35限食對小鼠各組織乳酸脫氫酶的影響

1、復旦大學利政學者論文集f 20021限食對小鼠各組織乳酸脫氫酶的影響張敏華98級生命科學學院?摘要通過限制飲食的方法，來研究乳酸脫氫酶(LDH)在衰老過程中的變化，利用小鼠為動物模型，在測定小鼠食量后, 將之分為三組.分別為限食I組食量為正常食量的60%八 限食II組每個星期6天為60%食量"1天為90%) 和對照組ad-lib共限食六個月；每月殺鼠測定心臟和大腦中 LDH的活性和LDH同功酶的變化、實驗結果表明LDH活性呈現(xiàn)一個峰形的變化而且限食I組心臟的LDH比活性和總活性要較其他二組低(p<0.05)由于LDH活性的變化與自由基的存在有一定的關系,由此推斷自由基在衰老過程

2、中起著一定的作用，而不間斷限食可以清除體內自由基并且延緩衰老， 關鍵字；限食，乳酸脫氫酶.自由基Abstract： Using dietary restriction, we study the changing process of the activity of Lactate dehydrogenase (LDH) during the period of aging. We use mice as our animal model and divide them into three groups after testing the amount of their food intak

3、e. The three groups are DR (dietary restriction) I (which have 60% of their normal food intake), DRII (which have 60% food six times and 90% food once in a week), and control (which is called ad-lib). Every month we test the activity of LDH in three groups, and investigate the change of LDH isoenzym

4、es by electrophoresis. The result of our research shows that the activity of LDH rises first and then falls down. The activity of LDH of DRI is less than that of the other two groups (p<0.05). Since there is a relationship between the activity of LDH and free radicals, we can deduce that free rad

5、icals have played a role in the process of aging and that long-time dietary restriction can have the anti-aging effect to reduce the level of free radicals in our bodies.Key words : dietary restriction, lacatate dehydrogenase (LDH), free radical衰老是一個非常復雜并受多種因素影響的過程-許多科學家對于衰老進行了研究著名的Hayflick界限就說明了正常細

6、胞不可能無限分裂.衰老是一個不可避免的過程針對衰老的復雜性科學家提出許多相關的理論包括突變理論.端粒酶理論長壽決定基因假說等等 .其中最重要的可能是自由基理論 這個理論是在1956年最早由Harman提出的.它認為衰老是由一系列 的自由基反應所造成，這一過程同時還受到外在環(huán)境、疾病、自身衰老進程的影響.自由基理論的基礎是自由基的化學本質和其在生物體內的廣泛存在性3 在生物氧化代謝過程中一小部分氧可以轉變成為超氧化物-這些超氧化物在一些化學或生化反應中成為活性氧 < ROS'和自由基自由基對衰老的作用主要表現(xiàn)在對DNA的損傷和對線粒體的氧化上在所有的氧自由基中-活性最高的是

7、6; OH.它能快速的與DNA的脫氧核糖和堿基反應， 從而引起DNA堿基結構的改變和損害5自由基對于線粒體有極大的損傷可以導致線粒體 DNA突變，并使得能量產出減少，從而產生機體的衰老【化 同時，線粒體內膜脂質過氧化也是造成衰老 的一個主要原因、另外，自由基可以直接或間接地抑制酶的活性，對于蛋白質有很強的修飾作用-細胞內的信號傳導會由于受體蛋白的修飾而改變問，可見；自由基給機體帶來很大的傷害-事實上-幾乎每種疾病都在某種程度上與自由基的氧化有關9-為了抵御自由基對機體的損害 ，生物體內存在著一系列的保護措施-一些抗氧化酶如過氧化物歧化酶【SOD、谷胱甘肽過氧化氫酶CGPX）可以清除有害的自由基

