藥物QT間期延長潛在作用非臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則-附件7

1、附件7藥物qt間期延長潛在作用非臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則、概述心電圖（ecg）中qt間期（從qrs波群開始到t波結(jié)束）反映心 室去極化和復(fù)極化所需的時間。當(dāng)心室復(fù)極化延遲和qt間期延長，尤其 伴有其他風(fēng)險因素（如低血鉀、結(jié)構(gòu)性心臟病、心動過緩）時，患者發(fā)生 室性快速心律失常的風(fēng)險增加，包括尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動過速（torsade de pointes, tdp ）o本指導(dǎo)原則主要是關(guān)于評價受試物延遲心室復(fù)極化潛在作用的非臨 床研究策略，以及對非臨床研究信息的分析和綜合風(fēng)險性評估。qt間期 研究結(jié)果可以和其他信息一起，用來闡明藥物作用機制，以及對人體的延 遲心室復(fù)極化和延長qt間期的風(fēng)險評估。本指導(dǎo)原

2、則適用于中藥、天然藥物和化學(xué)藥物。二、基本原則（一）試驗方法藥物安全藥理學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則中所述的關(guān)于研究設(shè)計的基本 原則和推薦方法，也適用于本指導(dǎo)原則。建議采用體內(nèi)和體外的方法進行 研究。應(yīng)基于受試物的藥效學(xué)、藥代動力學(xué)、安全性的特點對研究方法設(shè)計、 風(fēng)險性證據(jù)進行個體化分析。（二）執(zhí)行g(shù)lp的要求體外試驗建議執(zhí)行藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范（glp）規(guī)范， 體內(nèi)試驗遵循glp，追加研究（follow-up studies ）應(yīng)在最大可行限度內(nèi) 遵循glpo（三）受試物中藥、天然藥物：受試物應(yīng)采用能充分代表臨床試驗擬用樣品和/或 上市樣品質(zhì)量和安全性的樣品。應(yīng)采用工藝路線及關(guān)鍵工藝參數(shù)確定后的

3、 工藝制備，一般應(yīng)為中試或中試以上規(guī)模的樣品，否則應(yīng)有充分的理由。 應(yīng)注明受試物的名稱、來源、批號、含量（或規(guī)格）、保存條件、有效期 及配制方法等，并提供質(zhì)量檢驗報告。由于中藥的特殊性，建議現(xiàn)用現(xiàn)配, 否則應(yīng)提供數(shù)據(jù)支持配制后受試物的質(zhì)量穩(wěn)定性及均勻性。當(dāng)給藥時間較 長時，應(yīng)考察配制后體積是否存在隨放置時間延長而膨脹造成終濃度不準(zhǔn) 的因素。如果由于給藥容量或給藥方法限制，可采用原料藥進行試驗。試 驗中所用溶媒和/或輔料應(yīng)標(biāo)明名稱、標(biāo)準(zhǔn)、批號、有效期、規(guī)格及生產(chǎn) 單位。化學(xué)藥物：受試物應(yīng)采用工藝相對穩(wěn)定、純度和雜質(zhì)含量能反映臨床 試驗擬用樣品和/或上市樣品質(zhì)量和安全性的樣品。受試物應(yīng)注明名稱.

4、來源、批號、含量（或規(guī)格）、保存條件、有效期及配制方法等，并提供 質(zhì)量檢驗報告。試驗中所用溶媒和/或輔料應(yīng)標(biāo)明名稱、標(biāo)準(zhǔn)、批號、有 效期、規(guī)格和生產(chǎn)單位等，并符合試驗要求。在藥物研發(fā)的過程中，若受試物的工藝發(fā)生可能影響其安全性的變 化，應(yīng)進行相應(yīng)的安全性研究。化學(xué)藥物試驗過程中應(yīng)進行受試物樣品分析，并提供樣品分析報告。 成分基本清楚的中藥、天然藥物也應(yīng)進行受試物樣品分析。三、基本內(nèi)容()試驗設(shè)計的基本要求1. 生物材料應(yīng)選擇合適的試驗體系和動物種屬。體外研究可采用離體心肌細胞、培養(yǎng)心肌細胞系或克隆的人離子通道的異種表達體系、離體心臟標(biāo)本。 用于體外研究的組織和細胞標(biāo)本可來源于不同的實驗動物，包

