組織細(xì)胞的三維培養(yǎng)實(shí)用教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1組織細(xì)胞的三維培養(yǎng)組織細(xì)胞的三維培養(yǎng)(piyng)第一頁(yè)，共29頁(yè)。n概念概念n三維培養(yǎng)的構(gòu)成三維培養(yǎng)的構(gòu)成(guchng)n三維培養(yǎng)的特點(diǎn)三維培養(yǎng)的特點(diǎn)n三維培養(yǎng)的方法三維培養(yǎng)的方法n研究方法研究方法n三維培養(yǎng)的應(yīng)用三維培養(yǎng)的應(yīng)用n展望展望第1頁(yè)/共29頁(yè)第二頁(yè)，共29頁(yè)。一、三維培養(yǎng)一、三維培養(yǎng)(piyng)的概念的概念n相對(duì)于單層細(xì)胞的二維培養(yǎng)而言，利用各相對(duì)于單層細(xì)胞的二維培養(yǎng)而言，利用各種方法及材料，使細(xì)胞呈空間立體方式生種方法及材料，使細(xì)胞呈空間立體方式生長(zhǎng)，形成長(zhǎng)，形成(xngchng)(xngchng)類似體內(nèi)組織的結(jié)構(gòu)，類似體內(nèi)組織的結(jié)構(gòu)，發(fā)揮其功能發(fā)揮其功能第2頁(yè)/

2、共29頁(yè)第三頁(yè)，共29頁(yè)。二、三維培養(yǎng)二、三維培養(yǎng)(piyng)的構(gòu)成的構(gòu)成1 1、輔助物：人工軟骨、輔助物：人工軟骨11、PETPET聚乙烯酯聚乙烯酯22、纖維蛋白支架纖維蛋白支架33、膠原支架、膠原支架4-54-5、旋轉(zhuǎn)、旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器生物反應(yīng)器66、微膠囊、微膠囊77、中空纖維、中空纖維882 2、細(xì)胞：原代組織細(xì)胞大鼠肝、軟骨、細(xì)胞：原代組織細(xì)胞大鼠肝、軟骨、 脂肪脂肪(zhfng)9(zhfng)9、成骨樣細(xì)胞、干細(xì)胞、成骨樣細(xì)胞、干細(xì)胞1010、 腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞1111第3頁(yè)/共29頁(yè)第四頁(yè)，共29頁(yè)。三、三維培養(yǎng)三、三維培養(yǎng)(piyng)的特點(diǎn)的特點(diǎn)1 1、生長(zhǎng)特點(diǎn)：三維結(jié)構(gòu)、

3、異質(zhì)性、生長(zhǎng)速率、生長(zhǎng)特點(diǎn)：三維結(jié)構(gòu)、異質(zhì)性、生長(zhǎng)速率及氧氣、葡萄糖等梯度及氧氣、葡萄糖等梯度(t d)(t d)分布分布2 2、組織學(xué)特點(diǎn)：細(xì)胞分三層（直徑、組織學(xué)特點(diǎn)：細(xì)胞分三層（直徑300300m m） 可有類似組織基質(zhì)的物質(zhì)產(chǎn)生可有類似組織基質(zhì)的物質(zhì)產(chǎn)生3 3、生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)：三維培養(yǎng)細(xì)胞以、生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)：三維培養(yǎng)細(xì)胞以G1/G0G1/G0期細(xì)期細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)，胞占優(yōu)勢(shì)，S S期細(xì)胞較少期細(xì)胞較少 第4頁(yè)/共29頁(yè)第五頁(yè)，共29頁(yè)。四、三維培養(yǎng)四、三維培養(yǎng)(piyng)的方法的方法1 1、旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)：旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)或培養(yǎng)瓶，、旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)：旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)或培養(yǎng)瓶，旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器同時(shí)旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)

