淫羊藿總黃酮生物轉(zhuǎn)化過程研究

1、淫羊矍總黃酮生物轉(zhuǎn)化過程研究摘要該文旨在研究淫羊翟總黃酮在體外水解酶 作用下的生物轉(zhuǎn)化過程。主要采用蝸牛酶水解淫羊霆總黃 酮，用hplc測定總黃酮中主要黃酮的轉(zhuǎn)化。數(shù)據(jù)結(jié)果顯示 已知主要黃酮成分淫羊痿昔，朝痿定a,朝麓定b,朝蕾定c 都在12h內(nèi)分別完全轉(zhuǎn)化為寶矍昔i ,箭翟昔a,箭麓昔 b和鼠李糖基淫羊蕾次昔ii,隨著水解時間的延長，各轉(zhuǎn)化 產(chǎn)物被繼續(xù)水解。因此可得出結(jié)論，蝸牛酶在37 °c, ph 6.0 的hank' s平衡鹽溶液中，2 h內(nèi)能將淫羊翟主要總黃酮轉(zhuǎn) 化為次級昔或昔元，且其酶解產(chǎn)物與腸道代謝產(chǎn)物相一致。關(guān)鍵詞淫羊麓總黃酮；蝸牛酶；生物轉(zhuǎn)化淫羊蕾是傳統(tǒng)的補腎

2、中藥，具有補腎陽、強筋骨、祛風 濕的作用1。淫羊麓中黃酮成分是主要活性成分，其中8- 異戊烯基取代黃酮昔是主要代表活性黃酮，主要有淫羊翟 昔，朝蕾定a,朝翟定b,朝蒼定c和寶蕾昔等2,化學結(jié) 構(gòu)見圖1。淫羊翟黃酮昔在腸道的吸收較差3,水解是淫羊 翟黃酮昔生物轉(zhuǎn)化的起始步驟，去糖基化使得糖昔易于在腸 道擴散和吸收。因此口服淫羊養(yǎng)黃酮，主要以腸道代謝產(chǎn)物 （次級昔或昔元）的形式被吸收而發(fā)揮療效4-5,且據(jù)文 獻報道腸道代謝產(chǎn)物寶翟昔i和淫羊蕾昔元的抗骨質(zhì)疏松 等的生物活性更強6-7 o但由于人體腸道存在的水解酶（腸 道黏膜酶和腸道菌酶）會因人種、年齡、疾病而有所差異 8-9,因此會影響淫羊麓黃酮昔

3、的水解進而影響其吸收和 療效的發(fā)揮。在體外選擇高效安全的淫羊蕾黃酮昔水解酶， 將其加入淫羊麓總黃酮中口服，可以增強淫羊麓總黃酮腸道 水解功能，是促進淫羊蕾總黃酮口服吸收，增加其生物利用 度，提高藥效的有效途徑之一。蝸牛酶是從蝸牛的嗦囊和消化道中提取的一種混合酶， 目前已明確其含有纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、蛋白酶等20 多種酶，具有很強的生物轉(zhuǎn)化能力10 o課題組前期研究 表明蝸牛酶可以水解淫羊矍昔11,且其代謝產(chǎn)物與腸道代 謝產(chǎn)物一致，因此本研究采用蝸牛酶水解淫羊麓總黃酮，研 究主要已知黃酮和未知黃酮的生物轉(zhuǎn)化情況，為構(gòu)建新型的 淫羊蕾總黃酮仿生酶解給藥系統(tǒng)提供前期的研究基礎(chǔ)。1材料agile

4、nt 1200型高效液相色譜儀（dad檢測器，四元泵, 美國agilent公司）；數(shù)顯氣浴恒溫振蕩器（金壇市雙捷實 驗儀器廠）；mettler al204 1/10萬天平（瑞士梅特勒-托利 多儀器有限公司）；離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司）。蝸牛酶（上海源葉生物科技有限公司）；淫羊麓昔，朝 蕾定a,朝痿定b,朝麓定c和寶翟昔i對照品（上海源葉 生物科技有限公司，純度98%）；淫羊養(yǎng)昔元對照品（自制, 純度98%）；乙月青為色譜純，水為高純水，其余試劑均為分 析純。淫羊翟購自吉林敦化，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學吳德康教授鑒 定為朝鮮淫羊矍。2方法與結(jié)果2. 1hplc測定淫羊麓主要黃酮的分析方法建立2

