《科研儀器學》總復習資料

1、一、名解1、流式細胞術(shù)：利用流式細胞儀，對處于快速直線流動的單列細胞或生物顆粒進行逐個、多參數(shù)、快速的定性定量分析、分選的技術(shù)。2、生物芯片（DNA芯片或基因芯片）：DNA雜交探針技術(shù)與半導體工業(yè)技術(shù)相結(jié)合。將大量探針分子固定于支持物上后與帶熒光標記的DNA樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。3、RCF（相對離心力）：在離心場中，作用于顆粒的離心力相當于地球重力的倍數(shù)，單位是“g”。4、冷凍干燥冷凍干燥（以下簡稱凍干）就是將含水物質(zhì)，先凍結(jié)成固態(tài)，而后使其中的水分從固態(tài)升華成氣態(tài)，以除去水分而保存物質(zhì)的方法。5、凍干曲線將擱板溫度與制品溫度隨時

2、間的變化記錄下來，即可得到凍干曲線。比較典型的凍干曲線系將擱板升溫分為兩個階段，在大量升華時擱板溫度保持較低，根據(jù)實際情況，一般可控制在-10至+10之間。第二階段則根據(jù)制品性質(zhì)將擱板溫度適當調(diào)高，此法適用于其熔點較低的制品。6PCR技術(shù)PCR技術(shù)又稱為聚合酶鏈式反應(yīng)，其基本原理是根據(jù)細胞分裂中DNA的半保留復制機理，體外合成目的DNA片段的方法。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。7RT-PCRRT-PCR指逆轉(zhuǎn)錄PCR, 是指從RNA或mRNA直接擴增獲得目的DNA片段的過程.8熒光定量PCR通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進行標記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)

3、合相應(yīng)的軟件可以對結(jié)果進行分析，計算待測樣品的初始模板量。9分子篩層析技術(shù)凝膠顆粒內(nèi)部呈網(wǎng)孔狀結(jié)構(gòu)，分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)難以進入凝膠顆粒內(nèi)部，主要從凝膠顆粒的間隙里通過，所受阻滯作用小，所以大分子蛋白質(zhì)遷移速度快，先流出凝膠 。分子質(zhì)量小的蛋白質(zhì)則容易進入凝膠顆粒內(nèi)部，所受阻滯作用大，所以小分子蛋白質(zhì)遷移速度慢，后流出凝膠，從而將分子質(zhì)量大小不同的蛋白質(zhì)分開。10離子交換層析技術(shù)：蛋白質(zhì)是兩性分子，在一定的pH條件下帶有電荷，不同的蛋白質(zhì)所帶有電荷的種類和數(shù)量不同，因此它們與帶電的凝膠顆粒間的電荷相互作用不同。這樣，當?shù)鞍踪|(zhì)混合物流經(jīng)帶電凝膠時，電荷吸引作用小的蛋白質(zhì)先流過，而電荷吸引作用大的蛋

4、白質(zhì)后流過凝膠，從而把不同的蛋白質(zhì)分開。 11吸附層析技術(shù)由于不同的蛋白質(zhì)所含有的氨基酸的種類和數(shù)目不同，分子表面的極性氨基酸和非極性氨基酸的數(shù)目、分布區(qū)域不同，因此它與分子比表面積大的吸附劑間的相互作用力大小不同。根據(jù)此原理對蛋白質(zhì)進行分離純化。 12蛋白質(zhì)組學蛋白質(zhì)組(proteome)是指基因組表達的全部蛋白質(zhì)及其存在方式。13雙向電泳技術(shù)第一向:等電聚焦（IEF）：等電聚焦是利用蛋白質(zhì)分子的等電點不同，在一個穩(wěn)定的、連續(xù)的、線形pH梯度中進行蛋白質(zhì)的分離和分析。第二向:SDS-PAGE電泳：SDS-PAGE電泳是根據(jù)SDS和還原試劑將蛋白質(zhì)分子解聚后亞基的大小，在恒定的pH緩沖系統(tǒng)中的

5、分離。經(jīng)過雙向電泳能將蛋白質(zhì)在一個二維平面分開。14生物質(zhì)譜技術(shù)質(zhì)譜技術(shù)是蛋白質(zhì)組學研究中最為廣泛使用的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)。其基本原理是樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子間質(zhì)荷比（M/Z）的差異來分離并確定分子質(zhì)量。質(zhì)譜技術(shù)能從復雜的樣本中定性、定量分析蛋白質(zhì)，其靈敏度高，可達到fmol(10-15)乃至amol(10-18)，速度快，現(xiàn)已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組研究中主要的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)。15肽質(zhì)量指紋圖譜MALDI-TOF-MS常用于蛋白質(zhì)的肽質(zhì)量指紋圖譜(peptidemass finger printing，PMF)鑒定。PMF是指蛋白質(zhì)被酶切位點專一的蛋白酶水解后得到的肽片段質(zhì)量圖譜。由于每種蛋白質(zhì)的