8、-另外，體內的一些抗氧化劑如Vc、Ve、褪黑激素也有緩解氧化壓力的作用-而這些抗氧化劑的減少會對機體健康帶來很大的影響，有實驗證明 Ve的減少會導致紅細胞存活周期的減少、神經元功能失常、免疫應答受破壞、和一些癌癥的產生10L除了抗氧化劑限制飲食是一種很好的抗衰老的方法 :.McCay和他的同事在1935年最早發(fā)現(xiàn) 了限制飲食與延緩衰老相關11,此后“許多實驗都證實控制食量在正常食量的 50%-70%的小鼠. 其壽命較不限食的小鼠要長并且一些與衰老相關的疾病出現(xiàn)的也較晚 12,對于限食的抗衰老作用 科學家提出了一些可能的機制 ：.首先.限食可以改變機體代謝率使神經和激素的調節(jié)發(fā)生改變 2. 而且

9、，限食可以減緩自由基對細胞的損傷 ；使DNA修復的忠實性增強13另外，有實驗表明.限 食可以提高蛋白質更新的速率 “而這對于清除體內自由基來說是非常重要的 14,在衰老研究過程中，通常需要選擇一些相關的生物指標.本實驗選取了乳酸脫氫酶LDHX乳酸脫氫酶在無氧代謝中起著重要的作用其通過消耗 NADH可逆地催化丙酮酸產生乳酸:.其催化的化學反應方程式如下:LDHCH3CH0HC00 + NAD乳酸一； CH 3COCOO- + NADH + H丙酮酸在哺乳動物中乳酸脫氫酶存在著 5種同功酶：.這五者分子量相近，大約在130000-150000道 爾頓:.每種同功酶都由五個亞基組成 ，每個亞基即每條

10、肽鏈的分子量在 35000道爾頓左右：.亞基可 以分為兩類：一類為骨骼型Mb 類為心肌型五種同功酶的亞基組成為 MMMM、MMMH、MMHH、MHHH、HHHH、依次稱為 LD1、LD2、LD3、LD4、LD5 ；其中LD1在電場中泳動速率 最慢，而LD5最快15 LDH的同功酶組成具有隨齡變化的特性，不同年齡的同種個體具有不同類型的同功酶組成.有些科學家用人胚胎組織進行實驗.發(fā)現(xiàn)了心臟組織 LDH同功酶隨年齡的增加.LD1逐漸減少，而LD4、LD5逐漸增多16 、LDH的活性也與衰老的進程有關；整個生命過程中 ' 乳酸脫氫酶的活性經過了一個先升高再 降低的過程15代謝中產生的自由基會

11、對 LDH的活性產生影響:.在使用抗氧化劑褪黑激素后、可 以使乳酸脫氫酶的活性降低1嘰這表明自由基有增加 LDH活性的作用：.所以用乳酸脫氫酶作為衰 老的指標，可以更好的理解自由基在衰老中起的作用.本實驗采用不同的限食方法 （60%限食和60%+90%限食），以LDH為生物指標， 來檢測限制飲食對衰老的影響，從而可以從自由基理論的角度來進一步闡明衰老的過 程，進而提出合適的延緩衰老的方法'1材料和方法11材料Balb/c 小鼠10周大；雄性）由上海海軍醫(yī)學研究所提供；于常溫約20 d 喂養(yǎng)；1 2方法（1）限食將小鼠單獨飼養(yǎng)，通過前一天和后一天的食物重量之差來測定小鼠食量，給小鼠稱體重

12、并隨機分為三組.分別為限食I組60%限食）、限食II組每個星期6天為60% 一天為90%）和對 照組ad-lib h進行限食實驗:.每月每組處死4-5只小鼠，對乳酸脫氫酶進行檢測.、（2）乳酸脫氫酶的提取和酶活測定 提取小鼠斷頸處死取出心臟、大腦“在生理鹽水中清洗，剪碎，分別加入5倍體積0.05M磷酸 鈉緩沖液pH 7.4），低溫勻漿“ 4度10000rpm離心30mi取上清：. 蛋白總量測定雙縮脲法.在540nm測OD值、由標準酪蛋白溶液測得標準曲線通過標準曲線求得蛋白質含量:. LDH活性測定測定方法參見19在340 nm下；在石英杯中依次加入 0.1 M磷酸鈉緩沖液 pH 7.4】1.5

