基因工程的基本工具和基本操作程序復(fù)習(xí)進(jìn)程

1、基因工程的基本工具和基本操作程序ppt高頻考點(diǎn)突破高頻考點(diǎn)突破考點(diǎn)一考點(diǎn)一 基因工程的概念理解和理論基礎(chǔ)基因工程的概念理解和理論基礎(chǔ)1.1.基因工程的概念理解基因工程的概念理解 (1)(1)操作環(huán)境：體外操作環(huán)境：體外關(guān)鍵步驟關(guān)鍵步驟“表達(dá)載體的構(gòu)表達(dá)載體的構(gòu) 建建”的環(huán)境。的環(huán)境。 提醒提醒 切割的化學(xué)鍵為磷酸二酯鍵。切割的化學(xué)鍵為磷酸二酯鍵。 在 切 割 目 的 基 因 和 載 體 時(shí) 要 求 用 同 一 種 限 制 酶在 切 割 目 的 基 因 和 載 體 時(shí) 要 求 用 同 一 種 限 制 酶 , , 目的是產(chǎn)生相同的黏性末端。目的是產(chǎn)生相同的黏性末端。 將一個(gè)基因從將一個(gè)基因從DNA

2、DNA分子上切割下來分子上切割下來, ,產(chǎn)生兩個(gè)切口產(chǎn)生兩個(gè)切口, ,同時(shí)形成同時(shí)形成四個(gè)粘性末端四個(gè)粘性末端, ,切割載體產(chǎn)生一個(gè)切口，形成兩個(gè)粘性末端。切割載體產(chǎn)生一個(gè)切口，形成兩個(gè)粘性末端。 不 同不 同 D N AD N A 分 子 用 同 一 種 限 制 酶 切 割 產(chǎn) 生 的 黏 性 末分 子 用 同 一 種 限 制 酶 切 割 產(chǎn) 生 的 黏 性 末 端 都 相 同端 都 相 同 , , 同 一 個(gè)同 一 個(gè) D N AD N A 分 子 用 不 同 的 限 制 酶 產(chǎn) 生 的分 子 用 不 同 的 限 制 酶 產(chǎn) 生 的 黏性末端不相同。黏性末端不相同。2.DNA2.DNA連接

3、酶連接酶“分子縫合針分子縫合針”常用類型常用類型E Ecoli coli DNADNA連接連接酶酶T T4 4 DNADNA連接酶連接酶來源來源大腸桿菌大腸桿菌T T4 4噬菌體噬菌體功能功能連接黏性末端連接黏性末端連接黏性末端或連接黏性末端或平末端平末端結(jié)果結(jié)果恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵的磷酸二酯鍵 拓展提升拓展提升 DNADNA連接酶與連接酶與DNADNA聚合酶的比較聚合酶的比較DNA DNA 連接酶連接酶DNA DNA 聚合酶聚合酶作用實(shí)質(zhì)作用實(shí)質(zhì)都是催化兩個(gè)脫氧核苷酸之間形成磷酸二都是催化兩個(gè)脫氧核苷酸之間形成磷酸二酯鍵酯鍵是否需模板是

4、否需模板不需要不需要需要需要連接連接DNADNA鏈鏈雙鏈雙鏈單鏈單鏈作用過程作用過程在兩個(gè)在兩個(gè)DNADNA片段之片段之間形成磷酸二酯鍵間形成磷酸二酯鍵將單個(gè)核苷酸加到已將單個(gè)核苷酸加到已存在的核酸片段的存在的核酸片段的33端的羥基上端的羥基上, ,形成磷酸形成磷酸二酯鍵二酯鍵作用結(jié)果作用結(jié)果將兩個(gè)將兩個(gè) DNADNA片段連片段連接成重組接成重組 DNADNA分子分子合成新的合成新的DNADNA分子分子3.3.基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體“分子運(yùn)輸車分子運(yùn)輸車” (1)(1)類型類型 提醒提醒 質(zhì)粒本質(zhì)是質(zhì)粒本質(zhì)是DNA,DNA,不是細(xì)胞器不是細(xì)胞器; ;特點(diǎn)特點(diǎn): :小小 型

5、環(huán)狀。型環(huán)狀。 (2)(2)功能：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞。功能：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞。 (3)(3)應(yīng)具備條件應(yīng)具備條件 能在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定保存并大量復(fù)制；能在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定保存并大量復(fù)制； 有一個(gè)至多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)有一個(gè)至多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn), ,以便于與外源以便于與外源 基因連接；基因連接； 有特殊的遺傳標(biāo)記基因有特殊的遺傳標(biāo)記基因, ,供重組供重組DNADNA的檢測和鑒定。的檢測和鑒定。最常用載體最常用載體:質(zhì)粒質(zhì)粒其他載體其他載體:噬菌體的衍生物、動(dòng)植物病毒等噬菌體的衍生物、動(dòng)植物病毒等 提醒提醒 一般來說一般來說, ,天然載體往往不能滿足人類的天然載體往往不能滿足人類的 所有要

