第一章酶工程

1、 酶酶 工工 程程 ENZYME ENGINEERINGENZYME ENGINEERING 主主 編：陳編：陳 守守 文文v教材和教學(xué)參考書v教材：教材：酶工程酶工程（第二版）（第二版）v陳守文編著陳守文編著v科學(xué)出版社科學(xué)出版社v2015v教材和教學(xué)參考書教學(xué)參考書教學(xué)參考書v酶工程酶工程（第三版），郭勇，（第三版），郭勇，科學(xué)出版社，科學(xué)出版社，2009v現(xiàn)代酶學(xué)現(xiàn)代酶學(xué)（第二版），袁勤（第二版），袁勤生，華東理工大學(xué)出版社，生，華東理工大學(xué)出版社，2001v酶學(xué)原理與酶工程酶學(xué)原理與酶工程，周曉云，周曉云，中國輕工業(yè)出版社，中國輕工業(yè)出版社，2007v酶工程酶工程（第二版）（第二版），

2、羅貴民，羅貴民，化學(xué)工業(yè)出版社，化學(xué)工業(yè)出版社，2008v課程主要內(nèi)容酶工程（第一章）酶的生產(chǎn)v酶的發(fā)酵（第二章）v酶的分離工程（第三章）酶的改性v固定化酶與固定化細(xì)胞（第四章）v化學(xué)酶工程（第五章）v生物酶工程（第六章）v非水相酶催化（第七章）酶的應(yīng)用v酶反應(yīng)器和酶傳感器（第八章）v酶及酶制劑的應(yīng)用（第九章）v教學(xué)目的和要求以酶學(xué)的內(nèi)容為基礎(chǔ)，酶的工程應(yīng)用為主，融入各章節(jié)內(nèi)容中通過本課程的學(xué)習(xí)，要求系統(tǒng)地掌握酶的生產(chǎn)、改性與應(yīng)用的技術(shù)過程理解和掌握酶工程的主要理論、概念，掌握酶工程的研究方法，熟悉工程應(yīng)用了解相關(guān)的新進(jìn)展v考核方式期末筆試（閉卷）70分， 實(shí)驗(yàn)：20分，平時成績：10分酶酶

3、工工 程程Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第一節(jié)：酶工程概述第一節(jié)：酶工程概述第二節(jié)：酶的催化特點(diǎn)以及影響因素第二節(jié)：酶的催化特點(diǎn)以及影響因素第三節(jié)：酶的活力測定第三節(jié)：酶的活力測定第四節(jié)：酶反應(yīng)動力學(xué)第四節(jié)：酶反應(yīng)動力學(xué) 第一章第一章 酶工程酶工程酶及酶工程的研究意義酶酶- -是具有特殊作用的是具有特殊作用的蛋白蛋白質(zhì)質(zhì)， 能夠在生命體內(nèi)能夠在生命體內(nèi)（包括（包括動物、植物和微生物）動物、植物和微生物）催化催化化學(xué)反應(yīng)，維持生命特征?；瘜W(xué)反應(yīng)，維持生命特征。生物技術(shù)生物技術(shù)基因工程基因工程發(fā)酵工程發(fā)酵工程細(xì)胞工程細(xì)胞工程酶工程酶工程：酶的生產(chǎn)和應(yīng)用的技

4、術(shù)過程酶的生產(chǎn)和應(yīng)用的技術(shù)過程在在食品、輕工、醫(yī)藥、化工、能源、環(huán)保、科研等領(lǐng)域食品、輕工、醫(yī)藥、化工、能源、環(huán)保、科研等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。得到廣泛的應(yīng)用。催化效率高催化效率高專一性強(qiáng)專一性強(qiáng)反應(yīng)條件溫和反應(yīng)條件溫和：基因拼接技術(shù)和基因拼接技術(shù)和DNA重組技術(shù)重組技術(shù)：改變生物的結(jié)構(gòu)和功能改變生物的結(jié)構(gòu)和功能：把微生物應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)過程把微生物應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)過程酶工程酶工程利用酶或細(xì)胞的催化作用，在特定的生物反應(yīng)器，將原料轉(zhuǎn)利用酶或細(xì)胞的催化作用，在特定的生物反應(yīng)器，將原料轉(zhuǎn)化成所需的產(chǎn)品并應(yīng)用于社會生活的一門科學(xué)技術(shù)?；伤璧漠a(chǎn)品并應(yīng)用于社會生活的一門科學(xué)技術(shù)。酶及酶工程的研究意義酶的研