13、 ml,酶 液以總蛋白0.05 OD540加入100 d為標準X調零；快速加入30 d的0.01 M煙酰胺腺嘌呤二核 苷酸（NAD）和50 d乳酸鈉，混勻后記錄初始吸光度“并每隔半分鐘記一次吸光度，連續(xù)測定三分鐘：.OD340的增加值可以表示 LDH的活力,（3）LDH同功酶檢測 電泳垂直板聚丙酰胺凝膠電泳采用不連續(xù)膠.其中濃縮膠濃度 5% 分離膠濃度6%, 凝膠配方參見電分子克隆孑染色利用酶反應特異性顯色使凝膠上只顯現(xiàn)出 LDH同功酶的五條帶,染色液配方：氯化硝基四氮唑藍 （NBT）溶液0.2% 8 ml，N-四基吩嗪甲基硫酸鹽 （PMS）溶液0.2% 1 mlNAD 溶液 0.01 M 5

14、 ml孚L酸鈉溶液50-60% ':中國醫(yī)藥化學試劑公司 ）10 ml磷酸鈉緩沖液0.05 M pH7.026ml于30 C避光染色20分鐘2結果2 .1 LDH在限食過程中比活性的變化晞用窗al 對限限D-0 0123+56time(month)圖2.1.1心臟LDH在限食中比活性變化正方形點表示對照組.三角形點表示限食I組：60%；圓形 點表示限食II組：.一星期中六天，-'60% 一天90%；.每個 點表示在每一時期LDH酶活的平均值.點上的豎線表示平 均值的標準誤“01234 S 6time(month)圖2.1.2大腦LDH在限食中比活性變化正方形點表示對照組.三角形

15、點表示限食I組：.60%；圓形 點表示限食II組：:一星期中六天-.60% 一天90%；.每個 點表示在每一時期LDH酶活的平均值.點上的豎線表示平 均值的標準誤由上兩圖可以看出在整個實驗周期中、LDH活性最高值出現(xiàn)在限食的第 3個月:.心臟的LDH 活性在3個月后不同組出現(xiàn)了差異限食I組的酶活要低于其他兩組在第4個月、這種差異顯著 經學生氏t檢驗p<0.05 ：而在大腦中不同組之間不存在明顯的差異 :.2 .2 LDH在限食過程中總酶活的變化各器官組織重量在限食中的變化表2.2.1心臟重量在限食過程中的變化限食時間(月)心臟重量i g)對照組限食1組限食II組0月0.168-0.025

16、 0.181丄 0.027 0.188-0.0171月0.169二 0.009 0.134土 0.002 0.141二 0.0082月0.150-0.006 0.137丄 0.010 0.149-0.0123月0.165-0.006 0.140丄 0.004 0.158-0.0114月0.142-0.013 0.139丄 0.017 0.134-0.0055月0.157-0.010 0.143丄 0.009 0.155-0.0096月0.1690.011 0.1110.014 0.1220.013表2.2.2大腦重量在限食過程中的變化限食時間（月）大腦重量i g)對照組限食1組限食II組0月0

17、.406-0.053 0.405丄 0.043 0.464-0.0591月0.336-0.033 0.3340.018 0.348-0.0212月0.331-0.023 0.3270.009 0.3020.0113月0.295-0.032 0.3290.021 0.3860.0314月0.366二 0.015 0.3010.023 0.300二 0.0425月0.348-0.011 0.2990.014 0.3250.0186月0.3200.023 0.2990.008 0.3010.027對照組 限食I組 限食II組0123456tlme(month)對照組 限食I組 限食II組OOOOOO

18、OOOOOOO64208642086422222111112 O14time(mo nth)圖2.2.1心臟LDH在限食中總活性變化正方形點表示對照組一三角形點表示限食I組：.60%；圓形 點表示限食II組：.一星期中六天，-,60%. 天90%;.每個 點表示在每一時期LDH酶活的平均值一點上的豎線表示平 均值的標準誤圖222大腦LDH在限食中總活性變化正方形點表示對照組.三角形點表示限食I組: 60% 圓形 點表示限食II組：.一星期中六天，-,60%. 天90%;.每個 點表示在每一時期LDH酶活的平均值.點上的豎線表示平均 值的標準誤從上圖可看出LDH的總酶活在限食過程中也經歷了先升高