6、氨基酸序列不同，蛋白質(zhì)被酶水解后，產(chǎn)生的肽片段序列也各不相同，其肽混合物質(zhì)量數(shù)亦具特征性，所以稱為指紋圖譜(finger printing)。16基質(zhì)輔助離子化技術(shù)試樣溶解或懸浮于基質(zhì)中，激光束輻射到基質(zhì)和試樣分子上。基質(zhì)吸收激光束能量后汽化，部分試樣分子伴隨基質(zhì)的汽化而解吸?；|(zhì)吸收大部分激光能量，減少了試樣分子被激光能量破壞及過度電離成碎片離子。17超聲空化超聲波清洗的基本原理是基于超聲在液體中的空化作用，當聲壓或聲強達到一定值時，清洗液中的氣泡迅速增長，然后突然閉合。在氣泡閉合時，產(chǎn)生沖擊波，在氣泡周圍產(chǎn)生10121013Pa的壓力及局部高溫，這種物理現(xiàn)象稱為超聲空化18、基因槍法又稱生

7、物彈法或微粒槍法、微粒轟擊法，是依賴高速度的金屬顆粒將外源基因引入活體細胞的一種轉(zhuǎn)化技術(shù)。19、Western blot(蛋白質(zhì)印跡技術(shù)) 將蛋白質(zhì)用聚丙烯酰胺凝膠電泳按分子大小分開，再將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到尼龍膜或其他膜上，用抗體作為探針與之雜交，反應(yīng)之后用放射自顯影或底物顯色來檢測是否與抗體特異性結(jié)合的抗原。與DNA和RNA不同的是，蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移只有靠電轉(zhuǎn)移方可完成，反應(yīng)時用堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶標記或同位素標記第二抗體， 二、填空1、使用流式細胞儀檢測細胞周期、細胞DNA、RNA含量、總蛋白質(zhì)含量用（線性）放大器，檢測細胞表面表面抗原、膜受體分布（對數(shù)）放大器。2、影響DNA測序的因素：模板

8、的影響、循環(huán)測序反應(yīng)條件、電泳的影響。3、染色細胞核的染料：Hoechst33258（藍）、DAPI（藍）、FITC（綠）、Propodium Iodide（紅）、CY3（紅）。4、細胞融合的方法（電融合、聚乙二醇融合、病毒融合）。5、激光共聚焦顯微鏡的原理是利用（一定波長的激發(fā)光對樣品進行激發(fā)，產(chǎn)生一定波長的熒光）的成像。6、細胞穿孔的方法（電穿孔、磷酸鈣沉淀法、激光鉆孔法、微射彈法）。7、酶標儀中的光學檢測方法（光度測定、熒光、時間分辨熒光、熒光偏振、化學發(fā)光）。8、DNA測序的主要方法（新生鏈的熒光標記、雙脫氧末端終止法）。9、用于提取純化生物大分子理化性質(zhì)的離心機（分析性離心機），用于

9、實驗的（制備型離心機）。10、流式細胞術(shù)前向散射（FSC，小角散射），大小與細胞直徑成正比，細胞越大，F(xiàn)SC越大；側(cè)向散射（SSC，90°散射），與細胞內(nèi)顆粒結(jié)構(gòu)成正比，胞內(nèi)顆粒結(jié)構(gòu)越復雜質(zhì)量越大，SSC越大。11、Ca2+熒光指示劑包括：Fura-2、indo-1、Quin-2。12、全自動DNA測序儀主要包括電泳系統(tǒng)、激光器和熒光檢測系統(tǒng)；大致可分為自動進樣器區(qū)、凝膠塊區(qū)和檢測區(qū)等結(jié)構(gòu)功能區(qū)。13、全自動DNA測序儀根據(jù)電泳方式的不同分為平板型電泳和毛細管電泳兩種儀器類型14、DNA測序過程包括：分離純化模板DNA、DNA模板定量分析、測序反應(yīng)、測序反應(yīng)后純化、on-line變性

10、、毛細管電泳和檢測和數(shù)據(jù)分析。15、DNA測序過程中，用熒光標記新生鏈時，分為多色標記法和單色標記法；根據(jù)標記部位不同，又分為熒光標記引物法和熒光標記終止底物法。16、激光共聚焦顯微鏡由顯微鏡光學系統(tǒng)，激光光源，掃描裝置和檢測系統(tǒng)構(gòu)成。17常規(guī)PCR技術(shù)包括變性、退火、延伸三個基本反應(yīng)步驟。18常規(guī)PCR反應(yīng)體系由緩沖液、模板DNA、引物、4種脫氧核糖核苷三磷酸、TaqDNA聚合酶和Mg2+組成。19蛋白質(zhì)的分離純化方法中，透析、超過濾、分子篩層析、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳等就是依據(jù)蛋白質(zhì)分子大小進行分離純化蛋白質(zhì)的。20蛋白質(zhì)的分離純化方法中，等電點沉淀、離子交換層析、等電聚焦電泳等都是依據(jù)不

