微生物的純培養(yǎng)、分離純化和平板菌落計數(shù)法4頁

1、微生物的純培養(yǎng)、分離純化和平板菌落計數(shù)法姓名摘要：純培養(yǎng)技術(shù)是進行微生物學研究的基礎(chǔ)。從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。平板菌落計數(shù)法是一種應(yīng)用廣泛的測定微生物生長繁殖的方法，其特點是能測出微生物樣品中的活細胞數(shù)。本實驗通過稀釋涂布平板法和平板劃線分離法分離純化微生物以獲得純培養(yǎng)并進行平板菌落計數(shù)，旨在了解微生物的純培養(yǎng)含義和意義、熟練掌握倒平板的方法和幾種常用的分離純化微生物的基本操作技術(shù)、了解利用平板菌落計數(shù)法測定微生物樣品中活細胞的原理、學習平板菌落計數(shù)的操作步驟與方法。實驗結(jié)果表明，本實驗達到了預期的目的。關(guān)鍵詞：微生物的純培養(yǎng)、微生物的分

2、離與純化、平板菌落計數(shù)法1.引言自然界中各種微生物混雜生活在一起，即使取很少量的樣品也是許多微生物共存的群體。人們要研究某種微生物的特性，首先須使該微生物處于純培養(yǎng)狀態(tài)。也就是說培養(yǎng)物中所有細胞只是微生物的某一個種或株，它們有著共同的來源，是同一細胞的后代。只有純培養(yǎng)物才能提供可以重復的有意義的結(jié)果，純培養(yǎng)技術(shù)是進行微生物學研究的基礎(chǔ)。形狀穩(wěn)定的純培養(yǎng)（菌種）是微生物學工作最重要的基本要求，否則生產(chǎn)或科研都無法正常進行。從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。使用顯微操作器單細胞挑取法可以直接得到純培養(yǎng)。稀釋涂布平板法、稀釋混合平板法或平板劃線法是分離和

3、純化微生物的常規(guī)方法。后幾種方法不需要特殊的儀器設(shè)備，一般情況下都能順利進行，達到好的效果。常用的方法有：（1）簡易單細胞挑取法：它需要特制的顯微操縱器或其他顯微技術(shù)，因而其使用受到限制。簡易單孢子分離法是一種不需顯微單孢操作器，直接在普通顯微鏡下利用低倍鏡分離單孢子的方法。它采用很細的毛細管吸取較稀的萌發(fā)的孢子懸浮液滴在培養(yǎng)皿蓋的內(nèi)壁上，在低倍鏡下逐個檢查微滴。將只含有一個萌發(fā)孢子的微滴放一小塊營養(yǎng)瓊脂片，使其發(fā)育成微菌落。再將微菌落轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中，即可獲得僅由單個孢子發(fā)育而成的純培養(yǎng)。（2）平板分離法：微生物的平板分離純化技術(shù)自1880年Koch發(fā)明以來已有100多年的歷史。該方法操作簡便

4、，普遍用于微生物的分離與純化。該技術(shù)的建立和發(fā)展為人類獲得豐富的微生物資源以及在工、農(nóng)、醫(yī)、環(huán)境、動植物細胞培養(yǎng)等方面的應(yīng)用作出了巨大貢獻。由此可見，一項新的重大的微生物學實驗技術(shù)的建立會對整個生命科學帶來革命性的變化。隨著分子生物學的發(fā)展和學科的相互滲透，微生物的分離鑒定技術(shù)將獲得新的突破。目前發(fā)展的PCR、16S rRNA探針雜交技術(shù)、熒光抗體技術(shù)等已開始用于自然環(huán)境中某些特殊微生物的分離、鑒定，特別是對那些現(xiàn)在認為是非可培養(yǎng)的微生物。平板分離純化技術(shù)的基本原理包括兩方面：第一，選擇適合于待分離微生物的生長條件，如營養(yǎng)、酸堿度、溫度和氧等要求或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長，而抑制其

5、他微生物生長的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物。第二，微生物在固體培養(yǎng)基上生長形成的單個菌落可以是由一個細胞繁殖而成的集合體。因此可通過挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)。獲取單個菌落的方法可通過稀釋涂布平板或平板劃線等技術(shù)完成。值得指出的是從微生物群體中經(jīng)分離生長在平板上的單個菌落并不一定保證是純培養(yǎng)。因此，純培養(yǎng)的確定除觀察其菌落特征外，還要結(jié)合顯微鏡檢測個體形態(tài)特征后才能確定，有些微生物的純培養(yǎng)要經(jīng)過一系列的分離與純化過程和多種特征鑒定方能得到。平板菌落計數(shù)法是一種應(yīng)用廣泛的測定微生物生長繁殖的方法，適用于細菌、酵母等單細胞微生物以及放線菌和霉菌的孢子，其特點是能測出微生物樣品中的活細胞數(shù)。平板