4、器同時(shí)(tngsh)(tngsh)產(chǎn)生較多量產(chǎn)生較多量直徑為直徑為1 12mm2mm的細(xì)胞球的細(xì)胞球2 2、非黏附物包被的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿：瓊脂、非黏附物包被的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿：瓊脂、瓊脂糖、蛋白聚糖、聚苯乙烯瓊脂糖、蛋白聚糖、聚苯乙烯3 3、支架、支架第5頁(yè)/共29頁(yè)第六頁(yè)，共29頁(yè)。五、研究五、研究(ynji)方法方法1 1、細(xì)胞、細(xì)胞(xbo)(xbo)生長(zhǎng)及形態(tài)：體生長(zhǎng)及形態(tài)：體積直徑積直徑 免疫組化免疫組化（BrdUBrdU、PCNAPCNA、Ki-67Ki-67） 流式細(xì)胞流式細(xì)胞(xbo)(xbo)儀（儀（DNADNAHoechst33342Hoechst33342、PIPI） 電鏡

5、電鏡2 2、細(xì)胞、細(xì)胞(xbo)(xbo)球的生理特性：球的生理特性：微電極（微電極（pO2 or pHpO2 or pH） NMR( NMR(脂代脂代謝謝) ) 生物體發(fā)生物體發(fā)光技術(shù)（光技術(shù)（ATPATP、LactateLactate、glucoseglucose）第6頁(yè)/共29頁(yè)第七頁(yè)，共29頁(yè)。六、三維培養(yǎng)六、三維培養(yǎng)(piyng)的應(yīng)用的應(yīng)用1 1、實(shí)驗(yàn)性治療、實(shí)驗(yàn)性治療 放射效應(yīng)放射效應(yīng)1212：分化程度影響：分化程度影響(yngxing)(yngxing)放療效果放療效果 藥物耐受藥物耐受1313：培養(yǎng)方式是決定耐藥的：培養(yǎng)方式是決定耐藥的因素之一因素之一 免疫療法免疫療法141

6、4：腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞作：腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞作用用第7頁(yè)/共29頁(yè)第八頁(yè)，共29頁(yè)。2 2、代謝及代謝環(huán)境研究、代謝及代謝環(huán)境研究 三維培養(yǎng)的細(xì)胞可模擬腫瘤三維培養(yǎng)的細(xì)胞可模擬腫瘤生成中的無(wú)血管階段、微轉(zhuǎn)生成中的無(wú)血管階段、微轉(zhuǎn)移灶或毛細(xì)血管之間的微區(qū)移灶或毛細(xì)血管之間的微區(qū)域域 模擬在體細(xì)胞的環(huán)境：模擬在體細(xì)胞的環(huán)境： 良好生長(zhǎng)環(huán)境良好生長(zhǎng)環(huán)境 缺氧、缺乏營(yíng)養(yǎng)、廢物積缺氧、缺乏營(yíng)養(yǎng)、廢物積聚或聚或pHpH降低降低(jingd)(jingd)等協(xié)同等協(xié)同作用作用“toxic “toxic enviroment” 15enviroment” 15第8頁(yè)/共29頁(yè)第九頁(yè)，共29頁(yè)。3 3、細(xì)胞的生

7、物學(xué)特性、細(xì)胞的生物學(xué)特性 浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移：腫瘤細(xì)胞和浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移：腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)共培養(yǎng)（基質(zhì)共培養(yǎng)（E-cadherinE-cadherin、 ICAM-1 ICAM-1 ）16,1716,17 細(xì)胞黏附：研究細(xì)胞聚集細(xì)胞黏附：研究細(xì)胞聚集(jj)(jj)過(guò)程中黏附因子的作過(guò)程中黏附因子的作用用1818 血管形成：血管形成： VEGF VEGF（血管（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子）在惡性腫瘤內(nèi)皮生長(zhǎng)因子）在惡性腫瘤血管形成中起主要作用血管形成中起主要作用1919第9頁(yè)/共29頁(yè)第十頁(yè)，共29頁(yè)。4 4、實(shí)驗(yàn)性組織模型、實(shí)驗(yàn)性組織模型 移植物以組織或器官的方移植物以組織或器官的方式培養(yǎng)，使其在一定時(shí)間式培養(yǎng)，使