11、同蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)不同來分離純化蛋白質(zhì)； 21蛋白質(zhì)細分級方法有分子篩層析、離子交換層析、親和層析、聚丙烯酰胺凝膠電泳、雙向電泳、毛細胞電泳、 等電聚焦電泳等22蛋白質(zhì)粗分級方法有硫酸銨分級沉淀、有機溶劑分級沉淀、超速離心、等電點沉淀、透析、超濾等。23蛋白質(zhì)組研究核心技術(shù)包括蛋白質(zhì)分離技術(shù)(如雙向電泳和多維液相層析)、蛋白質(zhì)鑒定方法(如氨基酸序列分析和質(zhì)譜技術(shù)）和生物信息學技術(shù)。24質(zhì)譜儀關(guān)鍵部件是離子源和質(zhì)量分析器是兩個關(guān)鍵的部件。其中質(zhì)量分析器決定著質(zhì)譜的準確度、靈敏度和分辨率等。25核酸分子雜交探針標記有同位素和非同位素標記兩種，其中，非同位素標記物主要有生物素、地高辛配體、熒光素等。2

12、6.電磁力平衡式電子天平最有代表性，其基本結(jié)構(gòu)由托盤、磁鐵、線圈、橫梁、防護罩等組成。27國家對分析實驗室的用水規(guī)格進行了技術(shù)規(guī)定，將其分為三個級別。其中一級水用于要求嚴格的分析實驗，如液相色譜分析用水等；二級水用于無機痕量分析，如原子吸收光譜分析用水等；三級水用于一般化學分析實驗。28.超聲波破碎儀由超聲波發(fā)生器和換能器兩部分組成。29.CO2培養(yǎng)箱使用時影響實驗結(jié)果的因素有：二氧化碳濃度、濕度、溫度。30.凍干機按系統(tǒng)可分為制冷系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、加熱系統(tǒng)和控制系統(tǒng)四個主要部分。31.高效液相色譜儀總體可分為4個部分，即進樣系統(tǒng)、高壓輸液系統(tǒng)、分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)。32.超凈工作臺按其工作性能分

13、為兩大類：一類為正壓型超凈工作臺，另一類生物安全超凈工作臺，又稱為生物安全柜。34.影響電子天平稱量精度的因素有預熱時間、預壓、讀數(shù)時間、樣品本身自然物理特性和變化造成的影響。35.水的純化技術(shù)：蒸餾、離子交換、反滲透、電滲析、電析去離子技術(shù)、微孔過濾、消毒滅菌。36.影響移液器準確性的因素：操作錯誤、移液器損壞、操作條件的影響。三、簡答1 PCR的原理DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當、溫度降低后又可以復性成為雙鏈。通過溫度變化控制DNA的變性和復性，設(shè)計引物做啟動子，加入DNA聚合酶、dNTP，可完成特定基因的體外復制。高溫變性，低溫退火，適溫延伸2 流式細胞術(shù)的特點。1、實現(xiàn)對單列細胞

14、的檢測2、實現(xiàn)高通量檢測3、多參數(shù)、多色熒光分析使對細胞識別技術(shù)更精確4、可定性定量分析細胞5、分選特定功能、性狀的細胞3 電穿孔儀與細胞融合儀的基本原理。電穿孔儀：細胞膜基本上是一絕緣體，膜兩側(cè)浸在含離子的電解質(zhì)溶液中，在外加電場時，膜兩邊的電解質(zhì)離子極化，形成外加膜電位差。高壓電脈沖擊穿細胞膜后，磷脂雙分子層和細胞膜均可復原。細胞膜的復原不但與脂肪分子的排列和相互間引力有關(guān)，還與其他重要因素有關(guān)，如膠體滲透作用、溶液離子作用和膜蛋白的影響等。細胞融合儀：通過非均勻電場的電介質(zhì)電泳作用，建立細胞(原生質(zhì)體)間的緊密接觸，形成細胞串。再利用高壓脈沖的可逆擊穿效應(yīng)使接觸區(qū)質(zhì)膜上形成微孔，胞質(zhì)通過