5、究簡史最早最早4000年前的夏禹時代年前的夏禹時代釀酒技術(shù)釀酒技術(shù)公元前公元前10世紀(jì)世紀(jì)豆醬的制作豆醬的制作2700年前的周代年前的周代利用麥芽制麥芽糖利用麥芽制麥芽糖2500年前年前利用酒曲治療消化疾病利用酒曲治療消化疾病春秋戰(zhàn)國時期春秋戰(zhàn)國時期漆酶制作油漆漆酶制作油漆 中國古代中國古代 最早最早60006000年前年前古巴比古巴比倫人利用麥芽釀酒倫人利用麥芽釀酒 古埃及時代古埃及時代酵母發(fā)酵面包酵母發(fā)酵面包磨粉、去糠、打碎磨粉、去糠、打碎麥芽萌發(fā)、浸潤麥芽萌發(fā)、浸潤成酒發(fā)酵、裝瓶成酒發(fā)酵、裝瓶酶的研究簡史古巴比倫人古巴比倫人巴斯德巴斯德微生物學(xué)的奠基人微生物學(xué)的奠基人李比希李比希有機(jī)化學(xué)

6、創(chuàng)始人有機(jī)化學(xué)創(chuàng)始人發(fā)酵與活細(xì)胞有關(guān)，發(fā)酵與活細(xì)胞有關(guān)，發(fā)酵是整個細(xì)胞而不發(fā)酵是整個細(xì)胞而不是細(xì)胞中的某些物質(zhì)是細(xì)胞中的某些物質(zhì)在起作用在起作用發(fā)酵是細(xì)胞中的某些物發(fā)酵是細(xì)胞中的某些物質(zhì)起作用，這些物質(zhì)只質(zhì)起作用，這些物質(zhì)只有在酵母細(xì)胞死亡裂解有在酵母細(xì)胞死亡裂解釋放之后才能發(fā)揮作用釋放之后才能發(fā)揮作用巴斯德和李比希的論戰(zhàn)巴斯德和李比希的論戰(zhàn)1833 帕耶恩和珀索茲從大麥芽中分離出淀粉酶帕耶恩和珀索茲從大麥芽中分離出淀粉酶Monod用酒精處理麥芽水抽提液，得到白色無定形粉用酒精處理麥芽水抽提液，得到白色無定形粉 末，命名為末，命名為diastase“變構(gòu)模型變構(gòu)模型”，定量解釋某些酶活性可以通

7、過，定量解釋某些酶活性可以通過與效應(yīng)物結(jié)合進(jìn)行調(diào)節(jié)，揭示了酶的調(diào)控作用與效應(yīng)物結(jié)合進(jìn)行調(diào)節(jié)，揭示了酶的調(diào)控作用 1961 莫諾提出莫諾提出“變構(gòu)模型變構(gòu)模型”Payen酶的研究簡史 近代近代 酶作用學(xué)說的提出酶作用學(xué)說的提出 1894年，年，Emil Fisher 鎖鑰學(xué)說鎖鑰學(xué)說 酶分子和底物在結(jié)構(gòu)上需有嚴(yán)格的互補(bǔ)關(guān)系酶分子和底物在結(jié)構(gòu)上需有嚴(yán)格的互補(bǔ)關(guān)系 底物須契合到酶活性中心，如鑰匙插入鎖中底物須契合到酶活性中心，如鑰匙插入鎖中Emil Fisher酶的研究簡史1913 米徹利斯和曼吞建立米氏方程。米徹利斯和曼吞建立米氏方程。 從刀豆種子里分離出一種純結(jié)晶體從刀豆種子里分離出一種純結(jié)晶體

