貴金屬納米顆粒的光學(xué)顯微成像研究112

1、納米金棒的光學(xué)顯微成像研究扌商 要:在光學(xué)成像中，棒狀金納米顆粒主耍用于生物成像時(shí)的探針，基丁此木文將介紹棒狀納米顆 粒在液晶材料里的光學(xué)成像。因棒狀納米顆粒具冇相異的特點(diǎn)，它在光學(xué)成像屮的用途冇三個(gè)：笫一、 棒狀金納米顆粒具有l(wèi)srp共振散射光譜的特性，第二、它能發(fā)出明亮的紅散射光在暗場(chǎng)顯微成像中； 第三、棒狀納米僉顆粒在多光子激發(fā)下具有輻射特性，可以應(yīng)用在生物成像中做為多光子熒光探針。 本文將分別介紹在顯微成像中，棒狀金納米顆粒相異的特性。關(guān)鍵詞：棒狀金納米顆粒；光學(xué)成像；特性研究；optical microscopy imaging study of golden rodabstract

2、: optical imaging, rod-shaped gold particles are used as a probe in the field of biological imaging, this article also describes additional rod-shaped golden r(xi as a liquid crystal material in the field of biological imaging,. because the rod-likc golden rod have distinct characteristics, in the f

3、ield of biological imaging there arc three ways to apply :first a rod-shaped gold particles have lsrp resonance scattering spectra characteristic, second it glows bright red scattered light in a dark field microscopy imaging;, third. golden rod particles having radiation characteristics in a multi-p

4、hoton excitation can be applied as a multi-photon fluorescence probes in biological imaging. this article will introduce the application of golden rod particles dissimilar characteristics in optical microscopy imaging.key words： golden rod; optical imaging; characteristics;0引言顯微成像術(shù)是光學(xué)成像中最常用、最傳統(tǒng)的成像方法

5、，因此本文中棒狀納米金顆粒光學(xué) 成像都是基于光學(xué)顯微鏡的系統(tǒng)裝置中完成。做為以下主要使用的光學(xué)系統(tǒng)成像:棒狀金納米顆粒的高散射應(yīng)用在暗場(chǎng)顯微成像術(shù)成 像；以共聚焦激光掃描熒光顯微鏡對(duì)棒狀金納米顆粒的雙光子輻射光成像，共聚焦激光顯微 鏡的設(shè)計(jì)可提高成像縱向分辨率；熒光成像法是記錄熒光信號(hào)的熒光壽命信息，并出現(xiàn)成像。 并在成像圖中通過(guò)呈現(xiàn)偽色彩?？梢苑直婢哂邢喈悷晒鈮勖臒晒鈦?lái)源，豐富成像的細(xì)節(jié)和 提供更多的信息。1基于高散射光的棒狀金納米顆粒暗場(chǎng)光學(xué)顯微成像特性1.1暗場(chǎng)基本原理基于高散射光的棒狀金納米顆粒暗場(chǎng)光學(xué)顯微成像特性，暗場(chǎng)顯微成像是顯微鏡透射 光入射樣品前加入暗場(chǎng)裝置，讓光在照射樣品后

6、傾斜角度很大，從而使物鏡只能采集到高級(jí) 衍射或高散射的樣品光信號(hào)的成像系統(tǒng)。通過(guò)對(duì)普通透射顯微鏡改裝加入暗場(chǎng)裝置就可以進(jìn)收稿日期：20xx-xx-xx基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(51305205)行暗場(chǎng)成像，這種成像系統(tǒng)主要用于樣品梯度變化較大或具有高階衍射現(xiàn)象的成像。圖1顯微暗場(chǎng)成像工作原理示總圖1 2操作過(guò)程其工作原理示意圖如圖1所示，入射光經(jīng)過(guò)暗場(chǎng)裝置后，光束的屮心被阻塞，只有傾斜 的空心光錐能透過(guò)暗場(chǎng)裝置并經(jīng)聚光透鏡照射在樣品上。顯微物鏡的數(shù)值孔徑需小于暗場(chǎng)裝 置聚光透鏡的數(shù)值孔徑，則傾斜的光朿透過(guò)樣品后才不會(huì)入射進(jìn)物鏡中。只有當(dāng)樣品含有能 產(chǎn)生高階衍射光或高散射的物質(zhì)時(shí)，被傾斜的