15、微孔融合。4 流式細胞儀的構(gòu)成模塊。流動室與液流系統(tǒng)、光源與光學系統(tǒng)、信號收集與信號轉(zhuǎn)換系統(tǒng)、計算機與分析系統(tǒng)、分選系統(tǒng)。5 熒光檢測酶標儀的主要模塊。1、一個激發(fā)光源（鹵素燈氙燈、激光）2、熒光色團 (染料)3、波長選擇元件：濾光片對或光柵(區(qū)分激發(fā)光和發(fā)射光）4、檢測發(fā)射光的檢測器 (光電倍增管, PMT)6 超速離心機的主要使用注意事項。1、離心前預冷轉(zhuǎn)子2、超速離心時，液體一定要加滿離心管，避免離心管變形3、離心后清潔離心機腔體和轉(zhuǎn)頭，并擦干腔內(nèi)冷凝水，打開門，直至腔內(nèi)恢復常溫7簡述影響點穿孔儀和細胞融合儀的因素。1、采用指數(shù)型衰減波優(yōu)于使用方形波2、達到臨界電壓，否則無法擊穿細胞膜3

16、、對于細菌由于有外膜，臨界電壓需要加大12個數(shù)量級。8分光光度計理想的光源條件是：1、提供連續(xù)的輻射；2、光強度足夠大；3、在整個光譜區(qū)內(nèi)光譜強度不隨波長有明顯變化；4、光譜范圍寬；5、使用壽命長，價格低。9、雙脫氧鏈末端終止法的原理：其原理是利用DNA的體外合成過程，但與普通PCR不同的是，雙脫氧鏈末端終止法測序反應(yīng)中除有-脫氧核苷三磷酸（dNTP）外，還加入2-雙脫氧核苷三磷酸（2-ddNTP），由于沒有-OH，不能進行后續(xù)反應(yīng)，使正在延伸的DNA鏈在此終止。由于存在ddNTP與dNTP的競爭，生成的反應(yīng)產(chǎn)物是一系列長度不同的多核苷酸片段，通過電泳分離后可讀出新生DNA鏈的序列10簡述熒光

17、定量 PCR定量原理及計算方法反應(yīng)最初，雖然產(chǎn)物是指數(shù)增長,但是熒光處于背景水平，檢測不到熒光增加.當累積了足夠的擴增產(chǎn)物，可以產(chǎn)生可檢測的熒光信號時，這個循環(huán)數(shù)叫初始循環(huán)數(shù)，即CT。由于CT值處于指數(shù)期內(nèi)，這時的反應(yīng)成份不會抑制擴增反應(yīng)進行，因此熒光定量PCR結(jié)果是可靠的，可以準確地反應(yīng)體系中模板的初始量。如果產(chǎn)物在每一循環(huán)都加倍，熒光曲線之間的間距由等式“2n=稀釋倍數(shù)“決定； n為閾值線上擴增曲線之間的循環(huán)數(shù)（CT的差值）例如：10倍稀釋的DNA樣品， 2n=10 因此n=3.32，即CT值相差3.32個循環(huán)。11熒光定量PCR的應(yīng)用（1）實時監(jiān)測產(chǎn)物量，計算初始模板量（2）基礎(chǔ)研究的基

18、因表達分析研究（3）臨床病原體檢測：病人體液中目標基因的檢測：病毒,寄生蟲,細菌（4）食品衛(wèi)生檢疫：a.轉(zhuǎn)基因食品的檢疫：根據(jù)轉(zhuǎn)入基因的特異性區(qū)段設(shè)計探針b.食品中病原微生物的檢測 12蛋白質(zhì)分離純化與鑒定的主要步驟 （1） 選擇實驗材料（2） 實驗材料的預處理 （3） 蛋白質(zhì)的提取 （4） 蛋白質(zhì)粗分級 （5） 蛋白質(zhì)細分級 （6） 蛋白質(zhì)的鑒定 13蛋白質(zhì)鑒定的相關(guān)要素（1）蛋白質(zhì)分子質(zhì)量（2）等電點（3）氨基酸組成及其順序（4）免疫特性（5）結(jié)晶特性（6）生物學功能14核酸分子雜交技術(shù)的原理有互補特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA混在一起時，其相應(yīng)同源區(qū)段將會退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)。如把一段已

19、知基因（DNA或RNA）核酸序列用合適標記物（如放射性同位素、生物素等）予以標記，當作探針（probe), 與變性后的單鏈基因組DNA或RNA進行雜交。再用合適方法（如放射自顯影或免疫組織化學等技術(shù)）把標記物檢測出來，就可確定靶核苷酸序列是否存在、拷貝數(shù)及表達豐度等。15電子天平的工作原理基于通電導線在磁場中受到安培力的作用。當秤盤上放有被稱量物體時，秤盤向下發(fā)生線性位移，觸動電磁傳感器，使原來處于平衡狀態(tài)的兩個光敏三極管在發(fā)光二極管的光量發(fā)生變化時產(chǎn)生電流，此電流經(jīng)放大后反饋到磁鐵內(nèi)的線圈中，使受力增大，將秤盤托起，恢復至平衡位置。此時流經(jīng)線圈的電流通過取樣電阻時，產(chǎn)生電壓降，電壓值與被稱量

