禽巴氏桿菌病病原的分離與鑒定(以發(fā)表)

1、 禽巴氏桿菌病病原的分離與鑒定* *（*動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 *）禽巴氏桿菌病又叫禽霍亂和禽出血性敗血癥，是禽類(lèi)的一種常見(jiàn)接觸性敗血性傳染病，各種類(lèi)型的禽均可感染并導(dǎo)致死亡。其特征表現(xiàn)為急性敗血過(guò)程，發(fā)病率和死亡率都很高。低毒感染或急性發(fā)病之后，可出現(xiàn)慢性的、局部性的疾病。（一）、病原1、形態(tài)染色禽巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌引起的，多殺性巴氏桿菌為卵圓形的短小桿菌，少數(shù)近于球形，長(zhǎng)約0.62.5 um（微米），寬約0.20.4 um，無(wú)鞭毛，不能運(yùn)動(dòng)，不形成芽胞。革蘭氏染色陰性，多呈單個(gè)或成對(duì)存在。在組織，血液和新分離培養(yǎng)物中的菌體用美藍(lán)、瑞氏、姬姆薩氏法染色均可著色，菌體呈明顯的倆極著色，

2、中間部分著色較淺，很像許多并列的兩個(gè)球菌，所以又叫兩極桿菌。血清型菌株有莢膜，用印度墨汁等染料染色時(shí)，可以見(jiàn)到清晰的莢膜。人工培養(yǎng)后及弱毒株，莢膜不明顯或消失。2、培養(yǎng)特征巴氏桿菌為需氧兼性厭氧菌。在普通培養(yǎng)基上可生長(zhǎng)，37培養(yǎng)1824h（小時(shí)），可見(jiàn)灰白色，半透明，光滑，濕潤(rùn)，隆起，邊緣整齊的露滴狀小菌落，直徑約12 mm（毫米）。本菌在鮮血瓊脂，血清瓊脂或馬丁瓊脂平皿上培養(yǎng)，生長(zhǎng)良好，不溶血。在肉湯中培養(yǎng)時(shí)，初期呈均勻混濁，24h后上清清亮，管底有灰白色絮狀沉淀，輕搖時(shí)呈絮狀上升。新分離的細(xì)菌接種到馬丁瓊脂平皿上，通過(guò)45°折光觀察，可見(jiàn)菌落有熒光，呈橘紅色帶金光，邊緣有乳白色光

3、帶，結(jié)構(gòu)細(xì)致，邊緣整齊，稱為Fo型菌落，對(duì)雞等禽致病力強(qiáng)；另一類(lèi)菌落呈藍(lán)綠色而帶金光，邊緣有紅黃色光帶，稱為Fg型菌落，對(duì)雞等禽致病力較弱。該菌可利用果糖，甘露糖，蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；不能利用肌醇乳糖，靛基質(zhì)，過(guò)氧化氫酶，氧化酶和硝酸鹽還原陽(yáng)性，尿素酶陰性，不液化明膠，在麥康凱培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)，普通瓊脂上發(fā)育不良或不發(fā)育。3、種類(lèi)多殺性巴氏桿菌的抗原結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，分類(lèi)方法有很多種，Garter在1955年用間接血凝試驗(yàn)根據(jù)細(xì)菌莢膜將其分為A、B、D、E四個(gè)型。Rimler于1987年又發(fā)現(xiàn)一種新的莢膜血清型F，17Namioka用鹽酸除去莢膜做交叉凝集試驗(yàn)，將該菌分為112個(gè)菌體血清型。至此，本菌

4、的血清型可以用莢膜血清型和菌體血清型合并表示，以阿拉伯?dāng)?shù)字表示菌體抗原，大寫(xiě)英文字母表示莢膜抗原，如5：A。禽巴氏桿菌多屬A型，少數(shù)見(jiàn)于D型。經(jīng)我國(guó)學(xué)者對(duì)禽巴氏桿菌分型研究表明，我國(guó)流行的禽源巴氏桿菌大部分均為5：A、8：A及9：A。多殺性巴氏桿菌的莢膜與其毒力有關(guān)，有致病力的菌株如果失去產(chǎn)生莢膜的能力，可導(dǎo)致其毒力的丟失。已有研究表明多殺性巴氏桿菌在體內(nèi)繁殖可以產(chǎn)生毒素，內(nèi)毒素是其主要的毒力因子，引發(fā)病理過(guò)程。（二）、禽巴氏桿菌的分離與鑒定（1）、病料采集：無(wú)菌操作采取死亡雞肝臟、脾臟、心臟,采病料時(shí)用燒紅的刀片燒烙組織，而后用滅菌棉拭子或接種環(huán)通過(guò)燒烙表面插入組織或心臟內(nèi)取樣。（2）、涂片

