蛋白質(zhì)雙向電泳實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)實(shí)驗(yàn)報(bào)告題 目蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)姓 名學(xué) 號(hào)專 業(yè) 小組成員指導(dǎo)教師 中國(guó)·武漢年 月 聯(lián)系方式： 大腸桿菌組蛋白雙向電泳技術(shù)摘要：蛋白質(zhì)雙向電泳是一種等電聚焦與SDS-PAGE相結(jié)合，分辨率更高的蛋白質(zhì)電泳檢測(cè)技術(shù)，也是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中分離純化蛋白質(zhì)的主要方法之一。雙向電泳后的凝膠經(jīng)染色蛋白呈現(xiàn)二維分布圖，水平方向反映出蛋白在等電點(diǎn)上的差異，而垂直方向反映出他們?cè)诜肿恿可系牟顒e。本實(shí)驗(yàn)通過學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)，熟悉了蛋白質(zhì)雙向電泳的簡(jiǎn)單流程?？梢愿鶕?jù)電泳所得的圖像分析，分離蛋白質(zhì)。關(guān)鍵字：蛋白質(zhì)雙向電泳 等電聚焦電泳 SDS-PAGE前言：蛋白質(zhì)組研究的發(fā)展以雙向電

2、泳技術(shù)（2-DE）作為核心。雙向電泳由OFarrells于1975年首次建立并成功地分離約1 000個(gè)E.coli蛋白，并表明蛋白質(zhì)譜不是穩(wěn)定的，而是隨環(huán)境而變化. 雙向電泳原理簡(jiǎn)明，第一向進(jìn)行等電聚焦，蛋白質(zhì)沿pH梯度分離，至各自的等電點(diǎn)；隨后，再沿垂直的方向進(jìn)行分子量的分離. 目前，隨著技術(shù)的飛速發(fā)展，已能分離出10 000個(gè)斑點(diǎn)（spot). 當(dāng)雙向電泳斑點(diǎn)的全面分析成為現(xiàn)實(shí)的時(shí)候，蛋白質(zhì)組的分析變得可行。本實(shí)驗(yàn)是要研究大腸桿菌中的蛋白質(zhì)，并學(xué)習(xí)和初步掌握雙向電泳技術(shù)。正文：1) 實(shí)驗(yàn)原理：從廣義上講，雙向電泳是將樣品電泳后為了不同的目的在垂直方向再進(jìn)行一次電泳的方法。目前蛋白質(zhì)雙向電泳

3、常用的組合第一向?yàn)榈入娋劢梗ㄝd體兩性電解質(zhì)pH梯度或固相pH梯度），根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)進(jìn)行分離，第二向?yàn)镾DSPAGE，根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量分離蛋白質(zhì)。這樣經(jīng)過兩次分離后，在凝膠上顯示出的蛋白點(diǎn)可以獲得蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和相對(duì)分子質(zhì)量信息。雙向電泳技術(shù)作為分離蛋白質(zhì)的經(jīng)典方法，目前得到了相當(dāng)廣泛的應(yīng)用。在植物研究中，成功建立了擬南芥、水稻、玉米等植物種類的雙向電泳圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)推動(dòng)植物蛋白質(zhì)組研究起到重要作用。 第一向等電聚焦：等電聚焦（isoelectrofocusing，IEF）是在凝膠柱中加入一種稱為兩性電解質(zhì)載體（ampholyte）的物質(zhì)，從而使凝膠柱在電場(chǎng)中形成穩(wěn)定、連續(xù)和線性pH梯