5、括兔、雪貂、 豚鼠、犬、豬。當(dāng)采用原代組織或細胞時，應(yīng)考慮所用標(biāo)本的特點及來源, 因為離子通道的分布可因組織和細胞類型而不同。用于整體研究的動物包括犬、猴、豬、兔、雪貂以及豚鼠。成年大鼠和小鼠復(fù)極化的離子機制不同于包括人在內(nèi)的大動物種屬(在成年大鼠、小鼠，復(fù)極化的主要離子流是it。)，因此用這些種屬的組 織或動物是不合適的。實驗動物應(yīng)符合國家對相應(yīng)等級動物的質(zhì)量規(guī)定要求，并具有實驗動 物質(zhì)量合格證明。2. 樣本量體外試驗：體外樣本量每組不少于4個平行樣本，一般35個組。體內(nèi)試驗：試驗組的組數(shù)及每組動物數(shù)的設(shè)定，應(yīng)以能夠科學(xué)合理地 分析所獲得的試驗結(jié)果，恰當(dāng)?shù)胤从秤猩飳W(xué)意義的作用，并符合統(tǒng)計學(xué)

6、 要求為原則。小動物每組一般不少于10只，大動物每組一般不少于6只, 一般雌雄各半。3 劑量體外研究中，受試物的濃度應(yīng)涵蓋和超過預(yù)期臨床最大治療血藥濃 度。試驗中逐步提高藥物濃度直到出現(xiàn)特征性的濃度反應(yīng)曲線或達到因 受試物理化特性所限的最高濃度。除了受到細胞或組織活性的限制外，理 想狀態(tài)下應(yīng)有充分的藥物暴露時間以獲得穩(wěn)態(tài)電生理效應(yīng)，應(yīng)注明藥物暴 露時間的長短。體外研究中應(yīng)使用合適的陽性對照藥，以確認該體外試驗 系統(tǒng)的敏感性。體外研究應(yīng)確定受試物的濃度效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)體外研究無明顯作用 時，應(yīng)對濃度選擇的范圍進行說明。整體試驗劑量范圍應(yīng)與藥物安全藥理學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則的原則 一致。如果可能，劑量范圍

7、應(yīng)包括和超過預(yù)期的人暴露水平。當(dāng)給藥劑量 可能會因動物的耐受性而受到限制時，如動物出現(xiàn)嘔吐.震顫、活動過度 等，可采用靜脈給藥或麻醉動物進行研究。當(dāng)研究用于評價延遲心室復(fù)極 化程度與原藥及代謝產(chǎn)物濃度關(guān)系時，可采用持續(xù)靜脈滴注的方式控制藥 物暴露水平。監(jiān)測受試物及其代謝產(chǎn)物的暴露量有助于解釋藥物的量效關(guān) 系或劑量或濃度反應(yīng)，也為設(shè)計可能追加的試驗提供信息。4 對照體外離子通道和動作電位時程試驗中應(yīng)采用次最大有效濃度（即藥物對通道的抑制率達70%80%時的濃度）的陽性對照藥說明試驗系統(tǒng)的反應(yīng)性，并且應(yīng)用于每項試驗。整體試驗研究中使用陽性對照藥則是為了驗證試驗系統(tǒng)的敏感性，但不必在每一項試驗中都使

8、用陽性對照藥。如受試物在化學(xué)結(jié)構(gòu)/藥理分類上屬于與延長人體qt間期或促心律 失常有關(guān)的藥物時，在體內(nèi)外研究中應(yīng)與現(xiàn)有同類藥物比作用強度。5 給藥途徑 整體動物試驗，首先應(yīng)考慮與臨床擬用途徑一致，可以考慮充分暴露的給藥途徑。對于在動物試驗中難以實施的特殊的臨床給藥途徑，可根據(jù) 受試物的特點選擇，并說明理由。6 觀察時間結(jié)合受試物的藥效學(xué)和藥代動力學(xué)特性、實驗動物、臨床試驗方案等因素選擇觀察時間點和持續(xù)時間。（二）主要研究內(nèi)容1 主要研究1.1采用離體動物或人心肌細胞、培養(yǎng)心肌細胞系或克隆的人離子通 道的異種表達體系測定離子流。1.2測定清醒或麻醉動物的ecg參數(shù)。1.3在離體心臟標(biāo)本進行動作電位