8、其在一定時(shí)間(shjin)(shjin)內(nèi)保持原有功能內(nèi)保持原有功能 簡(jiǎn)單的講：使細(xì)胞自發(fā)或簡(jiǎn)單的講：使細(xì)胞自發(fā)或借助人工基質(zhì)聚集并誘導(dǎo)細(xì)借助人工基質(zhì)聚集并誘導(dǎo)細(xì)胞分化、維持細(xì)胞功能胞分化、維持細(xì)胞功能 舉例：人工肝（肝細(xì)胞、舉例：人工肝（肝細(xì)胞、纖維細(xì)胞等與明膠海綿、瓊纖維細(xì)胞等與明膠海綿、瓊脂、膠原共培養(yǎng)）脂、膠原共培養(yǎng)）20-2220-22第10頁(yè)/共29頁(yè)第十一頁(yè)，共29頁(yè)。5 5、胚體干細(xì)胞與擬胚體、胚體干細(xì)胞與擬胚體 胚胎發(fā)育到囊胚期，此時(shí)胚胎發(fā)育到囊胚期，此時(shí)細(xì)胞分化為兩大類，即位于細(xì)胞分化為兩大類，即位于周邊的滋養(yǎng)層細(xì)胞和位于腔周邊的滋養(yǎng)層細(xì)胞和位于腔內(nèi)但居于一端的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)內(nèi)但

9、居于一端的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（inner cell mass ICMinner cell mass ICM）。）。只有只有ICMICM將來(lái)發(fā)育成胚胎本身，將來(lái)發(fā)育成胚胎本身，把把ICMICM從胚胎中分離出來(lái)在一從胚胎中分離出來(lái)在一定條件下培養(yǎng)，可形成具有定條件下培養(yǎng)，可形成具有無(wú)限無(wú)限(wxin)(wxin)增殖能力的細(xì)增殖能力的細(xì)胞群，稱為胚胎干細(xì)胞胞群，稱為胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells,ESembryonic stem cells,ES細(xì)胞）細(xì)胞） 當(dāng)當(dāng)ESES細(xì)胞經(jīng)過(guò)細(xì)胞經(jīng)過(guò)2 2天懸滴培天懸滴培養(yǎng)、養(yǎng)、2 2天懸浮培養(yǎng)后，可形成天懸浮培養(yǎng)后，可形成簡(jiǎn)單擬胚體（簡(jiǎn)單擬胚體（

10、3 3D D），擬胚），擬胚體內(nèi)包含著來(lái)源于三個(gè)胚層體內(nèi)包含著來(lái)源于三個(gè)胚層的不同細(xì)胞的不同細(xì)胞 第11頁(yè)/共29頁(yè)第十二頁(yè)，共29頁(yè)。微囊化腫瘤微囊化腫瘤(zhngli)細(xì)胞用于藥篩細(xì)胞用于藥篩第12頁(yè)/共29頁(yè)第十三頁(yè)，共29頁(yè)。1 1、抗腫瘤藥物篩選、抗腫瘤藥物篩選(shixun)(shixun)的研究現(xiàn)狀的研究現(xiàn)狀 多采用體外單層培養(yǎng)的腫瘤多采用體外單層培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞：簡(jiǎn)單細(xì)胞：簡(jiǎn)單(jindn)(jindn)、易操、易操作、費(fèi)用低、可大量應(yīng)用、作、費(fèi)用低、可大量應(yīng)用、生長(zhǎng)方式及環(huán)境與在體腫瘤生長(zhǎng)方式及環(huán)境與在體腫瘤差距較大差距較大 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：費(fèi)用高、生存條動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：費(fèi)用高、生存條件苛