8、,然后把結(jié)晶體然后把結(jié)晶體放進(jìn)人尿中放進(jìn)人尿中,這時人尿素便很快就分解成了二氧化這時人尿素便很快就分解成了二氧化碳和氨碳和氨.薩姆納發(fā)現(xiàn)薩姆納發(fā)現(xiàn),它的作用和脲酶一樣它的作用和脲酶一樣.經(jīng)進(jìn)一步經(jīng)進(jìn)一步分析分析,證明這種結(jié)晶體就是脲酶證明這種結(jié)晶體就是脲酶.最后最后,薩姆納證明脲薩姆納證明脲酶確實(shí)是一種蛋白質(zhì)酶確實(shí)是一種蛋白質(zhì)酶的研究簡史 1926 薩姆納得到尿酶結(jié)晶，證實(shí)酶的蛋白質(zhì)本質(zhì)薩姆納得到尿酶結(jié)晶，證實(shí)酶的蛋白質(zhì)本質(zhì) 近代近代 酶的本質(zhì)和結(jié)構(gòu)研究酶的本質(zhì)和結(jié)構(gòu)研究 1926年，年，J. Sumner 從刀豆中提取脲酶（從刀豆中提取脲酶（urease），首次獲），首次獲得酶的結(jié)晶體得酶的

9、結(jié)晶體 1937年又獲得過氧化氫酶結(jié)晶年又獲得過氧化氫酶結(jié)晶 證實(shí)了酶是蛋白質(zhì)證實(shí)了酶是蛋白質(zhì) 獲得獲得1946年諾貝爾化學(xué)獎年諾貝爾化學(xué)獎H2NNH2OH2OUrease2NH3CO2+酶的研究簡史 現(xiàn)代酶學(xué)現(xiàn)代酶學(xué) 快速發(fā)展時期快速發(fā)展時期 核酸類酶（核酸類酶（Ribozyme）的發(fā)現(xiàn)）的發(fā)現(xiàn)1982年，年，Cech發(fā)現(xiàn)四膜蟲發(fā)現(xiàn)四膜蟲（Tetrahymena）的）的26S rRNA前體在完前體在完全沒有蛋白質(zhì)的情況下進(jìn)行自我加工，催全沒有蛋白質(zhì)的情況下進(jìn)行自我加工，催化得成熟的化得成熟的rRNA酶的研究簡史Enzyme EngineeringEnzyme Engineering酶工程發(fā)展

10、概況酶工程開始于人類有意識地去生產(chǎn)酶和酶制劑，并進(jìn)行酶工程開始于人類有意識地去生產(chǎn)酶和酶制劑，并進(jìn)行工業(yè)應(yīng)用工業(yè)應(yīng)用1894年，年，Takamine Joichi（高峰讓吉）（高峰讓吉）利用米霉菌固體培養(yǎng)法生產(chǎn)利用米霉菌固體培養(yǎng)法生產(chǎn)Taka淀粉酶淀粉酶（第一個商品酶制劑第一個商品酶制劑），），并并用作消化劑，開創(chuàng)了酶生產(chǎn)和應(yīng)用的先例，用作消化劑，開創(chuàng)了酶生產(chǎn)和應(yīng)用的先例，其方法至今仍被采用其方法至今仍被采用1908年，胰酶年，胰酶 皮革的軟化皮革的軟化1908年，細(xì)菌淀粉酶年，細(xì)菌淀粉酶 紡織品褪漿紡織品褪漿1911年，木瓜蛋白酶年，木瓜蛋白酶 啤酒的澄清啤酒的澄清Enzyme Engine