20、物體的質(zhì)量成正比。電壓信號經(jīng)過放大、濾波等處理后，進行模數(shù)轉(zhuǎn)換。電流模擬信號轉(zhuǎn)變成數(shù)字信號后，再經(jīng)芯片處理，最終在顯示器上顯示出質(zhì)量值。16.基因擴增的技術(shù)設(shè)備組成。由三部分構(gòu)成：模板DNA制備所需設(shè)備，主要為高速微量離心機或高速冷凍離心機；PCR基因擴增儀；DNA擴增結(jié)果判讀和測定設(shè)備，主要有水平低壓電泳儀、PCR核酸電泳槽以及紫外透射儀和DNA微量熒光計等。17.使用電子天平的注意事項1)在稱量之前，特別是稱量大量物質(zhì)或連同容器一起稱量時，一定要判斷所稱重總量是否在使用天平的稱量范圍之內(nèi)，如超出稱重范圍，往往會引起天平故障。2) 精確度高的天平常會因環(huán)境空氣流動而引起稱量結(jié)果漂移，造成測定

21、結(jié)果不穩(wěn)定，有些型號的儀器帶有調(diào)整功能，可縮短稱量時間。3) 電子天平屬精密儀器，應(yīng)避免震動，減少移動。4) 稱量結(jié)束后在取走稱量物之前應(yīng)先關(guān)閉電源。5) 天平周圍及稱量盤面應(yīng)保持清潔。18.使用高壓滅菌鍋的注意事項1、易燃，易爆物品，禁用高壓蒸氣滅菌；銳性器械，不宜用此法滅菌；2、敷料包包扎及體積的影響：包裹不應(yīng)過大、過緊；捆扎不宜過緊；包裝使用的容器宜小而淺，并應(yīng)帶有通氣孔。瓶裝液體滅菌時，要用玻璃紙和紗布包扎瓶口；如有橡皮塞時，應(yīng)插入針頭排氣；3、物品排列疏密的影響：消毒物品的體積不應(yīng)超過滅菌室容積的85。4、降溫時待溫度自然降至60以下再打開箱門取出物品，以免因溫度過高而驟然降溫導致玻

22、璃器皿炸裂。5、在滅菌過程中，應(yīng)注意排凈鍋內(nèi)冷空氣，鍋內(nèi)冷空氣如排放不凈，會影響滅菌效果，達不到徹底滅菌的目的。因為空氣的膨脹壓大于水蒸汽的膨脹壓，所以，當水蒸汽中含有空氣時，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。6、在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大。其原因有三：一是濕熱中細菌菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低，二是濕熱的穿透力比干熱大；三是濕熱的蒸汽有潛熱存在，每1克水在100時，由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時可放出2.26kJ的熱量。這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。7、由于高壓蒸汽滅菌時，要使用溫度高達120、兩個大氣壓的過熱蒸汽，

23、操作時，應(yīng)有專人負責，每次滅菌前，應(yīng)檢查安全閥的性能，嚴格按照操作規(guī)程操作，以防壓力過高發(fā)生爆炸，保證安全使用。8、一般認為按常規(guī)操作消毒物品就能無菌，這實際是一種錯誤觀念。按常規(guī)操作只是一種正常消毒過程，并不能證明消毒物品已全部無菌，因此還要對滅菌效果進行測定。最普通的檢驗方法是將滅菌培養(yǎng)基放在37溫箱培養(yǎng)24小時若無雜菌生長說明滅菌效果良好。19.超低溫冰箱警報器啟動報警的原因檢查電源是否有問題或插頭是否被拉出插座；檢查內(nèi)部溫度計是否超出合適的范圍；檢查是否一次性置人物品過多。20.凍干過程中有兩個放熱過程和兩個吸收過程。液體制品放出熱量凝固成固體制品；固體制品在真空下吸收熱量升華成水蒸氣

24、；水蒸氣在冷凝器中放出熱量凝華成冰霜；凍干結(jié)束后冰霜在冷凝器中吸收熱量熔化成水。21.水蒸氣的流動阻力來自以下幾個方面：1)產(chǎn)品內(nèi)部的阻力。水分子通過已經(jīng)干燥的產(chǎn)品產(chǎn)生的阻力，這個阻力的大小與干燥層的結(jié)構(gòu)和產(chǎn)品的種類、成分、濃度、保護劑等有關(guān)。2)容器阻力。容器的阻力主要來自瓶口，因為瓶口處截面積較小，瓶口處可能還有某些其他物品如帶槽的橡皮塞、紗布等造成阻力?？傊?，瓶口截面積越大則阻力越小。3)機器本身的阻力。主要是凍干箱與冷凝器之間管道的阻力，管道粗、短、直則阻力小。另外阻力還與凍干箱和冷凝器的結(jié)構(gòu)和幾何形狀有關(guān)22.基因槍的基本原理經(jīng)適當處理后，使DNA液均勻地吸附在或包裹于微小的鎢粉或金

