尿中二氯甲烷的測定-氣相色譜法編制說明

1、衛(wèi)生標準制（修）訂項目編號：20192003尿中二氯甲烷的測定氣相色譜法（Determination of dichloromethane in UrineGas chromatography）編制說明（初稿）天津市疾病預(yù)防控制中心2020年 6 月 30 日1一、任務(wù)來源與項目編號、各起草單位和起草人承擔的工作、起草過程（一）任務(wù)來源與項目編號根據(jù)關(guān)于（國衛(wèi)辦法規(guī)綜標便函 2019 67 號），本項目由國家衛(wèi)生計生委法制司列入 2019 年衛(wèi)生標準制修訂計劃項目，項目名稱尿中二氯甲烷的測定 氣相色譜法，項目編號 20192003。（二）各起草單位和起草人承擔的工作天津市疾病預(yù)防控制中心承擔并

2、負責(zé)本標準的起草編制工作， 參加起草單位有江蘇省疾病預(yù)防控制中心、 深圳市職業(yè)病防治院、 深圳市龍崗區(qū)疾病預(yù)防控制中心。本標準主要起草人及分工如下：序號姓名性別職稱 /職務(wù)單位所承擔的工作1張 明男科主任 / 主任醫(yī)師天津市疾病預(yù)防控項目負責(zé)人、標制中心準編制2張萬超男科員 / 主管技師天津市疾病預(yù)防控實驗室檢測制中心3朱寶立男中心書記 / 主任醫(yī)江蘇省疾病預(yù)防控項目指導(dǎo)、咨詢師制中心4李小娟女科員 / 主任技師江蘇省疾病預(yù)防控方法驗證制中心5周 偉男科主任 / 副主任醫(yī)深圳市職業(yè)病防治現(xiàn)場調(diào)查師院6李添娣女科員 / 副主任技師深圳市職業(yè)病防治方法驗證院7于碧鯤男副主任醫(yī)師 / 科長深圳市龍崗

3、區(qū)疾病現(xiàn)場調(diào)查采樣預(yù)防控制中心8蔡志斌男主任技師 / 科長深圳市龍崗區(qū)疾病方法驗證預(yù)防控制中心9唐慧晶女科員/ 醫(yī)師天津市疾病預(yù)防控現(xiàn)場調(diào)查制中心10趙淑嵐女科主任 / 研究員天津市疾病預(yù)防控項目指導(dǎo)制中心11曾 強男副所長 / 主任醫(yī)師天津市疾病預(yù)防控項目咨詢制中心2（三）起草過程1. 前期基礎(chǔ)2013 至 2018 年，項目組前期通過查閱國內(nèi)外二氯甲烷相關(guān)文獻資料，獲取二氯甲烷（ Dichloromethane，二氯甲烷）的理化性質(zhì)、毒理學(xué)、代謝動力學(xué)、職業(yè)衛(wèi)生學(xué)資料， 以及國外對二氯甲烷規(guī)定的生物接觸限值及其制定依據(jù)，在獲取大量信息的基礎(chǔ)上，制定實施方案，并進行討論、修改。選擇華南某制膠

4、化工企業(yè)進行職業(yè)衛(wèi)生現(xiàn)場調(diào)查， 對作業(yè)場所空氣中二氯甲烷濃度和工人班末尿中二氯甲烷進行檢測； 并選擇健康人群進行非職業(yè)接觸流行病學(xué)調(diào)查，主要內(nèi)容包括人群健康狀況，并對外環(huán)境空氣中二氯甲烷濃度和健康人群尿中二氯甲烷進行檢測，采樣和檢測 方法 同上 ，提 出我 國二 氯甲烷生物接觸限值0.3mg/L ， 并經(jīng)GBZ2.1-2019 頒布。但目前與之相配套的尿中二氯甲烷測定方法相關(guān)標準尚未提出。2. 項目啟動為建立二氯甲烷相應(yīng)的生物監(jiān)測方法標準， 更客觀地監(jiān)測勞動者接觸二氯甲烷的水平，在上述研究基礎(chǔ)上，項目組啟動了尿中二氯甲烷測定方法的制定工作。項目組成員由天津市疾病預(yù)防控制中心、 江蘇省疾病預(yù)防控