11、eringEnzyme Engineering酶工程發(fā)展概況酶生產(chǎn)方法的突破加速了酶工程的發(fā)展酶生產(chǎn)方法的突破加速了酶工程的發(fā)展從天然生物提取從天然生物提取 生物發(fā)酵生產(chǎn)生物發(fā)酵生產(chǎn) 質(zhì)的飛躍質(zhì)的飛躍1949年，微生物液體深層發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌年，微生物液體深層發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌 -淀粉酶淀粉酶1960年，操縱子學(xué)說年，操縱子學(xué)說 酶生物合成的調(diào)控酶生物合成的調(diào)控 揭示酶合成機(jī)制揭示酶合成機(jī)制1980s，動植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，動植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 擴(kuò)展了酶的來源擴(kuò)展了酶的來源Enzyme EngineeringEnzyme Engineering酶工程發(fā)展概況酶的改性和固定化技術(shù)是酶工程發(fā)展的里程碑酶的改性和

12、固定化技術(shù)是酶工程發(fā)展的里程碑最早的固定化酶最早的固定化酶 1916年，發(fā)現(xiàn)吸附在骨碳上的蔗糖酶仍顯年，發(fā)現(xiàn)吸附在骨碳上的蔗糖酶仍顯示催化活力示催化活力 物理法物理法1953年，用重氮化聚氨基苯乙烯樹脂共價結(jié)合水解酶年，用重氮化聚氨基苯乙烯樹脂共價結(jié)合水解酶 化學(xué)法化學(xué)法1969年，固定化酶的工業(yè)應(yīng)用年，固定化酶的工業(yè)應(yīng)用 氨基?；覆鸱职被；覆鸱諨L-氨基酸氨基酸生產(chǎn)生產(chǎn)L-氨基酸氨基酸1971年，第一屆國際酶工程學(xué)術(shù)會議在美國召開年，第一屆國際酶工程學(xué)術(shù)會議在美國召開1973年，以年，以E. coli 為載體固定天冬氨酸酶生產(chǎn)為載體固定天冬氨酸酶生產(chǎn)L-天冬氨酸天冬氨酸1978年，固定

13、化細(xì)胞生產(chǎn)年，固定化細(xì)胞生產(chǎn) -淀粉酶淀粉酶1980s中期，開發(fā)了固定化原生質(zhì)體技術(shù)中期，開發(fā)了固定化原生質(zhì)體技術(shù)Enzyme EngineeringEnzyme Engineering酶的催化特點(diǎn)及影響因素酶的催化特點(diǎn)酶的催化特點(diǎn)1. 極高的催化效率極高的催化效率酶的催化速率是沒有催化劑催化的化學(xué)反應(yīng)速率的酶的催化速率是沒有催化劑催化的化學(xué)反應(yīng)速率的10121020倍，倍，比一般催化劑催化反應(yīng)的速率高比一般催化劑催化反應(yīng)的速率高1071013倍。倍。例如：例如：H2O2 的分解反應(yīng)的分解反應(yīng)Fe3+ 催化，效率為催化，效率為 610-4 mol/(mols)過氧化氫酶催化，效率為過氧化氫酶催

14、化，效率為 6106 mol/(mols)過氧化氫酶將過氧化氫酶將 H2O2 分解反應(yīng)的活化能從分解反應(yīng)的活化能從 75.24 kJmol-1 降低到降低到8.36 kJmol-1 CatalystCatalyst1 12 222222222H O H O + OH O H O + Ov酶催化作用的特點(diǎn)酶催化作用的特點(diǎn)酶催化作用效率高酶催化作用效率高v酶與非酶催化時所需酶與非酶催化時所需的活化能示意圖的活化能示意圖v圖中酶催化反應(yīng)和非圖中酶催化反應(yīng)和非酶催化反應(yīng)的活化能酶催化反應(yīng)的活化能差異顯著差異顯著非酶催化反應(yīng)非酶催化反應(yīng)酶催化反應(yīng)酶催化反應(yīng)活化能活化能反應(yīng)過程反應(yīng)過程 酶的催化特點(diǎn)及影響