4、度。以電泳觀點(diǎn)看，蛋白質(zhì)最主要的特點(diǎn)是它的帶電行為，它們?cè)诓煌膒H值環(huán)境中帶不同數(shù)量的正電荷或負(fù)電荷，只有在某一pH時(shí)，蛋白質(zhì)的凈電荷為零，此pH即為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（isoeletric point，PI）。在電場(chǎng)中，蛋白質(zhì)分子在大于其等電點(diǎn)的pH環(huán)境中以陰離子形式向正極移動(dòng)，在小于其等電點(diǎn)的pH環(huán)境中以陽(yáng)離子形式向負(fù)極移動(dòng)。如果在pH梯度 環(huán)境中將含有各種不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)混合樣品進(jìn)行電泳，不管混合蛋白質(zhì)分子的原始分布如何，都將按照它們各自的等電點(diǎn)大小在pH梯度某一位置進(jìn)行聚集，聚焦部位的蛋白質(zhì)質(zhì)點(diǎn)的凈電荷為零，測(cè)定聚焦部位的pH即可知道該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。 

5、第二向SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳：SDS是一種陰離子表面活性劑，當(dāng)向蛋白質(zhì)溶液中加入足夠量的SDS時(shí)，形成了蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物，這使得蛋白質(zhì)從電荷和構(gòu)象上都發(fā)生了改變。SDS使蛋白質(zhì)分子的二硫鍵還原，使各種蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷，而且它的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原的電荷量，因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間原有的天然的電荷差別。在構(gòu)象上，蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物形成近似“雪茄煙”形的長(zhǎng)橢圓棒，這樣的蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物，在凝膠中的遷移就不再受蛋白質(zhì)原來的電荷和形狀的影響，而僅取決于相對(duì)分子質(zhì)量的大小，從而使我們通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS - PAGE）來測(cè)定蛋白質(zhì)的相

6、對(duì)分子質(zhì)量。 單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N，N甲叉雙丙烯酰胺，在催化劑存在的條件下，通過自由基引發(fā)的聚合交聯(lián)形成聚丙烯酰胺凝膠，這提供了蛋白質(zhì)泳動(dòng)的三維空間凝膠網(wǎng)絡(luò)。在SDS - PAGE電泳時(shí)相對(duì)分子質(zhì)量小的蛋白質(zhì)遷移速度快，相對(duì)分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)遷移速度慢，這樣樣品中的蛋白質(zhì)可以分開形成蛋白質(zhì)條帶。2) 實(shí)驗(yàn)步驟：1. 樣品制備：1.1 蛋白樣品制備方法（TCA-丙酮法）1、收集50mL菌液于離心管中，12000rpm，4離心一分鐘2、倒掉上清，加10mLPBSbuffer洗滌菌體一次， 12000rpm，4離心一分鐘 3、去上清，加20mLPBSbuffer懸浮菌

7、體，加入蛋白酶抑制劑（cocktail 一片），混勻4、超聲波破碎儀或壓力破碎儀破碎細(xì)胞，至菌體懸浮液變澄清5、12000rpm， 4離心10min，去除細(xì)胞碎片。6、將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入適量的核酸酶，混勻，室溫放置20min，以除去樣品中的核酸。7、取0.9mL樣品裂解液分裝到1.5ml離心管中，并在離心管中加入0.3ml 40%的TCA（每組做4管，做好標(biāo)記）。8、混勻后，放置在冰上5min。9、12000rpm， 4離心10min，倒掉上清10、加入1ml丙酮洗滌沉淀， 12000rpm， 4離心5min，重復(fù)三次11、最后倒出丙酮后，再短暫離心，用移液槍吸出殘余的丙酮12、打

8、開離心管的蓋子，室溫放置10-15min，使丙酮完全揮發(fā)13、向離心管中滴加50ul樣品溶解液， 4放置至少3h，溶解蛋白樣品。1.2 制備蛋白樣品所需試劑1細(xì)胞洗滌液 PBS buffer PH7.4 氯化鈉 8g 氯化鉀 0.2g Na2HPO4 1.42g KH2PO4 0.27g 向燒杯中加入約800mL去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙?滴加濃鹽酸將PH值調(diào)至7.4，然后加入去離子水定容至1L. 滅菌后室溫保存2蛋白沉淀劑 40%三氯乙酸（TCA） 40g TCA加水定容至100ml3丙酮 4核酸酶5. 蛋白酶抑制劑 （cocktail，片劑）6樣品溶解液： 尿素 7M 4.2g 硫脲 2M 1