19、再降低的過程，而且心臟LDH的總酶活在限食第 3,4個月時“限食I組的酶活就明顯低于其他兩組經學生氏t檢驗，p<0.05：可見LDH總酶活的變化與比活性的變化是一致的.2.3 DH 同功酶檢測心臟LDH同功酶電泳圖譜見圖 2.3.1,2.3.2, 2.3.3LD1LD2LD3LD4LD5圖2.3.1心臟LDH同功酶對照組電泳圖譜二該圖由每月電泳結果拼接而成一每一道代表一個月一從左自右分別為0、1 2 3 4 5 6月丿LD1LD2LD3LD4LD5圖2.3.2心臟LDH同功酶限食I組電泳圖譜該圖由每月電泳結果拼接而成每一道代表一個月一從左自右分別為Li。、1、2 3 4 5 6月LD1L

20、D2LD3LD4LD5圖2.3.3心臟LDH同功酶限食II組電泳圖譜I該圖由每月電泳結果拼接而成.每一道代表一個月從左自右分別為匸0、1、2 3 4 5 6月大腦LDH同功酶電泳圖譜見圖 2 34, 2.3.5, 2.3.6LD1LD2LD3LD4LD5圖2.3.4大腦LDH同功酶對照組電泳圖譜1、該圖由每月電泳結果拼接而成 每一道代表一個月，從左自右分別為liO、2 3 4 5 6月LD1LD2LD3LD4LD5圖2.3.5大腦LDH同功酶限食I組電泳圖譜LD1LD2LD3LD4LD5圖2.3.6大腦LDH同功酶限食II組電泳圖譜（該圖由每月電泳結果拼接而成每一道代表一個月，從左自右分別為：

21、0、2 3 4 5 6月一|該圖由每月電泳結果拼接而成廠每一道代表一個月一從左自右分別為liO、2、3、4 5 6月1從以上6個電泳圖譜可以看出在心臟中限食I組在第4 5兩個月中LD4和LD5要較其他 兩組在這兩月中明顯：限食II組和對照組差異不大.在大腦中；三個實驗組的LDH同功酶的差異 不顯著：.3.分析與討論3 1 LDH 的比活性從實驗結果來看，在6個月的限食過程中、LDH比活性的變化經歷了一個先升高再降低的過程、另外，從心臟和大腦LDH比活性變化的比較上看“大腦LDH活性變化趨勢較心臟的變化要快，圖中峰值處較窄，而心臟LDH活性的變化較平坦-這與S.N.Si ngh ,M.S.Ka

22、nun go的研究結果相一 致17：L對于LDH活性的變化過程，我們的解釋是-在小鼠的生命中，存在著一個快速生長階段和 一個逐漸衰老的階段在本實驗中 0-第3月是小鼠的生長階段代謝旺盛 LDH活性呈上升趨勢- 第3 4月LDH活性到達頂峰以后的第5 6月活性明顯下降小鼠進入衰老階段所以本實 驗過程含概了小鼠的整個生長過程從心臟LDH比活性的變化可以看出，限食I組的小鼠其酶活要明顯比其他兩組低-其中限食第4個月的小鼠最顯著，：p<0.05),這說明限食可以使 LDH活性下降：這是由于限食使細胞內自由 基減少所致L自由基對于LDH的影響不僅可以使 LDH由于細胞破損而釋放增多，同時還可以提高

23、 LDH的活性，對此.科學家利用CCL4來提高肝臟細胞內的自由基數(shù)量結果表明LDH的活性有明顯增高20自由基之所以可以使 LDH活性提高，是由于自由基可以氧化細胞膜、線粒體膜上的不飽和脂肪酸使膜受損傷同時使鑲嵌在膜上的一系列酶排列紊亂功能下降.導致三羧酸循環(huán)和電子傳遞鏈受阻2役細胞不能進行有效的三羧酸循環(huán)對于無氧代謝途徑的依賴加重，孚L酸發(fā)酵增多，從而LDH活性增強，大腦LDH活性的變化沒有出現(xiàn)和心臟一樣的結果、這說明限食對于大腦自由基水平的影響不大：.大腦作為神經中樞需要有充足的能量代謝如果大腦能量供應不足“會導致各種疾病甚至死亡：.在限食中.雖然攝入能量減少但是動物體首先要保證大腦的能量供