15、因素v酶的催化特點(diǎn)酶的催化特點(diǎn) 2. 高度的專一性高度的專一性絕對專一性：只作用于一種底物；絕對專一性：只作用于一種底物；相對專一性：作用于一類化合物或一類化學(xué)鍵；相對專一性：作用于一類化合物或一類化學(xué)鍵；立體異構(gòu)專一性：旋光異構(gòu)專一性、幾何異構(gòu)專一性立體異構(gòu)專一性：旋光異構(gòu)專一性、幾何異構(gòu)專一性Enzyme EngineeringEnzyme Engineering酶催化作用的特點(diǎn)酶催化作用專一性的相關(guān)學(xué)說酶催化作用專一性的相關(guān)學(xué)說“三點(diǎn)結(jié)合三點(diǎn)結(jié)合”的催化理論的催化理論酶與底物的結(jié)合處至少有三個點(diǎn)，而且只有一種情況是完全結(jié)合的酶與底物的結(jié)合處至少有三個點(diǎn)，而且只有一種情況是完全結(jié)合的形式。

16、只有這種情況下，不對稱催化作用才能實(shí)現(xiàn)形式。只有這種情況下，不對稱催化作用才能實(shí)現(xiàn)EnzymeEnzymeEnzyme EngineeringEnzyme Engineering酶催化作用的特點(diǎn)酶催化作用專一性的相關(guān)學(xué)說酶催化作用專一性的相關(guān)學(xué)說鎖鑰學(xué)說鎖鑰學(xué)說整個酶分子的天然構(gòu)象是整個酶分子的天然構(gòu)象是的，酶表面具有特定的形狀的，酶表面具有特定的形狀酶與底物的結(jié)合，如同一把酶與底物的結(jié)合，如同一把“鑰匙鑰匙”對一把對一把“鎖鎖”一樣一樣EnzymeEnzymeSubstrate do not matchthe binding siteSubstrate can matchthe bindin

17、g siteEnzyme EngineeringEnzyme Engineering酶催化作用的特點(diǎn)酶催化作用專一性的相關(guān)學(xué)說酶催化作用專一性的相關(guān)學(xué)說誘導(dǎo)契合學(xué)說誘導(dǎo)契合學(xué)說該學(xué)說認(rèn)為酶表面并沒有一種與底物互補(bǔ)的固定形狀，而只是由于該學(xué)說認(rèn)為酶表面并沒有一種與底物互補(bǔ)的固定形狀，而只是由于底物的誘導(dǎo)才形成了互補(bǔ)形狀底物的誘導(dǎo)才形成了互補(bǔ)形狀EnzymeEnzyme+SubstrateProduct-1Product-2Transition stateconformation3. 活性的可調(diào)節(jié)性活性的可調(diào)節(jié)性4. 活性的不穩(wěn)定性活性的不穩(wěn)定性酶促反應(yīng)受一系列外界理化性質(zhì)的影響，如：酶促反應(yīng)受一

18、系列外界理化性質(zhì)的影響，如：底物濃度及酶與底物的相對濃度；底物濃度及酶與底物的相對濃度；溫度；溫度； pH值；值；激活劑；激活劑； 抑制劑；抑制劑；強(qiáng)酸強(qiáng)酸/強(qiáng)堿；強(qiáng)堿； 重金屬鹽；重金屬鹽；紫外線紫外線酶活性調(diào)控酶活性調(diào)控酶含量調(diào)控酶含量調(diào)控 酶的催化特點(diǎn)及影響因素酶的催化特點(diǎn)酶的催化特點(diǎn) 影響酶催化作用的因素影響酶催化作用的因素1. 底物濃度的影響底物濃度的影響 SVmaxKm1/2Vmax矩形雙曲線：一級反應(yīng)；混合反應(yīng)；零級矩形雙曲線：一級反應(yīng)；混合反應(yīng)；零級反應(yīng)。反應(yīng)。底物抑制：有些酶在高底物濃度下，速度底物抑制：有些酶在高底物濃度下，速度沒有維持較高水平，反而下降的現(xiàn)象沒有維持較高水