9、.52g CHAPS 4% 0.4g MilliQ水 定容至10ml；分裝成10小管，每小管1ml，-20冰箱保存。 注：不要反復(fù)凍融，分裝保存1.3 蛋白定量 1.3.1 蛋白定量方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量管號(hào)123456標(biāo)準(zhǔn)蛋白液(mL)00.10.20.40.60.8蒸餾水(mL)10.90.80.60.40.2考馬斯亮藍(lán)G-250(mL)444444蛋白含量(g)01020406080OD595nm00.1280.3080.4480.6170.846步驟：1、 取7個(gè)1.5ml的離心管，標(biāo)記管號(hào)1-72、 在1-6號(hào)管中，按上表加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白液（0.1mg/ml BSA），蒸餾水，考

10、馬斯亮藍(lán)R250，混勻后室溫放置5min3、 從冰箱中取出溶解的蛋白樣品，用移液槍反復(fù)吹打幾次，12000rpm，4離心10min，之后將上清轉(zhuǎn)移到一新的離心管中4、 取合適體積的蛋白樣品加入7號(hào)管中，加蒸餾水補(bǔ)足至1ml，考馬斯亮藍(lán)G-250 4mL，混勻后室溫放置5min.5、 用分光光度計(jì)測(cè)得1-7號(hào)管中溶液的光密度OD595nm，(測(cè)之前注意調(diào)零，以1號(hào)管為空白對(duì)照調(diào)零)以A595nm為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)（六個(gè)點(diǎn)為10µg、20 µg、30 µg、40 µg、50 µg），在坐標(biāo)軸上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。6、 利用標(biāo)準(zhǔn)曲線查出回歸方程

11、A595nm=aX+b。7、 根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品蛋白質(zhì)含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果：經(jīng)試驗(yàn)得知：標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.0101X+0.0416 其中，Y：吸光度（OD595nm值） X：蛋白質(zhì)含量（g）2. 第一向分離等電聚焦2.1 上樣方法 1. 從-20取出保存的水化上樣緩沖液，置室溫溶解。2. 從小管中取出水化上樣緩沖液，加入適量樣品、兩性電解質(zhì)(終濃度0.5-1%)和溴酚藍(lán)，充分混勻。3. 沿著聚焦盤中槽的邊緣從左而右線性加入樣品。在槽兩端各1cm左右不要加樣，中間的樣品液一定要連貫。注意：不要產(chǎn)生 氣泡。否則影響到膠條中蛋白質(zhì)的分布。 4. 取出-20冷凍保存的IPG預(yù)制膠條（7cm pH 3-1

12、0），室溫中放置10分鐘。而后，用鑷子去除IPG膠條上的保護(hù)層。5將IPG膠條膠面朝下置于樣品溶液上，膠條的正極（標(biāo)有+）對(duì)應(yīng)于聚焦盤的正極并與電極緊密接觸，不使膠條下面的溶液產(chǎn)生氣泡。6. 在每根膠條上覆蓋1-3ml礦物油(根據(jù)不同膠條長(zhǎng)度,本實(shí)驗(yàn)1.5ml)，防止膠條水化過程中液體的蒸發(fā)。需緩慢的加入礦物油，沿著膠條，使礦物油一滴一滴慢慢加在塑料支撐膜上。7. 對(duì)好正、負(fù)極，蓋上蓋子。將聚焦槽水平放入等電聚焦儀中，設(shè)置等電聚焦程序。7cm膠條水化 12小時(shí)（20） 主動(dòng)水化（50V）S1250V線性30分鐘除鹽S2500V快速30分鐘除鹽S34000V線性3小時(shí)升壓S44000V快速20,