25、粉顆粒表面，利用基因槍的火藥爆炸、高壓放電或高壓氣體作驅(qū)動力，發(fā)射出微彈與DNA的復合體，擊中并高速穿透真空室中受體細胞的細胞壁及細胞膜，進入細胞內(nèi)，從而達到將吸附于微彈上的外源DNA導人細胞或原生質(zhì)體，獲得整合與表達的目的。微彈復合體對受體細胞造成的損傷可以修復。23.激光共聚焦顯微鏡的工作原理？在它的光收集通道上包括兩個光學系統(tǒng)：一是傳統(tǒng)的光學組件，二是共聚集光圈。所謂Confocal共聚焦是指檢測聚集光斑與檢測點完全重合。這種光學結(jié)構(gòu)保證了在聚集外部的光線不能達到信號探測器中。在共聚焦圖像系統(tǒng)中的基本原則是：“只有聚集點是亮的，其余都是暗的”。由于這種簡單明了的原理使得它的應(yīng)用中有極大的

26、靈活性。通過改變聚焦光圈，可以改變掃描光束的密度從而優(yōu)化所選用的光源。通過光級NA透鏡最小可形成大約0.5微米的掃描光斑。自由變換聚焦尺寸在檢測較弱熒光時極為重要，它可以在圖形質(zhì)量及熒光亮度之間相互協(xié)調(diào)。四、問答1、激光共聚焦顯微鏡相較于普通顯微鏡的優(yōu)勢在哪里；此外，請簡述激光共聚焦顯微鏡的應(yīng)用。 激光共聚焦顯微鏡能夠形成完全聚集的3D樣本圖形。定位不同的熒光染料在3D樣本圖形中的著色位置。精確測量二維、三維平面及空間結(jié)構(gòu)。具有識別空間位置的能力從而進行三維坐標定位。節(jié)省標本處理時間很少需要進行樣本包埋用顯微切片。應(yīng)用：1、檢測被一種或多熒光染料標記的樣本2、檢測樣本熒光著色位置或其他特征3、

27、完整觀察新鮮或固定樣本內(nèi)部結(jié)構(gòu)4、在活細胞或組織中描繪標記離子的熒光染料5、全程監(jiān)控GFP轉(zhuǎn)染后的細胞或組織2、冷凍干燥機的工作原理及對凍干制品的質(zhì)量要求。 冷凍干燥機的工作原理是將被干燥的物品先凍結(jié)到三相點溫度以下，然后在真空條件下使物品中的固態(tài)水份（冰）直接升華成水蒸氣，從物品中排除，使物品干燥。物料經(jīng)前處理后，被送入速凍倉凍結(jié)，再送入干燥倉升華脫水，之后在后處理車間包裝。真空系統(tǒng)為升華干燥倉建立低氣壓條件，加熱系統(tǒng)向物料提供升華潛熱，制冷系統(tǒng)向冷阱和干燥室提供所需的冷量。 本設(shè)備采用高效輻射加熱，物料受熱均勻；采用高效捕水冷阱，并可實現(xiàn)快速化霜；采用高效真空機組，并可實現(xiàn)油水分離；采用并

28、聯(lián)集中制冷系統(tǒng)，多路按需供冷，工況穩(wěn)定，有利節(jié)能；采用人工智能控制，控制精度高，操作方便。 對凍干制品的質(zhì)量要求是：生物活性不變、外觀色澤均勻、形態(tài)飽滿、結(jié)構(gòu)牢固、溶解速度快，殘余水分低。要獲得高質(zhì)量的制品，對凍干的理論和工藝應(yīng)有一個比較全面的了解。凍干工藝包括預凍、升華和再凍干三個分階段。合理而有效地縮短凍干的周期在工業(yè)生產(chǎn)上具有明顯的經(jīng)濟價值。3、分光光度計吸收池的使用注意事項： 要徹底清洗，尤其是盛過蛋白質(zhì)等溶液，干后形成一層膜，不易洗去，通常杯子不用時可放在 1洗潔凈液中浸泡，去污效果好，使用時用水沖洗干凈，要求杯壁不掛水珠，還可以用綢布絲線或軟塑料制作一個小刷子清洗杯子。 嚴禁用手指

29、觸摸透光面，因指紋不易洗凈。嚴禁用硬紙和布擦拭透光面，只能使用鏡頭紙和綢布。 嚴禁加熱烘烤。急用干的杯子時，可用酒精蕩洗后用冷風吹干。決不可用超聲波清洗器清洗。 吸收池的校正：要固定參比杯和樣品杯，可在杯的毛玻璃面上寫上記號。用盛有參比液的參比杯和樣品杯測定吸光度“A0”，樣品杯換上樣品液后測定的吸光度為“A1”，則校正后的實際吸光度A為：A= A1-A0 高檔的分光光度計有自動置零系統(tǒng)，可將二個杯子的偏差置零。其他重要附件：高檔分光光度計的樣品室還可以更換各種重要附件，用于各種特殊量測。如換上“積分球”，可用來檢測微弱透光和不透光的樣品。換上“凝膠掃描裝置”，可用于電泳凝膠膠條上樣品帶的掃描