19、平，反而下降的現(xiàn)象 酶的催化特點(diǎn)及影響因素3. 酶濃度的影響酶濃度的影響 = E 底物濃度夠高的條件下，酶催化反應(yīng)速度與酶濃度成正比。底物濃度夠高的條件下，酶催化反應(yīng)速度與酶濃度成正比。2. 產(chǎn)物濃度的影響產(chǎn)物濃度的影響 反饋調(diào)節(jié)作用：許多代謝途徑的中間產(chǎn)物或終產(chǎn)物反饋調(diào)節(jié)作用：許多代謝途徑的中間產(chǎn)物或終產(chǎn)物 是酶的變構(gòu)劑，使酶變構(gòu)從而影響其反應(yīng)速度。是酶的變構(gòu)劑，使酶變構(gòu)從而影響其反應(yīng)速度。影響酶催化作用的因素影響酶催化作用的因素 酶的催化特點(diǎn)及影響因素4. 溫度的影響溫度的影響 溫度，t（溫度，t（）酶酶催化反應(yīng)速度,V催化反應(yīng)速度,V0 0（ M/min）在一定溫度范圍內(nèi)，反應(yīng)速度隨溫度

20、升在一定溫度范圍內(nèi)，反應(yīng)速度隨溫度升高而加快。高而加快。超過一定范圍，溫度的升高導(dǎo)致酶三維超過一定范圍，溫度的升高導(dǎo)致酶三維結(jié)構(gòu)的變化，甚至變性，催化活性下降結(jié)構(gòu)的變化，甚至變性，催化活性下降5. pH的影響的影響T (pH)影響酶催化作用的因素影響酶催化作用的因素 酶的催化特點(diǎn)及影響因素當(dāng)酶分子處于最適當(dāng)酶分子處于最適pH值反應(yīng)介質(zhì)中時，使酶值反應(yīng)介質(zhì)中時，使酶促反應(yīng)速度達(dá)到最大值。促反應(yīng)速度達(dá)到最大值。6. 抑制劑抑制劑(inhibitor)的影響的影響凡能降低酶催化反應(yīng)速率的物質(zhì)都稱之為抑制劑凡能降低酶催化反應(yīng)速率的物質(zhì)都稱之為抑制劑抑制劑與酶的必需基團(tuán)（包括活性基團(tuán)及輔基）結(jié)合，改變抑

21、制劑與酶的必需基團(tuán)（包括活性基團(tuán)及輔基）結(jié)合，改變 其結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，引起酶反應(yīng)速率下降其結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，引起酶反應(yīng)速率下降抑制劑對酶有選擇性，不包括酶蛋白的水解及變性失活作用抑制劑對酶有選擇性，不包括酶蛋白的水解及變性失活作用影響酶催化作用的因素影響酶催化作用的因素 酶的催化特點(diǎn)及影響因素7. 激活劑激活劑(activator)的影響的影響（1）無機(jī)離子激活劑：）無機(jī)離子激活劑：ClCl- -,Br,Br- -,I,I- -,Zn,Zn2+2+,Mg,Mg2+2+,Ca,Ca2+2+,Na,Na+ +（2）小分子有機(jī)化合物：）小分子有機(jī)化合物：抗壞血酸，半胱氨酸，谷胱甘肽抗壞血酸，半胱氨酸，谷胱甘肽

22、（3）生物大分子激活劑：）生物大分子激活劑：激酶激酶影響酶催化作用的因素影響酶催化作用的因素 酶的催化特點(diǎn)及影響因素 酶的活力測定酶活力酶活力 又稱酶活性，是指酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的能力，酶活力可又稱酶活性，是指酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的能力，酶活力可 用酶催化的某一化學(xué)反應(yīng)的速率來表示。用酶催化的某一化學(xué)反應(yīng)的速率來表示。 化學(xué)反應(yīng)的速率可用單位時間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的增化學(xué)反應(yīng)的速率可用單位時間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的增 加量來表示。加量來表示。酶活力的大小可用在一定條件下，酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的酶活力的大小可用在一定條件下，酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的 速度來表示，酶催化反應(yīng)速度愈大，酶活力愈高，反之活速