5、. 1. 1 色譜條件 zorbax sbc18 色譜柱(4. 6 mmx 250 mm, 5 um)；流動相乙睛(a)-水(b),梯度洗脫，015 min, 10%25%a, 1538 min, 25%a, 3861 min, 25%71%a, 61 75 min, 71%100%a；流速 1. 0 ml min-1；檢測波長 270 nm；柱溫 30 °c。2. 1.2對照品溶液的制備 精密稱取淫羊痿昔5. 33 mg, 朝翟定a 8. 42 mg,朝霍定b 9. 05 mg,朝霍定c 8. 26 mg, 寶蕾昔i 5. 26 mg,淫羊養(yǎng)昔元8. 19 mg,加無水乙醇溶解稀

6、釋至10 ml,作為儲備液。2.1.3供試品溶液的制備 取轉(zhuǎn)化后的混懸液適量，加無 水乙醇終止酶解反應(yīng)，搖勻，離心后即得。2. 1.4標準曲線的繪制精密量取淫羊翟昔，朝餐定a, 朝翟定b,朝翟定c,寶翟昔i和淫羊蕾昔元儲備液適量， 加無水乙醇稀釋成一定濃度的對照品溶液。所含淫羊養(yǎng)昔的 質(zhì)量濃度分別為 1 7, 3.3, 6. 7, 13.3, 26.6, 53.3, 106.6 mg - l-1,所含朝翟定a的質(zhì)量濃度分別為2. 6, 5.3, 10.5, 21.0, 42. 1, 84.2, 168.4 mg - l-1,所含朝麓定 b 的質(zhì)量 濃度分別為 1.4, 2.8, 5. 7, 1

7、1.3, 22.6, 45.2, 90.5, 181.0 mg - l-1,所含朝蠶定c的質(zhì)量濃度分別為2.6, 5.2, 10.3, 20.6, 41.2, 82.6, 165.2 mg - l-1,所含寶翟昔 i 的質(zhì)量 濃度分別為 3. 3, 6.6, 13.2, 26.3, 52.6, 105. 2 mg - l-1, 所含淫羊麓昔元的質(zhì)量濃度分別為5.1, 10.2, 20.5, 41.0, 81.9, 163.8 mgl-1。分別精密吸取各對照溶液10 ul, 注入液相色譜儀，記錄峰面積。以檢測質(zhì)量濃度(x, mg - l-1)為橫坐標，峰面積(y)為縱坐標，進行線性回歸，得 6種

8、成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍。淫羊翟昔的線性回歸方程為y=30. 459x+24. 061, r=0. 999；朝麓定a的線性回歸方程為y=17. 443x+23. 584, r=0. 999；朝翟定b的線性回歸方程為y=27. 196x+21.610, r= 0. 999；朝翟定c的線性回歸方程為y =18. 415x+19. 589, r= 1.000；寶矍昔i的線性回歸方程為y二24718x+23.400, 0.999；淫羊翟昔元的線性回歸方程為y=22. 638x+80. 731, r二0.999。結(jié)果表明,淫羊翟昔在0.0171.066 ug,朝翟定a在0.0261.684pg

9、,朝霍定b在0.0141.810 ug,朝蕾定c在0.026-1.652 ug,寶翟昔i在0.0331.052 ug,淫羊覆昔元在0. 051 21.638 ug都呈良好的線性關(guān)系。2. 1.5精密度試驗 精密吸取上述各對照品溶液，進樣10 nl,重復6次，計算峰面積的rsd,結(jié)果淫羊翟昔，朝翟定a,朝 翟定b,朝翟定c,寶翟昔i,淫羊翟昔元的日內(nèi)精密度分 別為 0.50%, 0.38%, 0.45%, 0.85%, 1. 1%, 0.48%；日間精 密度分別為 0.71%, 0.98%, 1.0%, 1.9%, 2. 1%, 0.83%,表 明儀器的精密度良好。2. 1. 6穩(wěn)定性試驗取上述

10、供試品溶液，分別于0, 1, 2, 4, 8, 12, 24 h進樣測定，每次10 ul,結(jié)果淫羊蕾昔， 朝翟定a,朝麓定b,朝翟定c,寶« i ,淫羊蕾昔元淫羊 翟昔峰面積的 rsd 分別為 0. 68%, 1. 6%, 1. 6%, 2. 2%, 2. 4%, 1.8%,表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。2.1.7重復性試驗 精密稱定同一批樣品，按供試品溶液 制備方法分別制備5份供試品溶液，測定6種成分的含量， 結(jié)果淫羊翟昔，朝翟定a,朝蕾定b,朝簷定c,寶蕾昔i, 淫羊鱉昔元淫羊蠶昔含量的rsd分別為0.70%, 1.6%, 1.9%, 2. 2%,2. 0%,2. 0%,表明樣品