9、參數(shù)測定，或在麻醉動物中進行能 體現(xiàn)動作電位時程的特異性電生理參數(shù)檢測。1.4在離體心臟標(biāo)本或動物進行致心律失常作用測定?？上冗M行1.1. 1.2研究，再進行1.3、1.4研究。綜上所述，可采用體內(nèi)外方法從4個不同方面對受試物的qt間期作用進行研究，并且相互之間有互補作用。2 追加研究當(dāng)非臨床研究的結(jié)果不一致，和/或臨床研究結(jié)果與非臨床研究結(jié)果 不一致時，可通過回顧性評價和追加研究進行分析。此種情況下，追加的 研究結(jié)果可能成為綜合風(fēng)險評估的重要組成部分。追加的研究是為了更深入地了解或提供更多的關(guān)于受試物潛在的延 遲人心室復(fù)極化和延長qt間期的作用。這些研究可以提供更多有關(guān)作用 強度、作用機制、

10、劑量反應(yīng)曲線的斜率或最大反應(yīng)幅度的信息。追加的研 究可以針對某一特殊問題設(shè)計試驗，因此各種體外或體內(nèi)的研究設(shè)計都可 應(yīng)用。在選擇和設(shè)計追加研究中，以下內(nèi)容需與已有的非臨床和臨床信息一 并考慮：用離體心臟測量記錄動作電位以評價心室肌復(fù)極化；在麻醉動物用一些能反映動作電位時程的特殊電生理參數(shù)；動物的種類和性別的選擇；用代謝誘導(dǎo)劑或抑制劑；用目前已知陽性對照物或參比物；未研究的對其他通道的抑制作用；多時間點測定電生理參數(shù)；在清醒動物難以解釋的作用，如受試物對心率、自主神經(jīng)緊張的影 響，或受試物的毒性，如震顫、抽搐或嘔吐；如藥物有蓄積、臨床長期使用，需考慮多次給藥的觀察。u!綜合風(fēng)險評估應(yīng)該是基于科學(xué)

11、的、對受試物個性化的考慮。這種綜合風(fēng)險性評估有益于臨床研究設(shè)計和其結(jié)果的分析。應(yīng)結(jié)合藥效學(xué)、毒理學(xué)、 藥代動力學(xué)以及其他研究資料進行綜合評價，為藥物應(yīng)用于人體的安全性 提出建議。風(fēng)險評估應(yīng)考慮受試物是否在化學(xué)結(jié)構(gòu)或藥理分類上屬于可延長人 qt間期作用的藥物，如某些抗精神病類藥物、組胺hi受體拮抗劑、氟唾 諾酮類等。這可能會影響參比物的選擇并會納入綜合風(fēng)險評估中。對qt間期影響的非臨床研究策略如下圖體外ikt及 多種離子整體qt分析一m 二 理 學(xué)類 化分追加<->綜合風(fēng)險性v相關(guān)非臨床研究評估/臨床研究風(fēng)險 評估五、參考文獻l.ich, ich guidance for indus

12、try ich s7a: safety pharmacology studies for human pharmaceuticals, 2001.2.ich, ich guidance for industry ich s7b: safety pharmacology studies for assessing the potential for delayed ventricular repolarization ( qt interval prolongation ) by human pharmaceuticals, 2005.3.liu t, brown bs, wu y, antze

13、levitch c，kowey pr，yan gx.blinded validation of the isolated arterially perfused rabbit ventricular wedge in preclinical assessment of drug-induced proarrhythmias, heart rhythm 2006; 3: 948-956.六、附錄一試驗方法（一）體外試驗評價藥物對離子電流的影響，主要包括咯和其他幾種參與心肌電活 動的重要離子通道。體外1心試驗是采用原代心肌細胞或表達通道蛋白 （如由herg編碼的蛋白）的細胞系評價藥物對離子電流的影

