丁基膠塞細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法研究

1、    丁基膠塞細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法研究    張偉+陳瑞超+蘆錦摘 要： 丁基膠塞作為常用藥品包材，無(wú)論是生產(chǎn)還是使用階段均會(huì)與藥品產(chǎn)生直接接觸，為保證其質(zhì)量達(dá)標(biāo)，必須要對(duì)其進(jìn)行熱源檢查。而在實(shí)際檢查中，為避免熱源法敏感度對(duì)最終檢查結(jié)果準(zhǔn)確性的影響，多選擇應(yīng)用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法處理，具有更高的靈敏性。本文主要以丁基膠塞作為對(duì)象，對(duì)其細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法要點(diǎn)與控制措施進(jìn)行了簡(jiǎn)單分析。關(guān)鍵詞： 丁基膠塞；細(xì)菌；內(nèi)毒素檢查丁基膠塞具有較強(qiáng)的化學(xué)穩(wěn)定性、氣密性、潔凈性以及生物性，是比較常見(jiàn)的藥品包材，但是因?yàn)榕浞綇?fù)雜性以及原材料所選不同，會(huì)存在部分活性較強(qiáng)的分在封裝

2、后與藥品產(chǎn)生反應(yīng)，出現(xiàn)膠塞與藥物之間的相容性問(wèn)題。為確保所用丁基膠塞質(zhì)量達(dá)標(biāo)，需要對(duì)其進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，確認(rèn)是否存在細(xì)菌內(nèi)毒素污染情況，保證藥品、器械的安全性。一、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法原理細(xì)菌內(nèi)毒素為與革蘭陰性菌細(xì)胞壁相關(guān)的一種熱原物質(zhì)，也是目前發(fā)現(xiàn)普遍處于水溶液容重的熱原，可以作為藥品安全性檢查的重要指標(biāo)。細(xì)菌內(nèi)毒素多由革蘭陰性菌產(chǎn)生，為細(xì)胞壁最外層部分脂多糖，同時(shí)含有親水多糖鏈與輸水脂肪酸鏈，使其在水溶液內(nèi)具有自然聚集成團(tuán)特點(diǎn)。表現(xiàn)在機(jī)體上，如致死毒性、發(fā)熱性、體重減輕、白細(xì)胞減少等；表現(xiàn)在細(xì)胞水平上，如阻止巨噬細(xì)胞游走以前列腺抗腫瘤壞死等?；谄涮匦裕梢酝ㄟ^(guò)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法確認(rèn)藥品質(zhì)量是

3、否達(dá)標(biāo)，對(duì)比傳統(tǒng)家兔熱原檢測(cè)方法，此種檢查方法具有更大應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，檢查結(jié)果也更為精確1。檢查時(shí)主要是利用鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生凝聚反應(yīng)機(jī)制，確認(rèn)試驗(yàn)品細(xì)菌內(nèi)毒素限量是否合理，主要包括凝膠法與光度測(cè)定法兩種，且光度測(cè)定法又可分為濁度法與顯色基質(zhì)法，現(xiàn)在在實(shí)際應(yīng)用中標(biāo)準(zhǔn)化程度不斷提高。二、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查影響因素在應(yīng)用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法時(shí)，需要保證試驗(yàn)過(guò)程的無(wú)菌性，全程采取無(wú)菌操作，避免微生物對(duì)供試品產(chǎn)生影響，而降低檢查結(jié)果準(zhǔn)確性。因此，在試驗(yàn)前需要對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行全面清潔，并利用紫外燈持續(xù)滅菌1h，然后在百級(jí)凈化臺(tái)上實(shí)驗(yàn)操作，盡量減小動(dòng)作幅度，最大程度上來(lái)避免試管的振動(dòng)。另外，還要提前準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)所需的各

4、項(xiàng)器皿，并全面清潔消毒，確保不存在外源性?xún)?nèi)毒素，一般可將其置于250條件下持續(xù)干烤60min2。以凝膠法實(shí)驗(yàn)過(guò)程為例，要求細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水內(nèi)毒素含量在0.015ml1之間。部分供試品還要進(jìn)行復(fù)溶、稀釋處理，或者是在水性溶液內(nèi)浸提制成供試品溶液，并控制溶液ph在6.08.0之間，確?？梢哉Ｄ?。就以往經(jīng)驗(yàn)來(lái)看，溶液ph值過(guò)高或過(guò)低均會(huì)對(duì)部分內(nèi)毒素產(chǎn)生損壞，降低鱟試劑與內(nèi)毒素發(fā)生的聚集效果。而對(duì)于自身酸堿性較大，或者具有緩沖能力的供試品，需要提前對(duì)被測(cè)溶液ph進(jìn)行調(diào)整，將其控制在技術(shù)要求范圍內(nèi)。其中，在對(duì)溶液進(jìn)行稀釋時(shí)，可以利用漩渦混合器，促使溶液均勻混合，盡量避免出現(xiàn)假陽(yáng)性或者假陰性結(jié)果，提

