服務的目的。細胞融合技術的應用及發(fā)展前景 從細胞融合技術發(fā)展的歷程可以看到, 伴隨著細胞融合技術的每一次革新和改進, 都會迅速在各個領域得到充分的應用, 然后在實際應用中又不斷發(fā)現(xiàn)新的問題,在解決實際問題中又促使細胞融合技術躍上一個又一個新的臺階, 使其日臻完善。動物細胞融合、植物細胞融合、微生物細胞融合以及三者之間的細胞融合不斷應用于基礎理論研究和人類生產(chǎn)實際。如創(chuàng)造新物種、培育動物新品種、植物育種、種質(zhì)保存、無性系的快速繁殖、獲得優(yōu)良的微生物菌種以及藥