6、求所有要求, ,因此人們根據(jù)不同的目的和需要因此人們根據(jù)不同的目的和需要, ,對某對某 些天然的載體進(jìn)行人工改造。些天然的載體進(jìn)行人工改造。 常見的標(biāo)記基因有抗生素基因、產(chǎn)生特定顏色常見的標(biāo)記基因有抗生素基因、產(chǎn)生特定顏色 的表達(dá)產(chǎn)物基因、發(fā)光基因等。的表達(dá)產(chǎn)物基因、發(fā)光基因等。 作為載體必須具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)作為載體必須具有多個(gè)限制酶切點(diǎn), ,而且每種酶而且每種酶 的切點(diǎn)最好只有一個(gè)。因?yàn)槟撤N限制酶只能識別的切點(diǎn)最好只有一個(gè)。因?yàn)槟撤N限制酶只能識別 單一切點(diǎn)單一切點(diǎn), ,若載體上有一個(gè)以上的酶切點(diǎn)若載體上有一個(gè)以上的酶切點(diǎn), ,則切割則切割 重組后可能丟失某些片段重組后可能丟失某些片段, ,

7、若丟失的片段含復(fù)制起若丟失的片段含復(fù)制起 點(diǎn)區(qū)點(diǎn)區(qū), ,則進(jìn)入受體細(xì)胞后便不能自主復(fù)制。一個(gè)載則進(jìn)入受體細(xì)胞后便不能自主復(fù)制。一個(gè)載 體若只有某種限制酶的一個(gè)切點(diǎn)體若只有某種限制酶的一個(gè)切點(diǎn), ,則酶切后既能把則酶切后既能把 環(huán)打開接納外源環(huán)打開接納外源DNADNA片段片段, ,又不會丟失自己的片段。又不會丟失自己的片段。 注意與細(xì)胞膜上載體的區(qū)別注意與細(xì)胞膜上載體的區(qū)別, ,兩者的化學(xué)本質(zhì)和兩者的化學(xué)本質(zhì)和 作用都不相同。作用都不相同。 質(zhì)粒能自我復(fù)制質(zhì)粒能自我復(fù)制, ,既可在自身細(xì)胞、受體細(xì)胞也既可在自身細(xì)胞、受體細(xì)胞也 可在體外復(fù)制?？稍隗w外復(fù)制。考點(diǎn)三考點(diǎn)三 基因工程的基本操作程序基因

8、工程的基本操作程序1.1.基因工程圖解基因工程圖解: :抗蟲棉的培育過程抗蟲棉的培育過程二、基因工程的基本操作程序二、基因工程的基本操作程序1目的基因的獲取目的基因的獲取(1)目的基因：指編碼蛋白質(zhì)的目的基因：指編碼蛋白質(zhì)的 。(2)獲取目的基因的方法獲取目的基因的方法從基因文庫從基因文庫 (基因組文庫或基因組文庫或cDNA文庫文庫)中獲取中獲取a基因文庫的含義：將含有某種生物不同基因的許基因文庫的含義：將含有某種生物不同基因的許多多 ，導(dǎo)入，導(dǎo)入 的群體中儲存，各個(gè)受體菌分的群體中儲存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基

9、因受體菌受體菌DNA片段片段文庫類型文庫類型cDNAcDNA文庫文庫基因組文庫基因組文庫文庫大小文庫大小小小大大基因中啟動(dòng)子基因中啟動(dòng)子無無有有基因中內(nèi)含子基因中內(nèi)含子無無有有基因多少基因多少某種生物的部分基因某種生物的部分基因某種生物的全部基因某種生物的全部基因物種之間的物種之間的基因交流基因交流可以可以部分基因可以部分基因可以說明說明基因文庫的組建過程就包含基因工程的基本基因文庫的組建過程就包含基因工程的基本操作步驟。從基因文庫中獲取目的基因的操作步驟。從基因文庫中獲取目的基因的優(yōu)優(yōu)點(diǎn)點(diǎn)是操作簡便是操作簡便,缺點(diǎn)缺點(diǎn)是工作量大是工作量大,具有一定的具有一定的盲目性盲目性b.基因文庫的種類基