30、測量。4、如何使用熒光檢測技術(shù)對細胞凋亡進行檢測：Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中Caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基(17KD)和兩個小亞基(12KD)組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，caspase-3的活性明顯下降。設(shè)計出熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽Z-DEVD-AMC。在共價偶聯(lián)時，AMC不能被激發(fā)熒光，短肽被水解后釋放出AMC，自由的AMC才能被激發(fā)發(fā)射熒光。

31、根據(jù)釋放的AMC熒光強度的大小，可以測定 caspase-3的活性，從而反映Caspase-3被活化的程度。5、如何使用分光光度計對核酸進行定量。核酸的定量是分光光度計使用頻率最高的功能?？梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長260nm。每種核酸的分子構(gòu)成不一，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對應(yīng)的系數(shù)。如：1 OD 的吸光值分別相當于50g/ml的dsDNA，37g/ml的ssDNA，40g/ml的RNA，30g/ml的Olig。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算，從而得出相應(yīng)的樣品濃度。測試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液

32、的體積，爾后測試空白液和樣品液。然而，實驗并非一帆風順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實驗者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀器，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。6、熒光標記引物法和熒光標記終止底物法的異同點。1、都確定了4種熒光染料與4種ddNTP所終止的DNA片段之間的專一對應(yīng)關(guān)系2、熒光標記引物法使熒光有色基團標記在長短不同的DNA片段的端，可理解為熒光染料標記過程和延伸反應(yīng)終止分別發(fā)生在同一DNA片段的兩端，且標記發(fā)生在引物與模板的退火過程中，而終止是發(fā)生在片段延伸過程中，兩者在時間上有一定間隔3、熒光標記終止底物法使標記和終止過程合二為一，兩者在同一時間完成 4、在具體操作中，前者要求A、C、G、T四個反應(yīng)分別

33、進行，而后者的四種反應(yīng)可以在同一管中完成 7、請比較蛋白質(zhì)與DNA測序過程的異同點。蛋白質(zhì)測序DNA測序測序中判斷的復雜性20種氨基酸且可能出現(xiàn)特殊的氨基酸4種核苷酸樣品的性質(zhì)不同蛋白質(zhì)和肽片段理化性質(zhì)相差很大，存在不溶性和變性的問題不同DNA片段理化性質(zhì)相差小，基本不存在不溶性和變性的問題對樣品量的依賴性常為主要限制因素只要建立了克隆，樣品量不成問題測序速度手工操作者一天完成約4-5個殘基的順序，自動測序儀一天可完成約30個殘基的順序手工操作一天可完成數(shù)百個堿基的順序，自動測序儀一天可完成數(shù)千堿基的順序測定準確性常出現(xiàn)拼接和辨讀錯誤準確性高費用高，對昂貴的儀器依賴性強較低，手工方法可滿足一般

34、測序要求8、影響電穿孔儀和電融合儀效率的因素(1) 電脈沖的幅度、時間和脈沖波形使細胞膜不穩(wěn)定而被擊破的最低電壓稱為臨界電壓。大致上14 kV/cm的電場加在半徑為10 m的動物細胞上，即可產(chǎn)生膜的臨界電壓。植物細胞必須先把細胞壁去掉，剩下的原生質(zhì)體的穿孔和融合所需電壓與動物細胞相近；細菌的外膜相當強韌，所需臨界電壓也往往比普通動物細胞高12個數(shù)量級。脈沖的幅度只是要求條件之一。脈沖的寬度也必須比膜的充電時間和膜的彈性復原時間長，這樣才能保證孔道在脈沖以后有機會繼續(xù)開放一段時間。一般來說，寬度窄的脈沖，需要高幅度來彌補。太寬的脈沖往往會擊破融合區(qū)外的細胞膜，導致細胞死亡，交流脈沖或多次脈沖能夠

35、充分利用脈沖電場的相向電泳壓力，所以往往比單個直流(方形)脈沖有效。如果穿孔用的電脈沖，在以峰電壓擊破細胞膜后能以較低的電壓維持孔道的短時間開放，則對提高穿孔效率有益，因此指數(shù)衰減的脈沖往往比同能量的方形脈沖有效。專門設(shè)計的脈沖形也許會比指數(shù)衰減形更有效，但指數(shù)衰減波形的脈沖最易制造，所以用途最廣。(2) 膠體滲透壓和細胞膨脹細胞被脈沖擊穿之后，水和一些離子可以自由進入，但大分子卻不易通過擊穿的小孔。由于滲透壓的不平衡，水、部分離子和小分子會進入細胞，導致細胞繼續(xù)膨脹而破裂。除非細胞膜在破裂前就復原。為避免細胞破裂，往往需要在細胞外的緩沖液加入大分子以維持滲透壓平衡。在很多情況下，允許細胞稍微