5、制中心、 深圳市職業(yè)病防治院、深圳市龍崗區(qū)疾病預(yù)防控制中心相關(guān)專業(yè)技術(shù)人員組成， 天津市疾病預(yù)防控制中心為項目主承擔單位， 項目負責(zé)人為天津市疾病預(yù)防控制中心張明主任醫(yī)師，江蘇省疾病預(yù)防控制中心、 深圳市職業(yè)病防治院、 深圳市龍崗區(qū)疾病預(yù)防控制中心為方法驗證單位。 2019 年 10 月底啟動標準編制起草工作，確定尿中二氯甲烷的測定 氣相色譜法編制起草框架，起草小組對標準相關(guān)技術(shù)材料進行整理，并確定編制起草方案。3. 工作進程（1）標準方法的建立2019 年 9 月 2019 年 10 月主承擔單位天津市疾病預(yù)防控制中心根據(jù)GBZ/T210.5-2008職業(yè)衛(wèi)生標準制定指南第 5 部分：生物材

6、料中化學(xué)物質(zhì)測定方法的技術(shù)要求，在前期研究工作，通過對樣品采集與處理、色譜條件、檢測3參數(shù)的選擇與確定、標準曲線繪制、方法的線性范圍及檢出限、頂空溫度、時間的選擇、無水硫酸鈉加入量試驗、樣品體積選擇、方法精密度和準確度試驗、萃取效率、穩(wěn)定性試驗、干擾實驗、現(xiàn)場驗證等對該方法進行評估，建立尿中二氯甲烷的氣相色譜法。（2）方法驗證2019 年 11 月 2020 年 3 月項目參與單位江蘇省疾病預(yù)防控制中心、深圳市職業(yè)病防治院、深圳市龍崗區(qū)疾病預(yù)防控制中心根據(jù)GBZ/T210.5-2008職業(yè)衛(wèi)生標準制定指南第 5 部分：生物材料中化學(xué)物質(zhì)測定方法的要求，對本方法進行驗證，出具標準方法驗證報告。4

7、. 文本修改過程（1）起草初稿。2020 年 4 月在項目組上述工作基礎(chǔ)上，通過對標準研究資料的整理、歸納和分析，形成標準框架，起草標準文本初稿及編制說明。（3）專家討論。2020 年 5 月項目組專家通過電話、網(wǎng)絡(luò)視頻等方法，對標準初稿進行了討論與修改，形成標準征求意見稿。（4）社會征求意見2020 年 6 月 2020 年 9 月，項目組向職業(yè)衛(wèi)生行政管理部門、職業(yè)衛(wèi)生監(jiān)督機構(gòu)、職業(yè)衛(wèi)生檢驗機構(gòu)的專家和監(jiān)管人員以及和二氯甲烷生產(chǎn)及使用企業(yè)征求意見，共計發(fā)出征求意見函xx 份，收回 xx 份。 2013 年 1 月上旬、下旬在南京先后召開了 2 次標準研討會，對函審專家和有關(guān)單位對81 個標

8、準條目共計147條意見和建議進行了逐條分析、討論，形成標準送審稿。2020 年 7 月起本標準征求意見稿在衛(wèi)生健康標準網(wǎng)向全國廣泛征求意見，截止 2020 年 XXX 月未收到反饋的修改意見和建議。（4）社會意見研究處理過程和結(jié)果。（5）標委會委員意見及處理情況。（6）標委會預(yù)審會議意見及處理情況。4（7）研制過程中所做的重大修改和調(diào)整。（8）標準審查結(jié)果及審查意見處理情況。5. 項目完成情況（以完成報批稿發(fā)送秘書處并在系統(tǒng)上提交為最后完成節(jié)點）。二、與相關(guān)規(guī)范性文件和其他標準的關(guān)系本標準屬于職業(yè)健康限值標準， 為職業(yè)接觸二氯甲烷的生物接觸限值 的配套方法標準，是職業(yè)衛(wèi)生標準的重要組成部分。三