10、因文庫的種類c目的基因的獲取依據(jù)：目的基因的獲取依據(jù)：()基因的基因的 序列；序列；()基因的功能；基因的功能；()基因在染色體上的位置；基因在染色體上的位置；()基因的基因的 產(chǎn)物產(chǎn)物mRNA；()基因的翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)?；虻姆g產(chǎn)物蛋白質(zhì)。核苷酸核苷酸轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 人工合成目的基因人工合成目的基因: :常用的方法有化學(xué)合成法和常用的方法有化學(xué)合成法和 反轉(zhuǎn)錄法。反轉(zhuǎn)錄法。 化學(xué)合成法化學(xué)合成法: :蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 氨基酸序列氨基酸序列 RNARNA 堿基序列堿基序列 DNADNA堿基序列堿基序列 用用4 4種脫氧核種脫氧核 苷酸人工合成目的基因苷酸人工合成目的基因 反轉(zhuǎn)錄法反轉(zhuǎn)錄法: :分離出供

11、體細(xì)胞分離出供體細(xì)胞mRNA mRNA 單鏈單鏈DNADNA 合成目的基因合成目的基因 分析分析推測推測推測推測逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶DNADNA聚合酶聚合酶利用利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因技術(shù)擴(kuò)增目的基因aPCR的含義：是一項(xiàng)在生物體外的含義：是一項(xiàng)在生物體外 特定特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。片段的核酸合成技術(shù)。b目的：獲取大量的目的基因目的：獲取大量的目的基因c原理：原理：DNA復(fù)制復(fù)制d前提條件：有一段已知目的基因的前提條件：有一段已知目的基因的 和根據(jù)該序列合成的和根據(jù)該序列合成的 e過程：目的基因受熱形成過程：目的基因受熱形成 ，與引物，與引物結(jié)合，在結(jié)合，在 的作用下延伸形成的作用下延伸

12、形成DNA。f方式：指數(shù)擴(kuò)增方式：指數(shù)擴(kuò)增2n(n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù))復(fù)制復(fù)制核苷酸序列核苷酸序列單鏈單鏈DNADNA聚合酶聚合酶引物PCRPCR擴(kuò)增技術(shù)與擴(kuò)增技術(shù)與DNADNA復(fù)制的比較復(fù)制的比較PCRPCR技術(shù)技術(shù)DNADNA復(fù)制復(fù)制相相同同點(diǎn)點(diǎn)原理原理DNADNA復(fù)制復(fù)制( (堿基互補(bǔ)配對堿基互補(bǔ)配對) )原料原料四種游離的脫氧核苷酸四種游離的脫氧核苷酸條件條件模板、模板、ATPATP、酶、原料、引物、酶、原料、引物不不同同點(diǎn)點(diǎn)解旋解旋方式方式DNADNA在高溫下變性解旋在高溫下變性解旋解旋酶催化解旋酶催化場所場所體外復(fù)制體外復(fù)制(PCR(PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增儀) )主要在細(xì)胞

13、核內(nèi)主要在細(xì)胞核內(nèi)酶酶熱穩(wěn)定的熱穩(wěn)定的DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶酶) ) 細(xì)胞內(nèi)含有的細(xì)胞內(nèi)含有的DNADNA聚合酶聚合酶結(jié)果結(jié)果在短時(shí)間內(nèi)形成大量的在短時(shí)間內(nèi)形成大量的DNADNA片段片段形成整個(gè)形成整個(gè)DNADNA分子分子基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體的構(gòu)建最核心步驟最核心步驟（）表達(dá)載體的功能（）表達(dá)載體的功能使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且 給下給下一代。一代。使目的基因使目的基因 和發(fā)揮作用。和發(fā)揮作用。（）基因表達(dá)載體的組成（）基因表達(dá)載體的組成: :啟動(dòng)子目的基因終止子啟動(dòng)子目的基因終止子標(biāo)記基因。標(biāo)記基因。遺傳遺傳表達(dá)表達(dá)

14、啟動(dòng)子：位于基因的啟動(dòng)子：位于基因的 ，它是，它是 識識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA。終止子：位于基因的尾端，終止終止子：位于基因的尾端，終止 。標(biāo)記基因：標(biāo)記基因： 是否含有目的基因。是否含有目的基因。 （）基因表達(dá)載體的構(gòu)建方法（）基因表達(dá)載體的構(gòu)建方法 提醒提醒 該過程把三種工具該過程把三種工具( (只有兩種工具酶只有兩種工具酶) )全用全用 上了上了, ,是最核心、最關(guān)鍵的一步是最核心、最關(guān)鍵的一步, ,在體外進(jìn)行。在體外進(jìn)行。mRNA的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄鑒別受體細(xì)胞鑒別受體細(xì)胞首端首端RNA聚合酶聚合酶3將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

