常用蛋白還原劑和變性劑

1、常用蛋白還原劑1DTT中文名稱為二硫蘇糖醇（ Dithiothreitol ，簡稱為 DTT ），是蘇糖醇的 C-1 及 C-4 位羥基 置換成巰基的化合物。 在生化反應(yīng)中用做還原劑， 保護(hù)蛋白質(zhì)或酶中的巰基不致氧化而失活。 也常用于還原蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵等。DTT 是一種小分子有機(jī)還原劑，化學(xué)式為C4H10O2S2 。其還原狀態(tài)下為線性分子，被氧化后變?yōu)榘蜴I的六元環(huán)狀結(jié)構(gòu)。二硫蘇糖醇的名字衍生自蘇糖（一種四碳單糖） 。 DTT的異構(gòu)體為二硫赤糖醇（DTE ）,即DTT的C3-差向異構(gòu)體。DTT 也常常被用于蛋白質(zhì)中二硫鍵的還原，可用于阻止蛋白質(zhì)中的半胱氨酸之間所形 成的蛋白質(zhì)分子內(nèi)或

2、分子間二硫鍵。但 DTT 往往無法還原包埋于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)部（溶劑不 可及） 的二硫鍵，這類二硫鍵的還原常常需要先將蛋白質(zhì)變性 （高溫加熱或加入變性劑，如 6M 鹽酸胍、 8M 尿素或 1% SDS） 。反之，根據(jù) DTT 存在情況下， 二硫鍵還原速度的不同， 可以判斷其包埋程度的深淺。2. B -巰基乙醇英文名稱： Mercaptoethanol，化學(xué)式：HOCH2CH2SH，分子量：78.13，是一種具有 特殊臭味的無色透明液體，易燃、易溶于水和醇、醚等多種有機(jī)溶劑。3 -巰基乙醇（又稱為2-巰基乙醇、1-硫代乙二醇、2-羥基乙硫醇、3 -硫醇代乙醇）是一 種有機(jī)化合物，其化學(xué)式為HOCH2

3、CH2SH，英文通用縮寫為 ME或3 -ME。它兼具乙二醇（HOCH2CH2OH ）和乙二硫醇（ HSCH2CH2SH ）的官能團(tuán)，為揮發(fā)性液體，具有較強(qiáng)烈的 刺激性氣味。 3 -ME 通常用于二硫鍵的還原，可以作為生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的抗氧化劑。它被廣 泛使用的原因是它的羥基使它能夠溶解于水中， 并且降低它的揮發(fā)性。 由于具有較低的蒸汽 壓，它的難聞的情況比起惡臭的硫醇要好得多。2-巰基乙醇可以打開蛋白質(zhì)中存在的二硫鍵：cysS-Scys+2HOCH2CH2SH宀2cysSH+HOCH2CH2S-SCH2CH2OH ，二硫鍵被打開后可以使蛋白質(zhì)的四級或三級結(jié)構(gòu)被破壞。由于2-巰基乙醇能夠打開蛋白質(zhì)的

4、結(jié)構(gòu)，它常常被用于蛋白質(zhì)分析。而 2-巰基乙醇也常常被用于保護(hù)蛋白質(zhì)中自由的半胱氨酸巰基之間不會錯誤形成二硫鍵。作為還原劑， 2-巰基乙醇常?？梢耘c二硫蘇糖醇（DTT ）或三（2-甲酰乙基）膦鹽酸鹽（TCEP）互換使用。2-巰基乙醇是少數(shù)幾種被發(fā)現(xiàn)可以延長小鼠壽命的化合物。在微克量級水平上，2-巰基乙醇被觀察到對實(shí)驗(yàn)鼠的生命具有多種可能的正面效應(yīng)。3. TCEP化學(xué)名稱：三（2-羧乙基）膦；英文名稱：Tris（2-carboxyethyl）phosphine （TCEP）;分子量： 250.19。無色透明液體，不溶于脂肪烴，微溶于水，溶于醇、酮、酯、醚、苯、甲苯、二甲 苯等，能與氯仿及四氯化碳