14、響。相關(guān)研究方法見參考文獻。檢測中獲得ic50的基本參數(shù)項目列于表2。表1致心律失常作用試驗檢測的心肌離子通道通道種類陽性對照（參考）參考文獻cavl.2 (l-type)尼非地平 (nifedipine)shen j et al comparison of l-type calcium channel blockade by nifedipine and/or cadmium in guinea pig ventricular myocytes jpetf 2000; 294:562-70zahradnik i, minarovic, i and zahradnikova a inhibit

15、ion of the cardiac l-typec calcium channel currentby antidepressant drugs /pe7；2008; 324:977-84herg西沙必利 (cisapride)或特非 那定(terfenadine)helliwellr,recordinghergpotassium currents and assessing the effects of compounds using the whole cell patch clcunptechniquejonathan d lippiat (ed ), methods in molec

16、ularbiology,potassiumchannels, 2008; 491: 279-95kamiya k et almoleculardetenninants of herg channel block by terfenadine and cisapride j pharmacol sci,2008; 108:301-7gintant ga et al utility of herg assays as surrogate markers of delayed cardiac repolarization and qt safety toxicolpathol. 2006; 34:8

17、1-90kvl.54 氨基毗唳(4-aminopyridine,4-ap)de biasi m et al open channel block of human heart hkvl 5 by the beta-subunit hkv beta 1 2 am j physiol 1997 272: h2932-41 lagrutta a et al novel, potent inhibitorsof human kv 1 5 k+ channels and ultrarapidly activating delayed rectifier potassium current 7pe7；20

18、06;317:1054-63kv4.3氟卡尼（又名哌氟 酰胺，flecainide） 或 4-apradicke s et al effects of mirpl and dpp6 p-subunits on the blockade induced by flecainide of kv4 3/kchip2 channels br j pharmacol 200& 154: 774-86fischer f et al inhibition of cardiac kvl 5 and kv4 3 potassium channels by the class la anti-arrhyt

19、hmic ajmaline: mode of action naunyn schmiedebergs arch pharmacol, 2013, online, julkvlqtl/mink二乙酰醇293b(chromanol-293b)yang wp et al kvlqt 1, a voltage-gated potassium channel responsible fbrhuman cardiac arrhythmias pnas. 1997; 94:4017- 4021seebohm g et al molecular determinants of kcnq1 channel bl

20、ock by a benzodiazepine mol pharmacol, 2003, 64:70-7navi.5利多卡因(lidocaine)wu l et al role of late sodium current in modulating the proarrhythmic and antiarrhythmic effects of quinidine heart rhythm. 2008; 5: 1726-34 mcnulty, mm andhanck ,da state-dependent mibefradil block of na channels mol pharmaco

21、l, 2004; 66:1652-61kir2.1奉貝(barium)或氯唾 (chloroquine)rodriguez-menchaca aa et al, the molecular basis of chloroquine block of the inward rectifier kir2 1 channel pnas, 2008; 105:1364-8schram g et al barium block of kir2 and human cardiac inward rectifier currents evidence for subunit-heteromeric cont

22、ribution to native currents cardiovasc res, 2003, 59: 328-38觀察記錄上述所有離子通道的相關(guān)試驗建議在glp實驗室進行參數(shù)項目ic50試驗平臺手動膜片鉗記錄系統(tǒng)所需濃度4種每一濃度下重復(fù)試驗例數(shù)n=3陽性對照n=2溶媒對照1個濃度，n=3檢測溫度室溫（rt）或生理性溫度（pt）濃度范圍通過預(yù)實驗確定試驗方案和報告glp格式累積曲線+分析樣品收集+pdf格式的電子文檔+（二）整體研究整體qt研究主要是測定心室復(fù)極參數(shù)，如qt間期。該試驗可在安 全藥理學(xué)研究中同時進行，這樣可減少動物和其他資源的使用。qt間期和心率是相反的、非線性的關(guān)系，且

