動(dòng)物組織基因組DNA的分離純化及鑒定

1、動(dòng)物組織基因組dna的分離純化及鑒定郝春霖（武漢大學(xué)藥學(xué)院，2009302590232）摘要：采用鹽溶法和有機(jī)溶劑抽捉分離純化豬肝基因組dna,并利用紫外吸收和二苯胺顯色 法進(jìn)行核酸定量和純度測(cè)定。制備的樣品a260/a280值在1.8附近，純度較高。但由紫外吸收 法數(shù)據(jù)計(jì)算出樣品dna濃度遠(yuǎn)大于二苯胺顯色法的計(jì)算結(jié)果，本文對(duì)數(shù)據(jù)差異做了相關(guān)討 論。abstract： the genomic dna of poker liver were isolated and purified by salting-in and organic agent extraction method in ord

2、er to determine the quantitative and to test the fineness of our sample, it has been reacted with diphenylamine to produce the color product and exposed to the uv to find its o.d value the a260/ a280 value of the sample is about 1.& which indicates itself highly purified. however, the data of th

3、e two different methods are so different that it confuses us. this essay discusses the differences deeply and analyzes the reasons for the results.關(guān)鍵詞：豬肝鹽溶法抽提基因組dna紫外吸收法二苯胺key words: poker liver salting-in method extract genomic dna uvpcx diphenylamine引言：制備組織基因組dna在基因結(jié)構(gòu)和功能的研究屮扮演著重要角色，是分了生物學(xué)研究 屮最重要的實(shí)

4、驗(yàn)操作技術(shù)之一，樣品分離純化的程度對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)起到?jīng)Q定性作川；而不 同種類(lèi)生物的基因組dna提収方法各界，同一生物的不同組織或器官也因莫細(xì)胞結(jié)構(gòu)及成 分差異，而需采用不同的提取方法。通常要求所得到的dna片段長(zhǎng)度應(yīng)不小于100kb,在提 取過(guò)程中要盡可能排除可使dna斷裂和降解的各種物理、化學(xué)或生物因索，以保證樣品以 結(jié)構(gòu)的完整。鹽溶法是制備基因紐dna的常規(guī)操作技術(shù)，在溶解細(xì)胞，核蛋白釋放后，根據(jù)dna 不溶于0.14mol/lnacl溶液而rna可溶的特性將dna核蛋口與rna核蛋白分離，得到粗 品。粗品中主要成分為dna和蛋白質(zhì)，用酚/氯仿併戊醇進(jìn)行抽提，可除去其中的蛋白質(zhì)。 再加入一

5、定量的界丙醇或乙醇，較長(zhǎng)的基因組dna分子將形成纖維狀絮團(tuán)漂浮其中，而質(zhì) 粒或細(xì)胞器屮的小分了 dna則只能形成顆粒狀沉淀物附著在容器壁或底部，用玻棒挑出纖 維狀絮團(tuán)即可達(dá)到比鮫滿(mǎn)意的分離效果，得到純度較高的基因組dnac核酸中喋吟環(huán)和唏呢環(huán)的共軌雙鍵系統(tǒng)在260nm處冇最大吸收峰，故可采川紫外光吸 收法對(duì)樣品進(jìn)行定最和純度測(cè)定。本文還利用二苯胺與核酸的顏色反應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行了定最測(cè) 定。1實(shí)驗(yàn)部分1.1儀器與試劑722s型對(duì)見(jiàn)光光度計(jì)、紫外分光光度計(jì)、冷凍離心機(jī)、水浴鍋、燒杯、量簡(jiǎn)、玻璃棒、三 角瓶、離心管、ep管等。sc緩沖液,5%sds溶液,95%乙醇、氯仿、異戊醇,固體氯化鈉等。1.2材料

6、新鮮豬肝1.3豬肝基因組dna的分離純化取新鮮豬肝4.0g,用sc緩沖液洗血，低溫剪碎后，加入s.omlsc溶液搗碎，將勻漿 裝入離心管，平衡后于4000r/min離心lomin,棄上層rna提取液；將下層加入sc溶液 5.0ml混勻、平衡后，再次于4000r/min離心lomin,棄上層；下層沉淀轉(zhuǎn)入三角瓶，加入 sc溶液20.0ml, 3mlsds溶液混勻，15ml氯仿/異戊醇混勻；再加入固體氯化鈉1.2g,邊 加邊混勻，充分震蕩30min；于4000r/min離心20min；取出離心管后可觀察到內(nèi)容物分為 三層，取上層水相（dna溶于水相中），加入等體積氯仿/：片戊醇振蕩lomin,于4

7、000r/min 離心20min；取上清，加等體積95%冷乙醇，邊加邊向一個(gè)方向緩緩攪拌，町觀察到纖維狀 絮團(tuán)逐漸纏繞在玻棒上。用玻棒挑出dna絮團(tuán)，用少最95%乙醉淋洗一次麻，輕輕擠壓排 盡吸附的乙醇，將絮團(tuán)裝入ep管，加lnilsc溶液封存。1.4紫外吸收法取1.3中樣品,加入lomlnaoh, 8000r/min離心5min,取上清進(jìn)行稀釋,當(dāng)稀釋比為 1： 10 和 1： 15 時(shí)，以 ddhzo 調(diào)零，測(cè) a260>a280.1.5二苯胺顯色法按tab-1.5配制各號(hào)試管:試劑012345樣品1（1： 15）樣品2（1： 10）dna標(biāo)準(zhǔn)溶液（200u g/ml）/ml00.4