5、高檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性與代表性。三、丁基膠塞細(xì)菌內(nèi)毒素檢查實(shí)驗(yàn)1.實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備1.1儀器電熱恒溫水浴箱與渦輪混合器，數(shù)量若干的玻璃器皿，且要對(duì)所有玻璃用具進(jìn)行250條件下的1h干熱滅菌，以免存在外源性?xún)?nèi)毒素。1.2試劑靈敏度為0.5eu/ml的鱟試劑，為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，可以分別選擇同靈敏度的多種批號(hào)試劑。還需要提前準(zhǔn)備好效價(jià)為150eu/支的細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水以及注射用鹵化丁基膠塞3。2.實(shí)驗(yàn)方法2.1 靈敏度復(fù)核以中國(guó)藥典相關(guān)規(guī)定與資料作為依據(jù)，對(duì)鱟試劑進(jìn)行靈敏度復(fù)核，可得三種不同批號(hào)的鱟試劑靈敏度均符合要求。2.2制備浸提液在制備浸提液時(shí)，需要保證全程無(wú)菌操作，排除微生

6、物對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。選取3支相同批號(hào)的注射用鹵化丁基膠塞，然后用純化水將其沖洗干凈，用濾紙吸收剩余水分，放置到250ml的廣口瓶?jī)?nèi)并加塞處理，最后將廣口瓶放入壓力蒸汽滅菌器內(nèi)，保持115條件持續(xù)滅菌30min。滅菌結(jié)束后按照表面積加入50ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，確保能夠?qū)⒛z塞全部浸沒(méi)，重新將廣口瓶加塞密封，后放置于37±1恒溫水浴內(nèi)保溫72±2h。其中，在保溫階段還需要進(jìn)行數(shù)次振蕩處理，避免產(chǎn)生微生物。保溫時(shí)間結(jié)束后取出冷卻，作為注射用鹵化丁基膠塞的浸提液。2.3預(yù)干擾試驗(yàn)按照樣品表面積：水為1：0.5比例選取注射用鹵化丁基膠塞浸提液，并用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋?zhuān)@得1：0

7、.5、1：1、1：2、1：3、1：4功5種濃度的溶液。利用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水來(lái)對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)行稀釋?zhuān)玫?.25、0.5、2共4種濃度溶液4。然后利用細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品配置不同濃度的樣品陽(yáng)性液，按照專(zhuān)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行預(yù)干擾試驗(yàn)。2.4供試品干擾試驗(yàn)根據(jù)中國(guó)藥典內(nèi)容進(jìn)行供試品預(yù)干擾試驗(yàn)，即選擇細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水與注射用鹵化丁基膠塞浸提液，加入到同支細(xì)菌內(nèi)毒素溶液內(nèi)，且每一個(gè)濃度均需要做4管平行試驗(yàn)。然后選擇細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品0.25、0.5、2的細(xì)菌內(nèi)毒素溶液，同樣每一濃度做4管平行試驗(yàn)。另外，對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水以及注射用鹵化丁基膠塞浸提液做2管陰性對(duì)照試驗(yàn)。最大濃度2.0均設(shè)定為陽(yáng)性，最低濃度0.

8、25則均為陰性，按照工程en=lg（x/4）計(jì)算，分別確定細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水與注射用鹵化丁基膠塞浸提液所制細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點(diǎn)幾何平均值en與et，其中x表示細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水或者注射用鹵化丁基膠塞浸提液制成的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)終點(diǎn)濃度對(duì)數(shù)值。當(dāng)en處于0.52.0時(shí)，et在0.5en2.0en時(shí)，確認(rèn)注射用鹵化丁基膠塞浸提液不干擾試驗(yàn)。3.結(jié)論分析經(jīng)過(guò)試驗(yàn)后可以確定，0.5eu/支的鱟試劑作為干擾試劑時(shí)，et值在0.5en2.0en范圍內(nèi)，即注射用鹵化丁基膠塞浸提液不會(huì)對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)產(chǎn)生干擾，確定細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法對(duì)丁基膠塞的熱原檢查可行。結(jié)束語(yǔ)：應(yīng)用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法來(lái)確定丁基膠塞質(zhì)量是否達(dá)標(biāo)，對(duì)比以往檢查方法其具有更大的優(yōu)勢(shì)，但是整個(gè)過(guò)程要做好細(xì)節(jié)管理，消除各類(lèi)因素的影響，保證檢查結(jié)果的可靠性。參考文獻(xiàn)1 裴宇盛，蔡彤，高華.細(xì)菌內(nèi)毒素檢查新方法進(jìn)展j.藥物分析雜志，2014，（03）：392-395.2 肖貴南，孫清萍，盛英美.如何建立新藥的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法j.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011，（32