6、菌落計數(shù)法是將待測樣品經(jīng)適當稀釋之后，其中的微生物充分分散成單個細胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過培養(yǎng)，由每個單細胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個單細胞。統(tǒng)計菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品的含菌數(shù)。但是，由于待測樣品往往不易完全分散成單個細胞，所以，長成的一個單菌落也可能來自樣品中的23或更多個細胞。因此平板菌落計數(shù)的結(jié)果往往偏低。為了清楚地闡述平板菌落計數(shù)的結(jié)果，我們常用菌落形成單位CFU來表示，由此得到的計數(shù)結(jié)果的單位是CFU/mL，而不以絕對菌落數(shù)來表示樣品的活菌含量。平板菌落計數(shù)法雖然操作較繁，結(jié)果需要培養(yǎng)一段時間才能取得，而且

7、測定結(jié)果易受多種因素的影響，但是由于該計數(shù)方法的最大優(yōu)點是可以獲得活菌的信息，所以被廣泛用于生物制品檢驗（如活菌制劑），以及食品、飲料和水（包括水源水）等的含菌指數(shù)或污染程度的檢測。2.材料和方法2.1 材料和試劑實驗菌種：大腸桿菌實驗培養(yǎng)基：150mL LB固體培養(yǎng)基實驗儀器：無菌玻璃涂棒、5支1mL無菌吸管、接種環(huán)、10套無菌培養(yǎng)皿、5支盛有4.5mL無菌水的試管、試管架、恒溫培養(yǎng)箱、酒精燈、高壓蒸汽滅菌鍋、火柴2.2 方法2.2.1稀釋涂布平板法（1）倒平板。將150mL LB固體培養(yǎng)基用滅菌鍋加熱融化（溶解保溫，溫度100，時間30min），之后冷卻至5560（不燙手為宜）。冷卻后分別

8、給6套無菌培養(yǎng)皿倒平板。倒平板的方法是：右手持盛LB培養(yǎng)基的三角瓶置酒精燈火焰旁邊，用左手將試管塞輕輕地拔出，試管口保持對著火焰；然后用右手手掌邊緣或小指與無名指夾住試管塞。左手拿培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒入培養(yǎng)基約15 mL，加蓋后輕輕搖動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后平置于桌面上10分鐘以上，待凝后即為平板。將平板標記分配（10-3、10-4、10-5的稀釋度各兩套培養(yǎng)皿）。（2）系列稀釋。取5支盛有4.5mL無菌水的試管，依次標記10-1、10-2、10-3、10-4、10-5。用1mL無菌吸管吸取0.5mL已充分混勻的大腸桿菌菌液（待測樣品）至10-1的試管中

9、，此即為10倍稀釋。將多余的菌液放回原菌液中。將10-1的試管振蕩使菌液充分混勻。另取一支1mL無菌吸管插入10-1的試管中來回吹吸菌懸液三次，進一步將菌體分散、混勻。用此吸管吸取10-1已充分混勻的菌液0.5mL于10-2的試管中，此即為100倍稀釋。該支無菌吸管放回封套中，并對應(yīng)著10-1試管。依次類推，直至最后用吸管吸取10-4菌液0.5mL已充分混勻的菌液于10-5的試管中，此即為105倍稀釋。（3）涂布。取6套LB培養(yǎng)基已經(jīng)凝固的無菌培養(yǎng)皿，分別用記號筆標明10-3、10-4、10-5（稀釋度，每個稀釋度各2套無菌培養(yǎng)皿），用剛才分別與10-3、10-4、10-5的試管對應(yīng)的無菌吸管

10、分別由10-3、10-4、10-5三管稀釋菌懸液中各吸取0.2mL，對號放入已寫好稀釋度的平板中。用無菌玻璃涂棒在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布均勻，將培養(yǎng)皿平放于實驗臺上室溫下靜置1015min，使菌液滲入培養(yǎng)基表層內(nèi)。平板涂布方法：將0.2 mL菌懸液小心地滴在平板培養(yǎng)基表面中央位置（0.2mL的菌液要全部滴在培養(yǎng)基上，若吸管尖端有剩余的菌液，需將吸管在培養(yǎng)基表面上輕輕地按一下便可）。右手拿無菌涂棒平放在平板培養(yǎng)基表面上，將菌液先沿一條直線輕輕地來回推動，使之分布均勻，然后改變方向沿另一垂直線來回推動，平板內(nèi)邊緣處可改變方向用涂棒再涂布幾次。（4）培養(yǎng)。將LB培養(yǎng)基平板倒置于37溫室中培養(yǎng)2448h