9、、國外相關(guān)規(guī)定和標準情況的對比說明美國 ACGIH 推薦二氯甲烷的生物接觸指數(shù) （biological exposure index ，BEI）班后尿為 0.3 mg/L 二氯甲烷，這個值的基礎(chǔ)是 ACGIH 的工作場所 8 小時接觸 TLV-TWA 177mg/m 3（50 ppm），與我國目前規(guī)定工作場所空氣中二氯甲烷的 8小時時間加權(quán)平均容許濃度（ PC-TWA ）200 mg/m3（56.5 ppm）大致相當，本研究團隊前期已制定二氯甲烷生物接觸限值，提出我國二氯甲烷的生物接觸限值0.3mg/L，但目前尿中二氯甲烷測定方法相關(guān)標準尚未提出。本次申報檢測方法標準為職業(yè)接觸二氯甲烷的生物接

10、觸限值的配套方法標準， 是職業(yè)健康標準的重要組成部分。四、各項技術(shù)內(nèi)容的依據(jù)（一）原理與方法1. 原理尿中二氯甲烷經(jīng)頂空氣相萃取預(yù)處理分離后， 由填充柱分析， 氫火焰離子化檢測器（ FID）檢測，以保留時間定性，峰高或峰面積定量。2. 儀器與試劑日本島津 GC-14C 型氣相色譜儀，火焰離子化檢測器 (FID)、化學(xué)工作站軟件； FFAP 填充柱；恒溫水箱； 1ml 注射器等。 DCM(99.9% ，美國 Sigma-Aldrich公司 )；去離子水；無水硫酸鈉等。DCM 標準貯備液：準確量取10L色譜純級二氯甲烷于100ml 去離 子水定容好的 容量 瓶中 ，充分混 勻， 此溶 液為5132

11、.6 g/ml二氯甲烷標準儲備液。 DCM 標準應(yīng)用液：取標準貯備液10ml 于 100ml 容量瓶中，用去離子水稀釋至刻度，為13.26 g/ml的標準應(yīng)用液。3. 尿樣的采集和處理在清潔無污染的場所，用聚乙烯采尿瓶采集工人尿液，每批取2-3 個采尿瓶作為樣品空白。在收集過程中避免尿樣多次轉(zhuǎn)移和外來物的污染，50ml 尿樣中加 12 滴濃鹽酸，樣品置于清潔容器冷藏運輸。 準確量取 7ml 尿樣于 20ml 頂空瓶中，加入 6g 無水硫酸鈉，蓋緊密封，搖勻，蓋好，放置于 60恒溫保溫箱30 分鐘，待體系平衡后，用注射器準確抽取頂空瓶頂部1ml 氣體，迅速注入到GC 汽化室，經(jīng)填充柱分析，F(xiàn)ID

12、 檢測器檢測，以保留時間定性，峰面積定量。4. 色譜條件柱溫 80；汽化室： 150；檢測器： 200；在 0.1Mpa 下， N2 作為載氣。5. 標準曲線繪制取 5 只具塞比色管，分別加入用空白尿液將二氯甲烷應(yīng)用液梯度稀釋成0.0mg/l， 0.166mg/l，0.332mg/l，0.663mg/l， 1.326mg/l 的標準系列。按樣品處理方式，參照儀器操作條件，將氣相色譜儀調(diào)節(jié)至最佳測定狀態(tài)，測定標準系列，每個濃度重復(fù)測定3 次，以峰面積均值對DCM 濃度繪制標準曲線，見圖1。圖 1尿中二氯甲烷檢測的標準曲線66. 樣品測定使用 1ml 注射器進行手動進樣， 根據(jù)測得的峰面積從標準曲

13、線中查出樣品中DCM 的濃度。7. 頂空溫度的選擇配制一定二氯甲烷濃度的尿樣， 準確量取 7ml 尿樣到頂空瓶中，加入 6g 無水硫酸鈉鹽，蓋緊，搖勻，分別在 20，30 ，40，50，60，70，80下，水浴 30min，在相同色譜條件下進樣分析，當平衡溫度為 60 ，氣相中二氯甲烷含量最高，測定結(jié)果見圖 2。圖 2溫度對二氯甲烷提取效果的影響8. 頂空時間的選擇同樣用空白尿液稀釋二氯甲烷標準儲備液，配制成一定濃度二氯甲烷應(yīng)用尿液，在每只頂空瓶中都準確量取7ml 該應(yīng)用液，并加入6g 無水硫酸鈉鹽，蓋緊瓶塞，搖勻后，在 60恒溫水浴鍋中， 萃取不同時間（ 5min，10min，15min，2