8、0.81.21.62.02.0ml樣液2.0ml樣液ddh?o/ml2.01.61.20.80.4000二苯胺溶液/ml4.04.04.04.04.04.04.04.0tab-1.5.1混勻后,于60°c水浴lh,冷卻后，測(cè)a595.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析討論2.1實(shí)驗(yàn)結(jié)呆紫外吸收法結(jié)果見(jiàn)tab-2.1.1項(xiàng)目樣液 1 （1： 15）樣液 2 （1： 10）o.d.2602.2652.998o.d.2801.2481.63826（/ 人2801.811.83tab-2.1.1二苯胺顯色法結(jié)果見(jiàn)tab-2.1.2試劑012345樣品1（1： 15）樣品2（1： 10）o.d.59500.12

9、20.2240.3210.4070.4780.1030.164tab-2.1.2由tab-2.1.2中笫0到5號(hào)管o.d.值結(jié)果，dna含量為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)，繪制dna標(biāo)準(zhǔn)曲線如fig-2.1.1dna含量標(biāo)準(zhǔn)曲線s6sq00 111110100200300400500fig2.1.1dna 含量 pg山標(biāo)準(zhǔn)曲線作圖可知，樣液1和樣液2的dna含量分別為：65.25116.08 pg,樣液濃度分別為：32.63 u g/ml> 58.04 u g/ml.稀釋前原液濃度為：534.93 u g/ml, 10inl原液 共含 dna5349.3 p g.按紫外吸收法結(jié)果計(jì)算，樣液1和

10、樣液2的dna濃度分別為：113.25 n g/ml、149.9 u g/ml.稀釋前原液濃度為：1598.88 u g/ml, 10ml 原液共含 dna15988.8 u g. (10.d=50u g/ml)2. 2結(jié)果分析與討論2.2.1紫外吸收法與二苯胺顯色法結(jié)果差異分析紫外吸收法所得數(shù)據(jù)計(jì)算出dna原液濃度為1598.88 m g/ml,總量為15988.8 ug,而 二苯胺顯色法數(shù)據(jù)計(jì)算結(jié)果為，dna原液濃度534.93 u g/ml,總量5349.3 ug；示者僅為 前者的33.46%.原因分析如下：紫外吸收法利用dna溶液在260nm處有最大吸收峰的特性，對(duì)其進(jìn)行定量測(cè)定。而

11、rna的最大吸收峰也在260nm處，故當(dāng)樣品中混冇較多rna時(shí)，會(huì)干擾dna含雖的測(cè)定, 實(shí)際測(cè)定結(jié)果應(yīng)該是dna和rna光吸收值的總和。dna在260nm與280nm處的吸光度比值為1.8, rna在260nm與280nm處的吸光度 比值在2.0以上，當(dāng)樣品中存在rna時(shí)，a26(/ a28o會(huì)升咼。實(shí)驗(yàn)中i從j個(gè)稀釋度的a260/ a28o 值均大于1.8, r稀釋度小的比值升高更多，表明樣品中含冇一定量的rnao紫外吸收法測(cè)定樣品dna含最時(shí)，樣品屮其他具有紫外吸收特性的物質(zhì)也會(huì)影響測(cè)定 結(jié)果。蛋口質(zhì)的紫外吸收峰在280nm處，其在260nm處的吸光度不到核酸的1/10,因此樣 晶中少量

12、存在的蛋口質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果影響不大。另外，在采用紫外吸收法測(cè)定dna含量時(shí)，應(yīng)固定ph值，否則結(jié)果也會(huì)受到相應(yīng)影 響。在二苯胺顯色法屮，dna在酸性條件下加熱，其嚓吟堿與脫氧核糖間的糖廿鍵斷裂， 主成喋吟堿、2-脫氧核糖和脫氧嚅噪核井酸，其小2-脫氧核糖在酸性環(huán)境屮加熱脫水住成3 -嶷基酮皋戊糖，進(jìn)而與二苯胺試劑產(chǎn)生藍(lán)色的顏色反應(yīng)，rna卻不能在此條件下與二 苯胺試劑產(chǎn)生顏色反應(yīng)，樣品中少量的rna并不影響測(cè)定。但蛋白質(zhì)、多種糖類(lèi)及其衍生 物、醛等可與二苯胺產(chǎn)生顏色反應(yīng)，從而十?dāng)_dna的定量。木實(shí)驗(yàn)中，二苯胺顯色法各錚 試劑配制時(shí)沒(méi)有特別造成酸性環(huán)境，冇可能使得顏色反應(yīng)不充分，而使相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)偏低。 2.2.2 dna含量標(biāo)準(zhǔn)曲線不過(guò)原點(diǎn)按照理論，dna含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)該是一條過(guò)原點(diǎn)的直線，但實(shí)驗(yàn)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線向y 軸正向偏移0.0247個(gè)單位，其原因可能是分光光度計(jì)的系統(tǒng)謀差，也可能是操作失謀引起