7、入射光照射時(shí)產(chǎn)生的高階衍射光或散射光才能 被物鏡接收。由于棒狀金納米顆粒有l(wèi)spr消光光譜中包含的散射，因此具有高入射光散射 特性，散射光譜與消光光譜一致，在600納米以上有很強(qiáng)的、可調(diào)的長(zhǎng)軸散射峰。寬帶光經(jīng)過(guò)棒狀金納米顆粒后，其波長(zhǎng)附近的光波長(zhǎng)軸散射峰被強(qiáng)烈散射，因此，通過(guò) 暗場(chǎng)顯微成像，我們已經(jīng)得到棒狀金納米顆粒的散射光光譜與其長(zhǎng)軸散射光譜一樣，呈紅色 的顏色。卞面將具體的討論基丁棒狀金納米顆粒的暗視場(chǎng)顯微成像在液晶材料和細(xì)胞標(biāo)記的 運(yùn)用。2棒狀金納米顆粒散射暗視場(chǎng)顯微在細(xì)胞成像中的運(yùn)用2. 1實(shí)驗(yàn)原理由于棒狀金納米顆粒的散射光譜長(zhǎng)軸峰值在600nm以上，容易從細(xì)胞的散射光中分辨 出，因此

8、棒狀金納米顆?？梢杂米鳂?biāo)記細(xì)胞的散射光探針。我們使用連接有ceas抗體的棒 狀金納米顆粒作為探針對(duì)宮頸癌細(xì)胞標(biāo)記 hela lane,并對(duì)hcla lane進(jìn)行暗場(chǎng)顯微成 像。由于iles lane其細(xì)胞膜會(huì)會(huì)表達(dá)過(guò)量的ceas抗原，因此能通過(guò)抗體抗原的特界性反 應(yīng)使修飾抗體的棒狀金納米顆?？梢杂行У臉?biāo)記于其細(xì)胞膜上。已經(jīng)有人驗(yàn)證了由ctab作為表面活性劑的棒狀金納米顆粒的十六烷基三甲基漠化錢(qián)毒 性對(duì)細(xì)胞活性有破壞作用，因此這里采用把棒狀金納米顆粒包覆在15nm厚度的二氧化硅包 覆作為探針連接ceas抗體對(duì)helo lane標(biāo)記，以減少毒性。左圖:helen lane明場(chǎng)透射光成像照片：中圖:

9、左圖helen lane同區(qū)域的暗場(chǎng)照片;右圖:標(biāo)記了 ceas抗體一sio2 棒狀金 納米顆粒后的helen i刁no暗場(chǎng)照片2. 2具體的實(shí)驗(yàn)步驟hela lane在37°c溫度、5%的si02氣體條件中于dmem溶液中分裂培養(yǎng)兩天。將20nm 連接ceas抗體的二氧化硅一一棒狀金納米顆粒(lspr長(zhǎng)軸消光峰在650nm)溶液10ml緩緩 滴入到細(xì)胞培養(yǎng)液，并搖晃,使棒狀金納米顆粒均與地分散在細(xì)胞培養(yǎng)液中，且讓棒狀金納米 顆粒與細(xì)胞一起培養(yǎng)兩個(gè)小時(shí)。然后用ph值7. 4、0. 01m的濃度pbs緩沖溶液沖洗固定有細(xì) 胞的玻璃片45次，然后把玻璃片放入dmem溶液中，在阻隔場(chǎng)顯微鏡