36、膨脹，會有助于引導藥物和分子進入細胞，當水或緩沖液進入細胞時，會把孔道擴大，同時溶解在外液中的成分會隨水流被帶進細胞。所以一般在穿孔之前，把細胞放人稍低滲透壓的緩沖液中，讓細胞略微膨脹，細胞膜的張力也因而增高，橫向張力可以幫助電壓力穿破細胞膜。已有張力的膜很容易擴大，若用于電融合過程，初成的連接孔道也會較容易開擴，因而促成融合。在轉(zhuǎn)染過程中，若需長鏈的DNA或質(zhì)粒進入細胞，從理論上講，需要很長時間，但由于細胞電穿孔后的復原時間僅幾十分鐘，即使電穿孔足夠大，也不可能完成這一過程。但在實驗過程中，電穿孔的轉(zhuǎn)染效率比預期高很多。(3) 細胞膜的復原穿孔后細胞膜復原的時間和過程隨細胞而異，時間的長短也

37、由復原期間的溫度、外液的滲透壓、所含離子和藥物來決定。細胞膜復原的時間長些，有利于細胞外藥物的擴散進入細胞內(nèi)。對于有些操作過程，需要低溫來延緩復原時間。但在復原過程中，細胞膜仍然是有漏洞的，所以內(nèi)外的膠體滲透壓必須仔細調(diào)節(jié)。在這段時間內(nèi)，細胞仍然非常脆弱，所以應(yīng)該避免機械振蕩，盡量避免使用移液管或離心操作。細胞外液所含的離子，一方面影響細胞復原期間的細胞生存，另一方面也影響細胞膜復原的速度。以上幾個最普通的因素，互相之間也有影響，例如，脈沖的強度和寬度大，孔也越來越多，藥物進入快，融合的概率也高，但細胞對膠體滲透壓和離子平衡也敏感。因此無論穿孔或融合的效率，在脈沖電壓或?qū)挾壤^續(xù)增高的條件下，往

38、往會先達最高效率峰，然后急劇下降，原因就在于細胞死亡。最佳效率的條件是由多種因素匹配決定的，如果了解生物物理的原理，熟悉細胞的特性，就可以設(shè)計出適當?shù)膬x器和程序，進行電穿孔和電融合。9、PCR技術(shù)原理及特點：PCR技術(shù)又稱為聚合酶鏈式反應(yīng)，其基本原理是根據(jù)細胞分裂中DNA的半保留復制機理，體外合成目的DNA片段的方法。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。其特點包括：（1）靈敏度高皮克(pg=10-12)量級擴增到微克(ug=10-6)水平；能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；病毒檢測的靈敏度可達3個RFU；細菌檢測的最小檢出率為3個細菌（2）簡便、快速一次性加好反應(yīng)液，24小時完成擴

39、增（3）對標本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等組織的粗提DNA10、蛋白質(zhì)分離純化的依據(jù)及其相應(yīng)的分離純化方法蛋白質(zhì)的分子大小主要取決于蛋白質(zhì)的肽鏈數(shù)目及每條肽鏈的氨基酸殘基數(shù)目，透析、超過濾、分子篩層析、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳等就是依據(jù)蛋白質(zhì)分子大小進行分離純化蛋白質(zhì)的； 蛋白質(zhì)的帶電特性蛋白質(zhì)肽鏈的氨基末端、羧基末端、酸性氨基酸殘基的側(cè)鏈R基以及堿性氨基酸殘基的側(cè)鏈R基等，在不同的pH條件下會帶有不同的電荷，等電點沉淀、離子交換層析、等電聚焦電泳等都是以此為依據(jù)來分離純化蛋白質(zhì)； 蛋白質(zhì)的溶解特性大多數(shù)蛋白質(zhì)在水溶液中會形成穩(wěn)定的膠體溶液，易溶于稀酸、稀堿或稀鹽等，當破壞膠體穩(wěn)定存在的條件時，蛋白質(zhì)會沉淀析出，硫酸銨分級沉淀、有機溶劑分級分離等均依據(jù)此原理； 蛋白質(zhì)的變性與復性：蛋白質(zhì)在一定的物理化學條件下會失去原有的空間結(jié)構(gòu)、生物學功能以及部分理化特性等稱為變性，在變性條件不劇烈，某些蛋白質(zhì)在除去變性條件后會恢復原有的空間結(jié)構(gòu)和生物學功能即為復性。例如，采用尿素變性復性的方法從包含體中純化原核表達蛋白； 蛋白質(zhì)的結(jié)晶：天然蛋白質(zhì)在一定的物理化學條件下，濃度達到過飽和狀態(tài)時就會結(jié)晶析出，如