14、0min，25min， 30min，35min），在該實驗的色譜條件下分析測定，隨著水浴時間的不斷延長，氣相萃取的二氯甲烷含量穩(wěn)定增加，在水浴時間30min 后，氣液兩相達到平衡，結(jié)果見圖3。7圖 3 時間對二氯甲烷提取效果的影響9. 無水硫酸鈉加入量試驗取相同體積相同濃度的二氯甲烷尿樣， 分別加入不同質(zhì)量的無水硫酸鈉， 在60恒溫水浴鍋中， 萃取 30min，在該實驗的色譜條件下分析測定， 由結(jié)果可見 ,無水硫酸鈉鹽對尿液中二氯甲烷的鹽析作用是明顯的（見圖4）。圖 4 無水硫酸鈉對二氯甲烷提取效果的影響10. 樣品體積選擇本實驗采用20ml 頂空瓶，瓶內(nèi)分別裝事先配好的2.652mg/L 二

15、氯甲烷溶液 1,3,5,7,10ml，制成不同的體積比的樣品各三份， 每份加入 6g 無水硫酸鈉， 蓋緊，搖勻后，在 60 恒溫保溫 30min，在本實驗條件下進行色譜分析，結(jié)果見圖 5。當 20ml 的頂空瓶中，尿液體積為 7ml 時，易揮發(fā)的二氯甲烷蒸氣在氣相中的分配系數(shù)最大。8圖 5 樣品體積對二氯甲烷提取效果的影響11. 方法的線性范圍和檢出限按標準方法配制標準系列， 每個濃度測定 3 次，取其均值， 以峰面積均值對 DCM 濃度（ mg/ml ）進行線性回歸分析，得出回歸方程為：，r=0.9995，根據(jù)標準差法計算檢出限為： 0.01 mg/ml。12. 精密度和準確度試驗、萃取效率

16、分別取 DCM 三種濃度的樣品，3 天內(nèi)重復(fù)測定 6 次，計算測定結(jié)果平均值，標準差及變異系數(shù) (RSD)，結(jié)果表明，此低、中、高三種濃度的各 6 次測定結(jié)果精密度分別為 9.06%、3.65%、5.77%，均小于 10%。結(jié)果見表 1。表 1樣品精確度實驗結(jié)果加標值日內(nèi)精密度RSD日間精密度RSD（ g）(mean±SD)（% ）(mean±SD)（ %）0.20.134± 0.0085.970.132± 0.0129.060.70.709± 0.0324.510.712± 0.0263.651.21.143± 0.054

17、4.721.143± 0.0665.77準確度試驗采用加標回收法， 向樣品中分別加入低、 中、高不同含量的DCM標準溶液，每個濃度測定 6 次，以測定結(jié)果同加標含量計算回收率分別為78.6%、79.6%、87.3%，結(jié)果均在 75-105%允許范圍之間。結(jié)果見表2。表 2樣品準確度實驗結(jié)果加標值實測值平均實測值平均加標率( g)123456(mean ± SD)(%)0.150.1200.1120.1210.1230.1140.1160.118 ± 0.00478.6%90.30.2410.2440.2380.2310.2330.2450.239± 0.

18、00679.6%0.60.5330.5210.5270.5250.5150.5230.524± 0.00687.3%萃取效率試驗同樣品回收率試驗，結(jié)果大于75%，在允許范圍之內(nèi)。13. 穩(wěn)定性試驗穩(wěn)定性試驗：取空白尿液加入DCM 標準溶液配制成一定濃度的樣品，分成4 組，每組 6 個樣品，當天測定1 組，其余 -20冰箱保存，于第3、7、14 天各測定 1 組。以當天結(jié)果為100%，計算不同天數(shù)的樣品損失率。由結(jié)果得出，樣品在 -20冰箱中保存，建議樣品盡量在2 周內(nèi)測定，結(jié)果見表3。表 3樣品穩(wěn)定性實驗結(jié)果放置時間樣品數(shù)實測含量 (x ±s，ng/ml)損失率 (%)第 1 d60.613 ±0.0340第 3 d60.598 ±0.0222.45%第 7 d60.595 ±0.0072.94%第 14 d60.545 ±0.01911.09%14. 干擾實驗取 3 名沒接觸過二氯甲烷的員工尿樣