13、000伏小時(shí) 聚焦S5500V快速任意時(shí)間 保持選擇所放置的膠條數(shù)。設(shè)置每根膠條的極限電流。（50mA/根）設(shè)置等電聚焦時(shí)的溫度。（17）2.2 蛋白質(zhì)上樣量雙向電泳第一向 上樣蛋白質(zhì)量IPG膠條的長(zhǎng)度分析型的上樣量（銀或SYPRO Ruby染色）制備型的上樣量（考馬斯亮藍(lán)染色）7 cm10-100ug蛋白200-500ug蛋白11cm50-200ug蛋白250-1,000ug蛋白17cm100-300ug蛋白1-3mg蛋白樣品溶液的上樣體積ReadyStripTM IPG膠條的長(zhǎng)度上樣體積7 cm125ul-250ul11cm185ul-370ul17cm300ul-600ul我組試驗(yàn)中所得

14、到的蛋白質(zhì)量的數(shù)據(jù)為：蛋白質(zhì)的加入量為4ul，所測(cè)蛋白質(zhì)的吸光度為0.354，由標(biāo)準(zhǔn)曲線公式可以得出所測(cè)蛋白質(zhì)含量為30.93ug。經(jīng)查表得：在200-500ul中取300ul，那么待測(cè)蛋白的點(diǎn)樣量為40ul，即在步驟2.1.3中的樣品量為40ul。2.3 水化上樣緩沖液配制：水化上樣緩沖液成分： 尿素 7M 硫脲 2M CHAPS 4% DTT 50mM Benzonase 0.3U/ul PMSF 1mM Carrier Ampholytes 0.2%(w/v) 溴酚藍(lán) 0.001% 水化上樣緩沖液母液配方：尿素 7M 4.2g 硫脲 2M 1.52g CHAPS 4% 0.4g DTT

15、50mM 500ul（1M DTT）Benzonase 0.3U/ul 120ulPMSF 1mM 100ulMilliQ水 定容至10ml；分裝成10小管，每小管1ml，-20冰箱保存。 （1M的DTT：1M的DTT每mL含DTT0.154g）Carrier Ampholytes 0.2%(w/v) 50ul(40%)（現(xiàn)加） 溴酚藍(lán) 0.001% 10µl（1% 溴酚藍(lán)）（現(xiàn)加） 2.4配制蛋白上樣緩沖液： 蛋白溶解液 適量（根據(jù)所制蛋白樣品濃度） 上樣緩沖液母液 適量（根據(jù)蛋白樣品體積） Carrier Ampholytes 0.2%(w/v) 1ul (40%)（現(xiàn)加） 溴酚

16、藍(lán) 0.001% 1ul（1% 溴酚藍(lán)）（現(xiàn)加）混勻之后，12000rpm，4條件下，離心2min，即可用于上樣。3. 膠條的平衡3.1 膠條平衡方法1. 從聚焦盤或-20冰箱中取出的膠條，若直接從聚焦盤中取出膠條，可立即進(jìn)行后續(xù)處理，如果是從-20冰箱中取出的膠條，先于室溫放置10-15分鐘平衡。2. 在桌上先放置干的厚濾紙，聚焦好的膠條膠面朝上放在干的厚濾紙上，吸取膠條上的礦物油。用鑷子夾住膠條的一端（不要碰到膠面），用蒸餾水緩緩沖洗膠條，洗去膠條上殘留的礦物油和多余樣品，這可以減少凝膠染色時(shí)出現(xiàn)的縱條紋。然后將膠條膠面朝上放在干凈濾紙上。3. 準(zhǔn)備好干凈的膠條溶脹盤，將膠條膠面朝上轉(zhuǎn)移至

17、溶漲盤中，每個(gè)槽一根膠條，并加入根據(jù)膠條長(zhǎng)度 加入平衡緩沖液I。將溶脹盤放在水平搖床上平衡15分鐘。5. 第一次平衡結(jié)束后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液l。并用濾紙吸取多余的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面）。再加入膠條平衡緩沖液II，繼續(xù)在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。 6.用鑷子夾住膠條的一端，取出膠條，同樣用蒸餾水緩緩沖洗膠條，洗去多余的平衡液，然后將膠條膠面朝上放在干凈濾紙上。3.2 膠條平衡液配方膠條平衡緩沖液母液： 尿素 6M 36g SDS 2% 2g Tris-HCl 0.375M pH8.8 25ml（1.5M pH8.8 Tris-HCl）