11、。（5）計數(shù)、計算。培養(yǎng)48h后，取出培養(yǎng)皿，首先確定培養(yǎng)皿合適的稀釋倍數(shù)D（-3、-4、-5），然后統(tǒng)計出某個稀釋度下幾個平板菌數(shù)的平均值X，依據(jù)平板上加入菌液量Y mL，得到樣品中菌數(shù)（CFU/mL）(X×D)/Y。（6）挑取單菌落。將培養(yǎng)后長出的單個菌落分別挑取少許細胞接種到上述三種培養(yǎng)基的斜面上，置于37的溫箱培養(yǎng)，待菌苔長出后，檢查其特征是否一致，同時將細胞涂片染色后用顯微鏡檢查是否為單一的微生物。若發(fā)現(xiàn)有雜菌，需再一次進行分離及培養(yǎng)，直至確證純培養(yǎng)。最后選擇合適的方法保存菌種。2.2.2平板劃線分離法（1）倒平板。按稀釋涂布平板法倒平板，得到3套LB固體培養(yǎng)基。（2）劃線

12、。在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，挑取大腸桿菌菌液一環(huán)在平板上劃線。劃線的方法很多，但無論采用哪種方法，其目的都是通過劃線將樣品在平板上進行稀釋，使之形成單個菌落。我們使用四分區(qū)劃線法，其接種步驟是：用接種環(huán)以無菌操作挑取大腸桿菌菌液一環(huán)，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第一次平板劃線34條，再轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿約70°角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過第一次劃線部分作第二次平行劃線，再用同樣的方法通過第二次劃線部分做第三次劃線和通過第三次平行劃線部分做第四次平行劃線。劃線完畢后，蓋上培養(yǎng)皿蓋，倒置于溫室培養(yǎng)。（3）挑取單菌落。同稀釋涂布平板法，進一步劃線分離及培養(yǎng)，檢測菌落純度，確證純培

13、養(yǎng)，選擇合適的方法保存菌種。2.2.3 陰性對照組取一個150mL LB固體培養(yǎng)基作為陰性對照組，不接種大腸桿菌菌懸液，培養(yǎng)方式等其他因素不變。3.結(jié)果圖1、圖2：用稀釋涂布平板法得到的10-3稀釋度的兩個大腸桿菌培養(yǎng)基圖3、圖4：用稀釋涂布平板法得到的10-4稀釋度的兩個大腸桿菌培養(yǎng)基圖5、圖6：用稀釋涂布平板法得到的10-5稀釋度的兩個大腸桿菌培養(yǎng)基圖7、圖8、圖9：用平板劃線分離法得到的大腸桿菌培養(yǎng)基圖10：陰性對照組，沒有接種大腸桿菌的LB固體培養(yǎng)基（1）用稀釋涂布平板法系列稀釋后可以得到單菌落（圖5、圖6），培養(yǎng)基涂布均勻，大腸桿菌菌落呈針尖狀，達到分離純化的目的，可以獲得純培養(yǎng)。（

14、2）用平板劃線分離法得到的三個培養(yǎng)基（圖7、圖8、圖9）均有單菌落，培養(yǎng)基涂布均勻，大腸桿菌菌落呈針尖狀，達到分離純化的目的，可以獲得純培養(yǎng)。（3）用稀釋涂布平板法得到的10-5稀釋度的兩個大腸桿菌菌落培養(yǎng)基中，菌落數(shù)分別是840和895。由此計算得到樣品中菌數(shù)（CFU/mL）（867.5×0.2）10-51.735×107。4.討論（1）用1mL無菌吸管吹吸菌液時不要太猛太快，吸時吸管伸入管底，吹時離開液面，以免將吸管中的過濾棉花浸濕或使試管內(nèi)液體外溢。（2）吸管尖在向盛有無菌水的試管里放菌液的時候不要碰到液面，而且每一支吸管只能接觸一個稀釋度的菌懸液。否則稀釋不精確，結(jié)

15、果誤差較大。（3）涂布平板用的菌液量一般以0.2mL較為適宜。如果過少，菌液不易涂布開；過多則在涂布完后或在培養(yǎng)時菌液仍會在平板表面流動，不易形成單菌落。（4）稀釋涂布平板法中利用試管稀釋的菌液一定要搖勻使細胞分散。（5）培養(yǎng)皿一般皿底標記，標記要簡單明了。需要標明操作者和組員、濃度、時間、菌樣、添加物等。（6）用無菌玻璃涂棒涂布培養(yǎng)基的順序是由低濃度向高濃度，即先涂布10-5稀釋度的培養(yǎng)基，再先涂布10-4稀釋度的培養(yǎng)基，最后涂布10-3稀釋度的培養(yǎng)基。（7）一般選擇每個平板上長有30300個菌落的稀釋度計算每毫升的含菌量較為合適。同一稀釋度的重復對照的菌落數(shù)不應(yīng)相差很大，否則實驗不精確。實際工作中同一稀釋度重復對照平板不能少于