10、下直接觀察成像。 物鏡是40倍空鏡，孔徑數(shù)值0. 65,探測(cè)器為ccd。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，左圖為hela lane明場(chǎng)透射光成像照片，中間圖為相同區(qū)域的 hela lane的暗場(chǎng)散射照片。由于細(xì)胞結(jié)構(gòu)有較大的梯度變化，因此也有強(qiáng)的散射信號(hào)，從 圖中可以看出，細(xì)胞散射信號(hào)的光譜較寬，成像顏色偏冷色系藍(lán)光較多。二氧化硅一一棒狀 金納米顆粒因修飾有ceas抗體，可有效地連接在hela lane表面。其暗場(chǎng)成像如2右圖所 示：ilelawne表面清晰可見(jiàn)棒狀金納米顆粒發(fā)出的紅色散射光。棒狀金納米顆粒散射光譜 主峰在650nm,成像顏色為曖色系的紅色，在冷色系藍(lán)色為主的細(xì)胞散射光顏色中能醒目的 被分辨

11、。因此在暗視場(chǎng)顯像中棒狀金顆?？梢宰鰹閷?duì)hela lane進(jìn)行標(biāo)記的散射光探針。對(duì) 于相異的lspr散射峰的金納米顆粒還可以癌細(xì)胞的標(biāo)記，它們?cè)诎祱?chǎng)成像小具有相異的散 射光譜和顏色特征，可以通過(guò)多種顏色標(biāo)記相異細(xì)胞或細(xì)胞物質(zhì)的多功能成像。針對(duì)相異的腫瘤細(xì)胞，過(guò)量表示的抗原體也會(huì)相異。棒狀金納米顆粒作為探針的診斷成 像方法中，我們很容易對(duì)金棒修飾相應(yīng)的抗體，實(shí)現(xiàn)對(duì)特異目標(biāo)的特異性標(biāo)記。并且，棒狀 金納米顆粒由于其低毒性和高生物穩(wěn)定性及生物適應(yīng)性，它也是一種相對(duì)安全的納米探針。 棒狀金納米顆粒是一種大體積的剛性金屬材料，作為探針在生物組織和細(xì)胞小具有很好的穿 透性，因而對(duì)生物在體外和體內(nèi)的成像診斷

12、具有很大的潛在應(yīng)用價(jià)值。3液晶材料中棒狀金納米顆粒散射暗視野顯微成像的運(yùn)用3. 1基本原理液晶(liquldcrystal)是具有一種特殊光電特性的物態(tài)。它一般由化合有機(jī)物組成，并 具有特定的分子產(chǎn)生的液晶相。液品分子會(huì)受電磁場(chǎng)或外來(lái)影響而定向排列，排列后具有選 擇性的對(duì)光散射。我們把棒狀金納米顆粒加入液晶材料，它容易聚集在液晶屮的缺陷處。所以，一方面棒 狀金納米顆粒的高散射特性會(huì)對(duì)液晶缺陷暗場(chǎng)成像，另一方面，由于液晶分子定向排列，分 子力也能使金棒隨之排列，有利于定向排列的納米金棒的光學(xué)特性的研究。我們利用ctab作為液晶的組成分子材料，制作排列棒狀金納米顆粒的液品分子，由于 納米金棒的su

13、rfactant是ctab。所以棒狀金納米顆粒在ctab液晶中具有很好的溶解和分散性, 不容易產(chǎn)生聚集。ctab分子形成六角相、向列相的液晶都可使分散于其屮的棒狀金納米顆 粒受分子力作用產(chǎn)生排列。如圖3所示，定向排列的ctab液晶分子（綠色）棒狀金納米顆粒 的表面和附近使棒狀金納米顆粒產(chǎn)生特定的排列方向。將分散有長(zhǎng)軸消光峰在720血棒狀金納米顆粒的ctab液品平鋪，在由loonm微球支撐 的兩層玻璃之間，使液晶產(chǎn)生排列并均與分布，然后我們對(duì)定向排列在ctab液晶中的棒狀 金納米顆粒進(jìn)行光學(xué)實(shí)驗(yàn)。圖3棒狀金納米顆粒在液晶分子六角相（左）及向列相（右）作用下產(chǎn)生定向排列圖物鏡暗場(chǎng)裝置偏振片圖4排列