11、刻、生長(zhǎng)方式及環(huán)境與件苛刻、生長(zhǎng)方式及環(huán)境與在體相似在體相似 手術(shù)切除標(biāo)本：回顧性研究、手術(shù)切除標(biāo)本：回顧性研究、不能動(dòng)態(tài)觀察不能動(dòng)態(tài)觀察 體外三維培養(yǎng)：模擬腫瘤生體外三維培養(yǎng)：模擬腫瘤生長(zhǎng)方式及環(huán)境、可大量應(yīng)用、長(zhǎng)方式及環(huán)境、可大量應(yīng)用、費(fèi)用較低，如費(fèi)用較低，如MCTSMCTS第13頁(yè)/共29頁(yè)第十四頁(yè)，共29頁(yè)。腫瘤腫瘤(zhngli)細(xì)胞在體與體外三維生長(zhǎng)細(xì)胞在體與體外三維生長(zhǎng)示意圖示意圖第14頁(yè)/共29頁(yè)第十五頁(yè)，共29頁(yè)。2、微囊化細(xì)胞、微囊化細(xì)胞(xbo)三維共培養(yǎng)特點(diǎn)三維共培養(yǎng)特點(diǎn)第15頁(yè)/共29頁(yè)第十六頁(yè)，共29頁(yè)。3 3、微囊化腫瘤細(xì)胞、微囊化腫瘤細(xì)胞(xbo)(xbo)的三

12、維培養(yǎng)的三維培養(yǎng)材料材料(cilio)：海藻酸鈉，聚賴氨酸，人乳：海藻酸鈉，聚賴氨酸，人乳腺癌腺癌 細(xì)胞系細(xì)胞系MCF-7方法：靜電液滴法方法：靜電液滴法第16頁(yè)/共29頁(yè)第十七頁(yè)，共29頁(yè)。Day 7Day 0Day 5Day 2第17頁(yè)/共29頁(yè)第十八頁(yè)，共29頁(yè)。4 4、藥物、藥物(yow)(yow)對(duì)三維生長(zhǎng)細(xì)胞的抑制對(duì)三維生長(zhǎng)細(xì)胞的抑制藥物：絲裂霉素（藥物：絲裂霉素（MCMC）、阿霉素（）、阿霉素（ADMADM）、）、5 5氟尿嘧啶（氟尿嘧啶（5 5FUFU）濃度濃度(nngd)(nngd)和作用時(shí)間：和作用時(shí)間：0.1ppc,1ppc0.1ppc,1ppc及及10ppc10ppc

13、Peak plasma concentration (ppc), the Peak plasma concentration (ppc), the highest level of drug that can be highest level of drug that can be obtained in the blood usually obtained in the blood usually following multiple doses, of ADM, MC following multiple doses, of ADM, MC and 5-FU was 0.4 and 5-F

14、U was 0.4 g/mL, 3.0 g/mL, 3.0 g/mL g/mL and 10 and 10 g/mL,g/mL, respectively . respectively . 分別作用分別作用24h, 48h, 72h24h, 48h, 72h第18頁(yè)/共29頁(yè)第十九頁(yè)，共29頁(yè)。bgafhc第19頁(yè)/共29頁(yè)第二十頁(yè)，共29頁(yè)。ejid第20頁(yè)/共29頁(yè)第二十一頁(yè)，共29頁(yè)。024487290100110120130140Diameter of cells spheroid(106m)Time (h) control 0.1ppc 1 ppc 10 ppc*第21頁(yè)/共29頁(yè)第

15、二十二頁(yè)，共29頁(yè)。244872556065707580859095100Inhibition Rate (%)Time (h) S 10 ppc M10 ppca*b0.1ppc1ppc10ppc-40-20020406080100Inhibition Rate (%)Drug concentration M 72 h S 72 h*第22頁(yè)/共29頁(yè)第二十三頁(yè)，共29頁(yè)。0.1ppc1ppc10ppc102030405060708090100Inhibition Rate (%)Drug Concentration M-MC 72 h M-ADM 72 h M-5-FU 72 ha*0.1

16、ppc1ppc10ppc-60-40-20020406080100Inhibition Rate (%)Drug Concentration S-MC 72 h S-ADM 72 h S-5-FU 72 hb*第23頁(yè)/共29頁(yè)第二十四頁(yè)，共29頁(yè)。七、展望七、展望(zhnwng)n胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用(yngyng)研究及胚胎發(fā)研究及胚胎發(fā)育育n致癌機(jī)制的研究致癌機(jī)制的研究第24頁(yè)/共29頁(yè)第二十五頁(yè)，共29頁(yè)。第25頁(yè)/共29頁(yè)第二十六頁(yè)，共29頁(yè)。11. Melvin Schindler, Ijaz Ahmed, Jabeen Kamal, Alam Nur-E-Kamal,

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