11、的重復性較好。2. 1. 8加樣回收率試驗 精密量取已知含量的同一批淫 羊翟黃酮酶解液各6份，加入一定量的對照品，按樣品處 理方法制備并進樣10 ul,計算各對照品的平均加樣回收率 和rsd。結(jié)果淫羊蕾昔、朝蕾定a,朝霆定b,朝翟定c,寶 翟昔i,淫羊蕾昔元的平均回收率分別為100.2%, 99. 04%, 100. 5%, 100. 6%, 98. 63%, 99. 15%； rsd 分別為 2. 0%, 2. 2%, 1.8%, 2. 5%, 2. 3%, 1.4%o2. 2淫羊蒼總黃酮的制備稱取淫羊 300 g,加15倍量50%乙醇回流提取2次， 每次2h,合并2次濾液，回收乙醇，濃縮至

12、1 000 ml,即 得含生藥0. 3 g ml-1的總黃酮提取物，提取物的hplc圖 見圖2o2. 3淫羊麓總黃酮的生物轉(zhuǎn)化取含生藥0. 3 g ml-1的淫羊翟提取物400 ul,加入 ph 6. 0的hank' s平衡鹽溶液10 ml中，放入37 °c恒溫振 蕩器中保溫。另精密稱取蝸牛酶10 mg,用ph 6.0的hank' s 平衡鹽溶液10 ml溶解。將酶液加至等量的淫羊蕾提取物溶 液中，在37 °c恒溫振蕩器中反應(yīng)，分別在0, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6 h時取反應(yīng)液150 nl,立即加乙醇300 u l 終止反應(yīng)，渦旋

13、，離心后進hplc分析測定，進樣量20 nl, 試驗平行3次，淫羊餐總黃酮酶解液圖譜見圖3。淫羊養(yǎng)提取物中含有的主要二糖昔淫羊蹩昔與三糖昔 朝翟定a,朝翟定b,朝翟定c含量隨酶解時間的變化見圖4。 2 h時，在酶解液中已檢測不到淫羊蕾昔，朝蕾定a,朝翟 定b,朝蒼定c,說明在2 h內(nèi)，上述黃酮昔已被完全水解。 前期采用hplc-ms/ms研究證明淫羊矍昔、朝翟定a,朝麓定 b,朝蕾定c水解掉c7位上的葡萄糖所生成的次級昔，即為 寶霆昔i,箭翟昔a,箭養(yǎng)昔b和鼠李糖基淫羊矍次昔ii, 保留時間分別為 53. 998, 50. 561, 51. 520, 51. 905 min,本 實驗對酶解液進

14、行檢測，發(fā)現(xiàn)有大量的寶« i ,箭蕾昔a, 箭翟昔b和鼠李糖基淫羊霍次昔ii的生成，因此推測在2 h 內(nèi)，淫羊翟昔，朝翟定a,朝翟定b,朝翟定c經(jīng)蝸牛酶酶 解轉(zhuǎn)化為寶翟昔i,箭翟昔a,箭和鼠李糖基淫羊麓 次昔ii。經(jīng)鑒定保留時間為50. 655, 51.830, 52. 229 min的色 譜峰分別是箭蒼昔a,箭蕾昔b,鼠李糖基淫羊翟次昔ii, 由于箭霆昔a,箭翟昔b,鼠李糖基淫羊麓次昔ii單體較難 獲得，因此以其峰面積的變化來考察，箭霆昔a,箭麓昔b, 鼠李糖基淫羊蹩次昔ii的峰面積隨酶解時間的變化見圖5o 在總黃酮提取物中含有箭麓昔a,箭霆昔b,鼠李糖基淫羊 蕾次昔ii,但較之淫