5、混溶，與醋酸纖維素、硝酸纖維素、醋酸丁酸纖維素、乙基纖維 素、聚氯乙烯、酚醛樹脂、聚丙烯酸酯等高聚物相容性好。TCEP 是一種非常有效的硫醇類還原劑， 廣泛用作蛋白質(zhì)化學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)研究中二硫 鍵的定量還原劑。 該試劑在水溶液中的穩(wěn)定性和溶解性都很好。 在酸性、 堿性溶液中的穩(wěn)定 性也不錯。與其他類別的硫醇類還原劑如 DTT 相比， TCEP 不僅是一種高效的二硫鍵還原 劑，而且在某些巰基的交聯(lián)反應(yīng)中不需要除掉。 因而在蛋白質(zhì)化學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)研究常常優(yōu) 先選擇 TCEP。TCEP 在很寬的 PH 值范圍內(nèi)都可以選擇性定量地還原哪怕水溶性很差的烷基類二硫化 合物。通常室溫下反應(yīng)不到 5 分鐘就可

6、以完成。 TCEP 沒有難聞的氣味，而且在空氣中不怕 氧化。補(bǔ)充：DTT , beta-巰基乙醇，TCEP等是巰基類還原劑。還原劑可以保護(hù)蛋白質(zhì)上自 由的巰基不被氧化， 從而避免蛋白質(zhì)的聚集或變性。 在結(jié)晶實(shí)驗(yàn)中， 一般使用的還原劑工作 濃度是 110 mM 。beta-巰基乙醇是上述三種還原劑中還原能力最差的一個，因?yàn)樗旧碇挥幸粋€巰基。它的效果一般只能維持 2 3天。因此，在實(shí)驗(yàn)中要每隔 2-3天補(bǔ)加一次beta毓基乙醇來維 持它的作用。由于 beta-巰基乙醇是揮發(fā)性的，因此，可以在池液中加入beta毓基乙醇，禾U用它的揮發(fā)擴(kuò)散到液滴中去。二硫蘇糖醇DTT有兩個巰基基團(tuán)，其作用能維持 3

7、 7天。DTT的揮發(fā)性不像beta-巰 基乙醇那么強(qiáng)， 所以使用時應(yīng)該直接加入到懸滴中去。 DTT 還可以通過微透析的方法加入。TCEP的還原能力比beta-巰基乙醇和DTT都強(qiáng)，它的作用可以維持 2 3周。TCEP能 使結(jié)晶用的緩沖液酸化。與 DTT 類似， TCEP 需要直接加入到懸滴中，因此可以考慮微透 析法。beta-巰基乙醇，DTT，和TECP的作用機(jī)制可能不同。像其他添加劑一樣，如果你發(fā)現(xiàn) 一類物質(zhì)對樣品的穩(wěn)定性和結(jié)晶有禾，則可以去篩選這一類物質(zhì)中最適合你的樣品的一種。 我們建議是，最好這三種還原劑都嘗試一下，去發(fā)現(xiàn)最適合的。還原劑可以與金屬離子結(jié)合， 金屬離子其被還原， 而還原劑

8、的作用被抑制。 這就使得用 重金屬原子作同晶置換法遇到了麻煩?？梢允褂?EDTA 來避免還原劑被金屬離子抑制。但 是，如果金屬離子是你的樣品蛋白維持活性所必須的，就要小心使用EDTA 了。堿性條件下，beta-巰基乙醇和TECP更穩(wěn)定，效果要好于 DTT。酸性條件下，TCEP的 穩(wěn)定性也要好過 DTT。DTT可以使Ni被還原，因此在用 Ni柱純化His標(biāo)簽的蛋白時要避免使用 DTT，而應(yīng) 該考慮beta-巰基乙醇和TECP。半胱氨酸也是一種還原劑。 在結(jié)晶實(shí)驗(yàn)中， 半胱氨酸局限性很明顯， 那是由于它容易形 成六角形的晶體。但是， 半胱氨酸是一種有效的添加劑， 能帶來明顯的效果，不過需要銘記 它