14、的棒狀金納米顆粒在液晶中進(jìn)行暗視野顯微成像系統(tǒng)示圖4液晶+納米金棒偏振光 起偏方向3. 2實(shí)驗(yàn)過(guò)程暗場(chǎng)顯微裝置加偏振片可構(gòu)成實(shí)驗(yàn)裝置，可見(jiàn)圖4,在入射光源的末端添加偏振片，使入射光偏振。偏振光經(jīng)過(guò)暗場(chǎng)裝置后仍保持高比例的偏振性，再照射樣品。在液晶的棒狀金 納米顆粒排列一定的方向，受到偏振光照射產(chǎn)生散射光,并通過(guò)ccd或光譜儀進(jìn)行接收探測(cè)。 實(shí)驗(yàn)吋，首先，不使用偏振片，對(duì)液晶中棒狀金納米顆粒的散射光進(jìn)行成像。如圖6. 5所示, 圖中可以清晰地看到ctab晶體缺陷的紋理圖案，整個(gè)圖像呈現(xiàn)暖色系紅色，這是由棒狀金 納米顆粒散射光譜在紅光區(qū)域形成。而液晶材料中不加入棒狀金納米顆粒，則在暗場(chǎng)顯微成 像屮

15、得不到清晰的結(jié)構(gòu)和缺陷信息，因?yàn)橐壕毕莶荒墚a(chǎn)生高散射的光，因此不能通過(guò)暗場(chǎng) 裝置成像。棒狀金納米顆粒容易在液晶中的缺陷處產(chǎn)生聚集，濃度較大（因此在缺陷處散射 光頗色為棒狀金納米顆粒聚集后展寬的散射光譜，顯示出白色），通過(guò)利用棒狀金納米顆粒 可以清晰的對(duì)液品的缺陷進(jìn)行暗場(chǎng)顯微成像。圖5棒狀金納米顆粒在ctab暗場(chǎng)成像照片圖5入射光光譜，入射光偏振方向與納米金棒長(zhǎng)軸平行時(shí)棒狀金納米顆粒的散射光光 譜；金棒長(zhǎng)軸與入射光偏振方向垂直時(shí)棒狀金納米顆粒的散射譜圖6狀金納米顆粒與長(zhǎng)軸入射光偏振方向棒排列方向垂直（左）、呈45。角（中）及平行（右）時(shí)液品中棒狀金納米顆粒的暗當(dāng)入射光經(jīng)過(guò)偏振片偏振時(shí)，棒狀金納

16、米顆粒的散射則出現(xiàn)了有趣的現(xiàn)象。我們發(fā)現(xiàn), 棒狀金納米顆粒的lspr散射特性與光的偏振性有密切關(guān)聯(lián)。首先通過(guò)在顯微鏡明場(chǎng)屮觀察 液晶分子的排列以確定棒狀金納米顆粒的排列方向，隨后轉(zhuǎn)動(dòng)偏振片使，從而改變偏振光的 方向。在喑場(chǎng)下可以觀察到棒狀金納米顆粒光譜的變化，由偏振入射光的方向變化而發(fā)牛的 強(qiáng)弱變化。如圖5所示，當(dāng)入射光偏振方向平行棒狀金納米顆粒長(zhǎng)軸排列方向時(shí)，得到峰值在720nm 的棒狀金納米顆粒散射光譜；而當(dāng)入射光偏振方向垂直與棒狀金納米顆粒反軸排列方向時(shí)， 卻得不到暗場(chǎng)散射光的光譜信號(hào)。圖6為ccd記錄下來(lái)棒狀金納米顆粒的散射光信號(hào)與入射光偏振方向變化的關(guān)系，同樣 證實(shí)了棒狀金納米顆粒長(zhǎng)