15、羊翟昔，朝蕾定a,朝蕾定b,朝痿定c 含量較低，隨著酶解開始，這3種黃酮的含量開始增加，到 lh左右達到最大，約增大為原來的56倍，隨后箭麓昔a 繼續(xù)被水解，于4 h時轉(zhuǎn)化了 31.86%,鼠李糖基淫羊翟次 昔ii轉(zhuǎn)化了 1&87%,而箭翟昔b基本不再水解。本實驗考察了提取物中寶蕾昔i,淫羊矍昔元含量隨時 間的變化，見圖6o寶翟昔i在1 h內(nèi)隨著酶解時間的延長 含量不斷增大，到lh達到最大，約為酶解之初的2倍，之 后隨著酶解時間的延長含量逐漸下降，于5h寶翟昔i轉(zhuǎn)化 了 91.50%, 5 h后趨于飽和，但是比酶解前含量低了近5倍, 該結(jié)果說明在酶解最初的1 h, 一方面淫羊翟昔水解為

16、寶翟 昔i,另一方面寶翟昔i也會被水解為昔元，但淫羊蕾昔的 水解速率大于寶餐昔i,因此觀察到寶矍昔i的含量呈上升 趨勢，lh后寶霆昔i的水解速率大于淫羊翟昔的水解速率, 且淫羊養(yǎng)昔在2 h已近轉(zhuǎn)化完全，而寶麓昔i又不斷水解為 昔元，因此含量不斷下降，至5 h轉(zhuǎn)化趨于穩(wěn)定。這一結(jié)果 也可從淫羊翟昔元含量變化來反映。作者未在藥材提取物中 檢測到昔元的存在，但是隨著酶解時間的延長，昔元在4 h 內(nèi)呈線性增長，4 h后增長趨于平緩。這也說明除寶蒼昔i 外，可能還有其他次級昔水解生成淫羊翟昔元。此外通過二極管陣列檢測器對色譜峰的紫外吸收圖譜 進行比對，發(fā)現(xiàn)保留時間為15.013, 18. 504, 19

17、. 005, 22. 010, 24. 163, 33.015, 43. 716, 45. 237, 47. 09, 48. 11 min的110號峰的光譜圖與淫羊蕾昔相似，推測為黃酮成 分，其峰面積也有較大變化。1號峰3h水解了 86. 15%之后 趨于飽和，2號峰和3號峰在3 h內(nèi)水解完全，48號峰在 1 h水解完全。9號峰和10號峰在未酶解提取物中含量較少, 但在酶解過程中不斷增加，在23 h左右增長趨于飽和， 見圖7,說明有黃酮成分酶解轉(zhuǎn)化生成了 9號峰和10號峰。3討論本研究對體外酶解淫羊蕾總黃酮的過程進行了分析，為 模擬體內(nèi)腸道情況，選擇了蝸牛酶，這是由于蝸牛酶是動物 性酶，在人體

18、腸道環(huán)境下活性較高，且課題組前期的研究證 明蝸牛酶生物轉(zhuǎn)化淫羊痿昔的過程與腸道酶及腸道菌的轉(zhuǎn) 化過程相似。為模擬體內(nèi)腸道環(huán)境，酶解溫度選擇了 37 1,緩沖液選擇了 ph 6. 0的hank' s平衡鹽溶液，目的在于今 后有可能將酶加入淫羊翟總黃酮中口服，增強淫羊痿總黃酮 腸道水解功能，提高淫羊翟總黃酮的生物利用度，為構(gòu)建新 型的淫羊簷總黃酮仿生酶解給藥系統(tǒng)。由于食物與藥物在人體腸道停留的時間約為36h12,而本試驗在現(xiàn) 有條件下，主要黃酮昔在約2 h已水解完全，因此對蝸牛酶 的濃度、酶的活力，底物與酶的比例還需進一步考察。從本 試驗結(jié)果看，淫羊矍總黃酮中的主要黃酮昔如淫羊蕾昔，朝 翟

19、定a,朝蕾定b,朝蕾定c和寶痿昔的酶解產(chǎn)物與體內(nèi)腸 道的代謝產(chǎn)物基本一致13-14,但由于總黃酮中還有許多 未知黃酮，這些未知黃酮及其酶解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)需進一步進行 解析并與體內(nèi)腸道代謝情況的進行對比，此外淫羊麓總黃酮 酶解產(chǎn)物箭« a,箭餐昔b,鼠李糖基淫羊翟次昔ii和其 他未知產(chǎn)物的藥效是否比原型藥有所提高，還需進一步考 察。參考文獻1 王霄，謝人明，孫文基淫羊麓屬藥用植物黃酮類化合物的研究進展j.中藥藥理與臨床，2010,26(5)：171.2 于霄，宋靜，熊志立，等.一測多評法測定淫羊翟中朝翟定a、朝蕾定b、朝翟定c及淫羊翟昔的含量j. 中國中藥雜志，2010,35 (24)：3

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