23、二者之間的關(guān)系在不同的種屬和動物甚至同一種屬之間都不相同。因此心率改變會影響qt間期,這會干擾對受試物影響心室復(fù)極化和qt間期的評價。故在qt間期分析 時，應(yīng)采用心率校正qt間期（qtc）來進行,常用的有bazett和fridericia 法；心率校正公式的選擇須根據(jù)試驗系統(tǒng)得來的數(shù)據(jù)加以判斷，如果給藥 組和對照組心率差異較大，可能校正公式對于評價qt間期延長風(fēng)險是無效的，此時可改用心臟起搏器來獲得固定的心率。對qt/rr （心電圖中r 波與r波的距離）關(guān)系進行分析可能更合適，包括用公式對個體動物qt 間期數(shù)據(jù)進行校正。在犬或猴等大動物記錄ecg,是安全性評價的基本組成。藥物引起 qt間期顯著

24、延長將使致命性心律失常tdp發(fā)生的風(fēng)險顯著增加，因而 ecg的qt間期被作為預(yù)測新化合物引起tdp的重要風(fēng)險因素。鑒于犬、 猴和小型豬等大動物在心肌離子通道構(gòu)成和功能方面與人類具有高度相 似性，通常用于整體qt分析研究中。整體qt分析試驗可在麻醉和清醒 動物進行，具體方法參見表3所列文獻。表3整體qt研究試驗常用動物動物參考文獻試驗參數(shù)麻 醉 動 物犬ollerstam, a et al comparison of the qt interval response during sinus andpaced rhythm in conscious and anesthetized beagle

25、 dogs j pharmacoltoxicol methods, 2007;56: 131 -44 chiba k, et al in vivo experimental approach for the risk assessment of fluoroquinolone antibacterial agents-induced long qt syndrome eur j pharmacol, 2004;486:189-200ecg相關(guān)參 數(shù)，包括（形 態(tài)、心率、節(jié) 律、p波電壓、 r波電壓、t波 電壓、pr間 期、rr間期、 qrs時間、qt 間期、qtc間 期）猴ishizaka t

26、 et al evaluation of drag-induced qt prolongation in a halothane-anesthetized monkey model: effects of sotalol j pharmacoltoxicol methods, 2009;59:86-93豬authier s et al cardiovascular and respiratory safety pharmacology in gottingenminipigs: pharmacological characterizationjpharmacoltoxicol methods,

27、 2011;64:53-9遙 測 動 物犬batey aj，doe pa a method for qt correction based on beat-to-beat analysis of the qt/rr interval relationship in conscious telemetred beagle dogs j pharmacoltoxicol methodsf20q2;4& 11 -9 fossa aa assessing qt prolongation in conscious dogs: validation of a beat-to-beat method

28、 phannacolther. 2008;ll&2318猴ando k et al qt prodact: in vivo qt assay with a consciousmonkey for assessment of the potential for drug-induced qtinterval prolongation j pharmacol 5cz,2005;99: 487-500haushalter tm et al the cardiovascular and pharmacokineticprofile of dofetilide in conscious tele

29、metered beagle dogs andcynomolgus monkeys br j pharmacology154: 1457-64豬stubhan et al evaluation of cardiovascular and ecg parameters in the normal, freely moving gottingenminipig j pharmacol toxicological methods,200& 57: 202-11kanom et al qt prodact: usabilityof miniature pigs in safety pharma

30、cology studies: assessment for drug-inducedqt interval prolongation j pharmacol sci,2005, 99:501-11麻 醉 動 物犬takahara a et al effects of mexiletine on the canine model of sparfloxacin-induced long qt syndrome eur j p肋沏dco/,2003,476:115-22 chiba k et al proarrhythmic effects of fluoroquinolone antibact

31、erial agents: in vivo effects as physiologic substrate for torsades toxicolapplpharmacol, 2000, 169:8-16 kimura k et al hemodynamic and electrophysiological effects of mitemcinal (gm611)，a novel prokinetic agent derived from erythromycin in a halothane-anesthetized canine model j toxicolsci. 2007,32

32、:2319血流動力學(xué) 檢測，包括map、sbp、dbp、hr、ecg、單相動 作電位(map) 等注：gottingen minipigs:#根廷小型豬。上述整體qt研究相關(guān)試驗建議在glp實 驗室進行(三)追加的研究藥物對心肌動作電位(action potential, ap )的影響：心臟的正常功 能依賴于心肌細胞動作電位的產(chǎn)生和傳導(dǎo)。藥物引起細胞膜離子通道表達 或功能異常是其導(dǎo)致心律失常的重要病理生理基礎(chǔ)。因此，在離體心臟標(biāo) 本進行動作電位參數(shù)測定，是ich推薦的qt間期延長藥物安全性評價 體系中的重要組成之一。常用于動作電位參數(shù)測定的動物離體心臟標(biāo)本及 試驗方法見表4,試驗中重要的參數(shù)