9、的局限性。如果預(yù)期到蛋白會被氧化， 從制備樣品開始就要加入還原劑， 并且在整個流程中要不斷 補(bǔ)加保證其效果。在懸滴法中， 可以在池液里加入還原劑，禾用還原劑的揮發(fā)擴(kuò)散，保證懸 滴中還原性的環(huán)境。在確定還原劑和樣品比例時， 需要考慮樣品上自由巰基的數(shù)目和樣品濃度。 自由巰基數(shù) 目越多，樣品濃度越高，還原劑的用量就越大。含砷化合物與還原劑不能共用。 二甲胂和 二甲胂酸鈉是結(jié)晶中常使用的含砷化合物， 它們不能與還原劑共同使用。 其他不能與還原劑一起使用的物質(zhì)還包括： 硝酸銨，過氧化氫， 高氯酸鉀， 硝酸鈉。 在使用某種物質(zhì)之前， 應(yīng)該先查閱 Material Safety Data Sheet (M

10、SDS) 。 4.SDSSDS 是一種陰離子去污劑，它能破壞蛋白質(zhì)分子之間以及其它物質(zhì)分子之間的非共價 鍵。在強(qiáng)還原劑如巰基乙醇或二硫蘇糖醇的存在下，蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被打開并解聚成多肽鏈。解聚后的蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì) -SDS復(fù)合物，復(fù)合物所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，這就消除了不同蛋白質(zhì)分子之間原有的 電荷差異，蛋白質(zhì) -SDS 復(fù)合物在溶液中的形狀像一個長橢圓棒。 SDS-PAGE 不僅可以分離 鑒定蛋白質(zhì)，而且可以根據(jù)遷移率大小測定蛋白質(zhì)亞基的分子量。DTT 和巰基乙醇相比，作用相似，但 DTT 的刺激性氣味要小很多，毒性也比巰基乙醇 低很多

11、。而且 DTT 比巰基乙醇的濃度低 7 倍時，兩者效果相近。但 DTT 價格略高一些。 DTT 有兩個巰基集團(tuán)，巰基乙醇只有一個巰基集團(tuán)。常用蛋白變性劑鹽酸胍和尿素尿素和鹽酸胍在高濃度 （48 mol/L） 水溶液時能斷裂氫鍵， 從而使蛋白質(zhì)發(fā)生不同程度的 變性。 同事，還可以通過增大疏水基酸性殘基在水相中的溶解度， 降低疏水相互作用。 在室 溫下 46 mol/L 尿素和 34 mol/L 鹽酸胍，可使球狀蛋白質(zhì)從天然狀態(tài)轉(zhuǎn)變至變性狀態(tài)的中 點(diǎn)，通常增加變性劑濃度可提高變性程度，通常 8 mol/L 尿素的變性能力強(qiáng)。一些球狀蛋白 質(zhì)，甚至在 8 mol/L 尿素溶液中也不能完全變性，然而在

12、 8 mol/L 鹽酸胍溶液中，他們一般 以無規(guī)則卷曲 （完全變性 ） 構(gòu)象狀態(tài)存在。尿素和鹽酸胍引起的變性包括兩種機(jī)制：1、變性蛋白質(zhì)能與尿素和鹽酸胍優(yōu)先結(jié)合，形成變性蛋白質(zhì)-變性齊愎合物，當(dāng)復(fù)合物被除去，從而引起Nt D反應(yīng)平衡向右移動。隨著變性劑濃度的著呢國家， 天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)不斷轉(zhuǎn)變?yōu)閺?fù)合物， 最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)完全變性。 然而， 由于變性齊與變性蛋白的結(jié)合是非常弱的。 因此， 只有高濃度的變性齊才能引起蛋白 質(zhì)完全變性； 2、尿素與鹽酸胍對誰說氨基酸殘基的增溶作用。因?yàn)槟蛩睾望}酸胍都具有形 成氫鍵的能力， 當(dāng)他們在高濃度時， 可以破壞水的氫鍵結(jié)構(gòu)， 結(jié)果尿素和鹽酸胍就成為非極 性殘基的較