5、鏡檢：將肝觸片和心血涂片，滴加幾滴甲醇，作用23 min,自然干燥，然后分別進(jìn)行革蘭氏染色和美蘭染色，鏡檢。（3）、禽巴氏桿菌分離與純化：無(wú)菌取急性死亡的雞的心血、肝分別接種血液瓊脂平板、麥康凱培養(yǎng)基等培養(yǎng)基上，37培養(yǎng)24。觀察培養(yǎng)基變化情況并涂片鏡檢。然后再?gòu)难桨迳咸魡蝹€(gè)菌落接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯、厭氣肉肝湯觀察其生長(zhǎng)特性。最后從血平板上挑取疑為禽巴氏桿菌的單個(gè)菌落，在含4%血清和0.1%裂解全血的馬丁平板上劃線，37培養(yǎng)18h備用。（4）、禽巴氏桿菌的純度檢驗(yàn)：將菌株畫(huà)線接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基，37培養(yǎng)1824 h后觀察。菌落形態(tài)一致的菌落,經(jīng)涂片，革蘭氏染色，鏡檢。（5）、禽巴氏桿菌的生化試驗(yàn)

6、：將分離的細(xì)菌接種到血液瓊脂平板上，37培養(yǎng)1824，挑取單取個(gè)菌落到乳糖、蔗糖、果糖、山梨醇、尿素酶、葡萄糖、麥芽糖的微量生化反應(yīng)管中，37培養(yǎng)24后，觀察結(jié)果。注：附禽巴氏桿菌的生化試驗(yàn)鑒定標(biāo)準(zhǔn)表。表二：巴氏桿菌的生化試驗(yàn)鑒定標(biāo)準(zhǔn)表19試劑乳糖半乳糖蔗糖水樣苷果糖甘油山梨醇甘露醇尿素酶菊糖葡萄糖麥芽糖鼠李糖明膠反應(yīng)-U+-+U+U+-+-U-“+”表示反應(yīng)，“-”表示無(wú)反應(yīng)，“U”表示通常，“V”表示不定。（6）、禽巴氏桿菌致病試驗(yàn)：將分離的細(xì)菌接種營(yíng)養(yǎng)肉湯，37培養(yǎng)1824后，取5只小白鼠腹腔注射，每只0.1ml，另外取5只按同劑量腹腔注射生理鹽水做對(duì)照。觀察，有死亡小鼠則解剖取心血涂片

7、鏡檢。（三）、結(jié)果（1）、涂片鏡檢：可見(jiàn)菌體兩極濃染，中間部分著色較淺，革蘭氏染色為革蘭氏陰性小桿菌。（2）、禽巴氏桿菌分離：血液瓊脂平板上生長(zhǎng)出稍突、白色、半透明、奶油狀、不溶血的菌落，營(yíng)養(yǎng)肉湯和厭氣肉肝湯混濁，麥康凱培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)。鏡檢為革蘭氏陰性、兩極著色的短小桿菌，多數(shù)單個(gè)存在。在含0.1%裂解全血和4%血清馬丁瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落，對(duì)光肉眼觀察菌落呈微蘭色。在低倍顯微鏡下，以45折光檢查，菌落為桔紅色熒光。在普通肉湯中能生長(zhǎng)。在含4%血清的馬丁肉湯中生長(zhǎng)良好，呈均勻混濁，少數(shù)菌株在管底有微量沉淀。（3）、禽巴氏桿菌的純度檢驗(yàn)：劃線平板上菌落生長(zhǎng)分布均勻,有一定數(shù)量單個(gè)菌落,且菌落形態(tài)一致。染色鏡檢見(jiàn)革蘭氏陰性小桿菌或球桿菌。（4）、禽巴氏桿菌生化實(shí)驗(yàn)：禽巴氏桿菌生化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如表三所示。根據(jù)表二判斷，結(jié)果符合巴氏桿菌生化特性。表三：禽巴氏桿菌生化實(shí)驗(yàn)試劑乳糖蔗糖果糖山梨醇尿素酶葡萄糖麥芽糖結(jié)果-+-+-（5）、禽巴氏桿菌致病性實(shí)驗(yàn)：注射細(xì)菌的小鼠24小時(shí)內(nèi)全部死亡。對(duì)照組小鼠無(wú)不良反應(yīng)。死亡小鼠涂片鏡檢見(jiàn)兩極濃染，中間部分著色較淺的小桿菌。（四）、分析根據(jù)分離菌涂片鏡檢的結(jié)果、血平板上形成的菌落形態(tài)、培養(yǎng)特性、麥康凱培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)、生化試驗(yàn)結(jié)果、動(dòng)物攻毒試驗(yàn),可以確診該分離菌為雞多殺性巴氏桿菌。（五）、小結(jié)細(xì)菌的分