24、應所以在這種情況下大腦神經原細胞自由基的水平不會發(fā)生很大的波動：.有實驗證明，對于NT2-N神經原細胞缺氧和葡萄糖缺乏都不會使其自由基增多22:.另一個有趣的現(xiàn)象是 在心臟中“限食II組即每個星期6天為60% 一天為90% 的LDH 活性并沒有明顯降低，與對照組相比沒有顯著差異，這說明限食使LDH活性降低是一個積累的過 程，在一個星期內并不能表現(xiàn)出來，只要一個星期中一天的食量增加到90%就足以抵消前六天限食所降低的自由基水平從而恢復到未限食的程度，這一點可以給我們一個很好的啟發(fā)：.限食應 該是一個持續(xù)性的過程：.只有不間斷的限食才能有效的延緩衰老3 2 LDH 總活性從表223,224中可以看

25、出乳酸脫氫酶的總酶活變化與比活相似，兩者存在著一致性，3 3 LDH 同功酶通過圖2.3.1,232,233的相互比較發(fā)現(xiàn)；心臟限食I組第4 5月的同功酶圖譜與其他兩個組 差異很大；其LD4" LD5比對照組和限食II組要更明顯：.LD4； LD5的亞基組成分別是 MHHH ； HHHH ；這說明限食的作用使 H亞基合成增加相應的含較多 H亞基的同功酶也會增多；這一現(xiàn) 象是合理的i根據Pfleiderer & Wachsmuth的發(fā)現(xiàn)；一些進行相對較多無氧代謝的組織；其乳酸脫氫酶同功酶的組成主要是LD1 ； LD2 LD3【2汽可以推斷含較多 M亞基的同功酶能更好的進行乳酸發(fā)

26、酵，減少丙酮酸的積累；在本實驗中限食的作用使自由基減少，避免了線粒體膜損傷，使三 羧酸循環(huán)和呼吸鏈能有效的進行；在這種情況下不需要較多的乳酸發(fā)酵所以心臟LDH同功酶的組成出現(xiàn)了較多以 H亞基為主LD4； LD5 .在大腦中上述的現(xiàn)象并沒有發(fā)現(xiàn)-其原因可能與大腦中 LDH活性差異不明顯相似.另外通過對六張圖的比較發(fā)現(xiàn) ；在整個限食過程中無論在心臟還是在大腦 4 5月的同 功酶組成與其他幾個月明顯不同 心臟限食I組除外人第4 5月是小鼠進入衰老的階段.在第1-3 月生長過程中由于高代謝率而積累了一定的自由基從而破壞了有氧代謝的正常進行 -所以在后兩個月中LDH同功酶組成主要是以 M亞基為主，從而可

27、以進行更多的無氧代謝 ：對于第6月時LD4,LD5又出現(xiàn)的現(xiàn)象、除了誤差的因素外，更可能的是機體在衰老到一定程度時，其代謝率顯著降低.無氧代謝減少，值得思考的是限食II組與對照組在 LDH同功酶的組成上差異很少,這與LDH活性的變化一致，說明不同的限食方式有不同的抗衰老效果，這對我們今后在生活上的應用有很大的借鑒作用.致謝：感謝李政道先生能給我這樣的機會進行課題研究，整個實驗過程都是在黃偉達教授的悉心指導下完成的，在本論文的完成過程中，黃偉達教授廣博的知識，嚴謹?shù)闹螌W態(tài)度，敏銳的科學洞察力，腳踏實地的工作作風不僅對我 的科研工作而且對我的為人亦產生了巨大的影響；令我受益匪淺，另外本文的工作還得

28、到了實驗室許多老師、同學的無私關心和幫助、王維榮老師"江培紅老師、錢之康老師、閔太善老師.給予了我很多指點和幫助，研究生李明、 李寧軍、夏冠軍、李盛、徐劍鋒、萬凱、王奕然等同學也予以了極大的幫助和支持.在此一并謹致以感謝、Refere ncesf 1 ) Hayflick, L., Moorhead, P., 1966. The serial cultivation of human diploid cell strains.Exp Cell Res. 25, 585 - 621.f 2) K. Merker, A. Stolzing, T. Grune, Proteolysis,

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