33、項目見表5。表4記錄心肌ap的離體心肌標(biāo)本動物標(biāo)本參考文獻犬蒲肯野纖 維terrar, da et al comparison of guinea-pig ventricular myocytes and dog purkinje fibres for in vitro assessment of drug-induced delayed repolarization j pharmacol toxicol methods, 2007; 56: 171-85lightbown id et al towards automation of a valuable preclinical cardi

34、ac safety pharmacology assay: evaluation of the effects of cardiac ion channel blockers on cardiac repolarisation in vitro j pharmacol toxicol methods, 2007;56:194-202limberis jt et al the effects of plasma proteins on delayed repolarization in vitro with cisapride, risperidone, and d, l-sotalol j p

35、harmacol toxicol methods, 2007; 56:11-7兔蒲肯野纖 維himmel hm suitability of commonly used excipients for electrophysiological in-vitrosafety pharmacology assessment of effects on herg potassiumeurrent and on rabbit purkinje fiber action potential j pharmacol toxicol methods, 2007; 56: 145-58ducroq j et a

36、l action potential experiments complete herg assay and qt-interval measurements in cardiac preclinical studies j pharmacol toxicol methods, 2007; 159-70豚鼠心室肌 細胞hagiwara t et al a comparative study of the fluoroquinolone antibacterial agents on the action potential duration in guinea pig ventricular

37、myocardia jpn j pharmacol. 2001; 87: 231-34 shuba lm et al action potentials, contraction, and membrane currents in guinea pig ventricular preparations treated with the antispasmodic agent terodiline j pet, 1999; 290:1417-26豚鼠心室乳 頭肌hayashi s et al qt prodact: a multi-site study of in vitro action po

38、tential assays on 21 compounds in isolated guinea-pig papillary muscles j pharmacolsci,2005; 99:423-37langendorff 離體心臟milberg p et al proarrhythmia as a class effect of quinolones: increased dispersion of repolarization and triangulation of action potential predict torsades de pointes j cardiovasc e

39、lectrophysiol, 2007; 18:647-54clements-jewery h et al actions of flecainide on susceptibility to phase-2 ventricular arrhythmias during infarct evolution in rat isolated perfused hearts british j pharmacol, 2006; 147: 468-75chenghc and incardona j models of torsades de pointes: effects of fpl64176,

40、dpi201106, dofetilide, and chromanol 293b in isolated rabbit and guinea pig hearts j pharmacol toxicol methods, 2009; 60: 174-84冠狀動脈灌 注兔左心室 肌楔形標(biāo)本chenx et al use of arterially perfused rabbit ventricular wedge inpredicting arrhythmogenic potentials of drugs j pharmacol toxicol methods. 2006;54: 261-7

41、2liu t, brown bs, wu y, antzelevitch c, kowey pr, yan gx.blinded validation of the isolated arterially perfused rabbit ventricular wedge in preclinical assessment of drug-induced proarrhythmias heart rhythm 2006; 3: 948-956上述研究相關(guān)試驗建議最大可能執(zhí)行g(shù)lp三濃度檢測參數(shù)項目測試測試濃度數(shù)3檢測每一個受試物所需的蒲肯野纖維數(shù)或心肌細胞數(shù)4用于對照品的蒲肯野纖維數(shù)或心肌細胞

42、數(shù)4累積曲線+在生理溫度(37°±1°c)下進行試驗+統(tǒng)計學(xué)分析+如果系glp實驗室，收集樣本的分析+報告+如果是glp實驗室，要求有質(zhì)量保證部門(quality assurence unit,qau)的檢查，包括同步、數(shù)據(jù)和報告的檢查+可參考的文獻1. de clerck f et al, in vivo measurement of qt prolongation, dispersion and arrhythmogenesis: application to the preclinical cardiovascular safety pharmacology of a new chemical entity, fundamclinpharmacol, 2002;16:125-40.2. sanguin