17、軸排列方向平行度和入射光偏振方向與納米金棒散射光信號(hào)強(qiáng)度 的正相關(guān)系。這種關(guān)系驗(yàn)證了棒狀金納米顆粒的散射特性是來(lái)源其lspr特性的。棒狀金納米顆粒的 長(zhǎng)軸散射峰是由于入射波及其長(zhǎng)軸上的電子振動(dòng)引起的表血等離子波共振而產(chǎn)生的，發(fā)生共 振的條件是入射光偏振方向和金棒長(zhǎng)軸方向一致，且入射光波長(zhǎng)恰為共振峰波長(zhǎng)。因此，納 米金棒具有l(wèi)spr特性的偏振敏感性：對(duì)棒狀金納米顆粒的lspr消光峰在720nm,入射波長(zhǎng) 720nm,并且偏振的方向與棒狀金納米顆粒長(zhǎng)軸的方向平行，被金棒散射的強(qiáng)度最大。入射 光偏振偏離金棒反軸方向一定角度后，金棒的散射光強(qiáng)度逐漸減少，直至入射光方向垂直于 金棒軸方向時(shí)達(dá)到最小值。此

18、時(shí)入射光的偏振與金棒短軸方向雖然平行，可以在短軸散射峰 處（520nm左右）產(chǎn)生散射，但因?yàn)榘魻罱鸺{米顆粒lspr短軸消光峰強(qiáng)度很低，探測(cè)器接收 的信號(hào)非常微弱，所以可以忽略不計(jì)。3. 3結(jié)論棒狀金納米顆?？梢郧逦脑谝壕Ю飳?duì)液晶缺陷進(jìn)行暗場(chǎng)成像。受液晶分子作用產(chǎn)生 定向排列的棒狀金納米顆粒是對(duì)光波偏振方向敏感的一種材料，通過(guò)探測(cè)，定向排列棒狀金 納米顆粒的液晶散射譜及光強(qiáng)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)入射偏振光偏振時(shí)的傳感。4總結(jié)在光學(xué)成像中的棒狀金納米顆粒首先應(yīng)用于基于其lspr散射特性的暗場(chǎng)顯微成像。暗 場(chǎng)顯微成像是在光照射樣品之前添加暗場(chǎng)裝置，使入射光以大的傾斜角度入射，只有當(dāng)樣品 產(chǎn)生高散射或衍射時(shí)，其

19、散射、衍射光才會(huì)被物鏡接收成像。棒狀金納米顆粒因?yàn)榫哂胁ㄩL(zhǎng) 在600nm以上、強(qiáng)烈的lspr長(zhǎng)軸散射峰，因此在暗場(chǎng)顯微成像中具有顯著的暖色系紅色散 射光。我們把棒狀金納米顆粒用二氧化硅包覆并連接ceas抗體標(biāo)記hela癌癥細(xì)胞，用暗場(chǎng)顯 微成像可以在藍(lán)白色細(xì)胞的背景散射光中測(cè)到棒狀金納米顆粒顯著的紅色散射光，棒狀金納 米顆粒易在ctab液晶中的缺陷處容易聚集，因此可対液晶中的缺陷進(jìn)行暗場(chǎng)散射光成像。 我們利用ctab液晶分子對(duì)棒狀金納米顆粒的定向排列作用研究棒狀金納米顆粒lspr散射特 性和光波偏振性的關(guān)系。當(dāng)棒狀金納米顆粒長(zhǎng)軸與光波的偏振方向平行時(shí)，光波引發(fā)強(qiáng)烈的 軸lspr,金納米棒對(duì)光波的散射作用達(dá)到最強(qiáng)；當(dāng)金納米棒反軸方向垂直與光波偏振方向 時(shí)，光波不能引起金納米棒長(zhǎng)軸lspr使散射光達(dá)到最弱。因此定向