18、甘油 20% 20ml MilliQ水 定容至100ml；分裝成10管，每管10ml，-20冰箱保存。 膠條平衡緩沖液I： 膠條平衡緩沖液母液 10ml DTT 0.2g 充分混勻，用時(shí)現(xiàn)配。 膠條平衡緩沖液II： 膠條平衡緩沖液母液 10ml 碘乙酰胺 0.25g 充分混勻，用時(shí)現(xiàn)配。4. 第二向分離SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳4.1 聚丙烯酰胺凝膠的配制、膠條的轉(zhuǎn)移及電泳1. 配制12%的凝膠1塊。配10ml凝膠溶液，將溶液分別注入玻璃板夾層 中，上部留約1cm的空間，用MilliQ水或水飽和正丁醇封面，保持膠面平整，聚合至少1小時(shí)。(7cm膠條)2. 用濾紙吸去上方玻璃板間多余的液體。將處

19、理好的第二向凝膠放在桌面上，長(zhǎng)玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝膠的頂部對(duì)著自己。 3. 將低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液進(jìn)行加熱溶解。4. 將10×電泳緩沖液稀釋成1×電泳緩沖液。趕去緩沖液表面的氣泡。6. 將平衡好的IPG膠條完全浸末在1×電泳緩沖液中。然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長(zhǎng)玻璃板上。7. 將放有膠條的SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移到灌膠架上，短玻璃板一面對(duì)著自己。8. 用鑷子輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸，不要在膠條下方產(chǎn)生氣泡。9. 之后在IPG膠條上注入低熔點(diǎn)瓊脂糖，待低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液完全凝固后，將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳槽中。10. 在電泳槽加入電泳緩沖

20、液后，接通電源，起始時(shí)低電壓（80V），待樣品在完全走出IPG膠條，再加大電壓至 （120V），待溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時(shí)即可停止電泳。4.2 聚丙烯酰胺凝膠試劑配制低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液： 低熔點(diǎn)瓊脂糖 0.5% 0.5g Tris 25mM 0.303g 甘氨酸 192mM 1.44g SDS 0.1% 1ml（10% SDS） 溴酚藍(lán) 0.001% 100µl（1%溴酚藍(lán)） MilliQ水 定容至100ml；加熱溶解至澄清，室溫保存。 30% 聚丙烯酰胺貯液： 丙烯酰胺 150g 甲叉雙丙烯酰胺 4g MilliQ水 500ml 濾紙過濾后，棕色瓶4冰箱保存。 1.5mol/L

21、Tris pH8.8： Tris 90.75g MilliQ 水 400ml 用 1mol/L HCl 調(diào) pH 至 8.8，加 MilliQ 水定容至500ml。4冰箱保存。 10% SDS： SDS 10g MilliQ水 100ml 混勻后，室溫保存。 10% 過硫酸銨 Ap 0.1g MilliQ水 1ml（用時(shí)加水溶解） 溶解后，4冰箱保存。 10×電泳緩沖液（1×= 25mM Tris，192mM glycine，0.1% SDS，pH8.3） Tris 30g 甘氨酸 144g SDS 10g MilliQ水 1L 混勻后，室溫保存。分離膠配方 10%分離膠 10ml 30%凝膠母液 3.3ml 1.5M Tris 2.5ml ddH20 4ml 10%SDS 100l 10%APS(新備) 100l TEMED 4l 依次緩慢加入上述試劑，輕輕搖勻后注入已封好的制膠板中，頂部預(yù)留0.5cm左右的空間，加正丁醇或純水壓平膠面。5. 凝膠染色考馬斯亮藍(lán)染色1 電泳結(jié)束后，輕輕撬開兩層玻璃，取出凝膠，清水漂洗后放入 染色盤中