15、轉(zhuǎn)化的含義：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并在受體轉(zhuǎn)化的含義：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并在受體細(xì)胞內(nèi)維持細(xì)胞內(nèi)維持 的過程。的過程。(1)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞方法：方法：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法a農(nóng)桿菌特點(diǎn)：易感染農(nóng)桿菌特點(diǎn)：易感染 植物和裸子植物，植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力；對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力；Ti質(zhì)粒的質(zhì)粒的 可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞的染色體可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上。上。 b轉(zhuǎn)化過程：轉(zhuǎn)化過程：將目的基因插入將目的基因插入轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞導(dǎo)入植物細(xì)胞整合到受體細(xì)胞的整合到受體細(xì)胞的DNAD

16、NA上。上?；驑尫ɑ驑尫ɑǚ酃芡ǖ婪ɑǚ酃芡ǖ婪p子葉雙子葉TDNATiTi質(zhì)粒的質(zhì)粒的T TDNADNA上上穩(wěn)定和表達(dá)穩(wěn)定和表達(dá)(2)將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞方法：方法： 注射技術(shù)。注射技術(shù)。操作程序：操作程序：將含有目的基因的表達(dá)載體提純將含有目的基因的表達(dá)載體提純?nèi)÷讶÷勋@得獲得顯微注射顯微注射早期胚胎培養(yǎng)早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植胚胎移植發(fā)育成為具有新性狀的動(dòng)物發(fā)育成為具有新性狀的動(dòng)物。(3)將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞微生物作為受體細(xì)胞特點(diǎn)：個(gè)體微小，代謝旺微生物作為受體細(xì)胞特點(diǎn)：個(gè)體微小，代謝旺盛，盛， ，獲得目的基因產(chǎn)物多。，獲得目的基因產(chǎn)物

17、多。轉(zhuǎn)化：轉(zhuǎn)化： 處理細(xì)胞處理細(xì)胞重重組表達(dá)載體分子與感受態(tài)細(xì)胞混合組表達(dá)載體分子與感受態(tài)細(xì)胞混合促進(jìn)感受促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子。分子。提醒提醒 唯一不涉及到堿基互補(bǔ)配對的操作步驟。唯一不涉及到堿基互補(bǔ)配對的操作步驟。顯微顯微用用Ca2繁殖速度快繁殖速度快受精卵受精卵感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞 (4)(4)目的基因的檢測與鑒定目的基因的檢測與鑒定解題思路探究解題思路探究思維誤區(qū)警示思維誤區(qū)警示易錯(cuò)分析易錯(cuò)分析 基因工程中易錯(cuò)點(diǎn)辨析不清基因工程中易錯(cuò)點(diǎn)辨析不清 (1)(1)基因工程中有基因工程中有3 3種工具種工具, ,但工具酶只有但工具酶只有2 2種。種。 (2)(2)工具酶本質(zhì)為蛋

18、白質(zhì)工具酶本質(zhì)為蛋白質(zhì), ,載體本質(zhì)為小型載體本質(zhì)為小型DNADNA分分子子, ,但不一定是環(huán)狀。但不一定是環(huán)狀。 (3)(3)標(biāo)記基因的作用標(biāo)記基因的作用篩選、檢測目的基因是篩選、檢測目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞否導(dǎo)入受體細(xì)胞, ,常見的有抗生素抗性基因、發(fā)光基常見的有抗生素抗性基因、發(fā)光基因因, ,表達(dá)產(chǎn)物為帶顏色物質(zhì)等。表達(dá)產(chǎn)物為帶顏色物質(zhì)等。 (4) (4)受體細(xì)胞中常用植物受精卵或體細(xì)胞受體細(xì)胞中常用植物受精卵或體細(xì)胞( (經(jīng)組織經(jīng)組織培養(yǎng)培養(yǎng)) )、動(dòng)物受精卵、動(dòng)物受精卵( (一般不用體細(xì)胞一般不用體細(xì)胞) )、微生物、微生物大腸桿菌、酵母菌等大腸桿菌、酵母菌等, ,但要合成糖蛋白、有生物活性但要合成糖蛋白、有生物活性的胰島素則必需用真核生物酵母菌的胰島素則必需用真核生物酵母菌需內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高需內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體的加工、分泌。一般不用支原體爾基體的加工、分泌。一般不用支原體, ,原因是它營原因是它營寄生生活寄生生活; ;一定不能用哺乳動(dòng)物成熟紅細(xì)胞一定不能用哺乳動(dòng)物成熟紅細(xì)胞, ,原因是它原因是它無細(xì)胞核無細(xì)胞核, ,不能合成蛋白質(zhì)。不能合成蛋白質(zhì)。1、許多人企求著生活的完美結(jié)局，殊不知美根本不在結(jié)局，而在于追求的過程。2、慢慢的才知道：堅(jiān)持未必就是勝利，放棄未必就是