23、度來表示，酶催化反應(yīng)速度愈大，酶活力愈高，反之活 力愈低力愈低 酶活力單位酶活力單位酶活力單位是表示酶量多少的單位。酶活力單位是表示酶量多少的單位。 酶活力單位（酶活力單位（U）特定條件下（最適溫度、特定條件下（最適溫度、pH），每），每1min 催化催化1mol 底物轉(zhuǎn)化底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量定義為為產(chǎn)物的酶量定義為1個酶活力單位個酶活力單位 酶的活力測定 國際酶活力單位國際酶活力單位催量（催量（kat）1kat = 1mol/s = 60mol/min = 6107U在最適條件下，每秒鐘催化在最適條件下，每秒鐘催化1mol的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量。的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量。（1972年國際酶學(xué)委

24、員會）年國際酶學(xué)委員會） 酶活力單位酶活力單位 酶的活力測定 酶的比活力酶的比活力酶的比活力可用來表示酶制劑的純度或活力的高低，是酶的比活力可用來表示酶制劑的純度或活力的高低，是酶純度酶純度的一個指標(biāo)。在特定條件下，單位質(zhì)量的酶（蛋白或的一個指標(biāo)。在特定條件下，單位質(zhì)量的酶（蛋白或RNA )所所具有的酶活力單位數(shù)稱為酶的比活力（具有的酶活力單位數(shù)稱為酶的比活力（specific activity）。）。酶的比活力酶的比活力 = = 酶活力（酶活力（U）/ /mg（蛋白或（蛋白或RNA ) ) 酶的活力測定 酶的轉(zhuǎn)換數(shù)和催化周期酶的轉(zhuǎn)換數(shù)和催化周期轉(zhuǎn)換數(shù)（轉(zhuǎn)換數(shù)（Kcat）酶催化效率的指標(biāo)，指每

25、個酶分子每分鐘催化底物轉(zhuǎn)化的分子數(shù)酶催化效率的指標(biāo)，指每個酶分子每分鐘催化底物轉(zhuǎn)化的分子數(shù)一 般 用 每一 般 用 每 m o l 的 酶 活 力 單 位 數(shù)的 酶 活 力 單 位 數(shù) I U 來 表 示 （來 表 示 （ m i n - 1 ）酶分子只有一酶分子只有一個催化中心個催化中心催化中心活性等于摩爾催化活力催化中心活性等于摩爾催化活力例如：單體酶例如：單體酶酶分子有酶分子有n個個催化中心催化中心催化中心活性等于摩爾催化活力除以催化中心活性等于摩爾催化活力除以n例如：寡聚酶例如：寡聚酶 酶的活力測定催化周期催化周期 （T） T = 1 / Kcat酶的催化周期為轉(zhuǎn)換數(shù)的倒數(shù)，單位為毫秒

26、酶的催化周期為轉(zhuǎn)換數(shù)的倒數(shù)，單位為毫秒(ms)或微秒或微秒(s)。指酶進(jìn)行一次催化所需的時間。指酶進(jìn)行一次催化所需的時間。 酶的轉(zhuǎn)換數(shù)和催化周期酶的轉(zhuǎn)換數(shù)和催化周期 酶的活力測定酶活性的測定要求測得的反應(yīng)速度必須和酶的濃度有線性的比酶活性的測定要求測得的反應(yīng)速度必須和酶的濃度有線性的比例關(guān)系，這也是檢驗(yàn)酶反應(yīng)和測定系統(tǒng)是否適宜、正確的標(biāo)準(zhǔn)。例關(guān)系，這也是檢驗(yàn)酶反應(yīng)和測定系統(tǒng)是否適宜、正確的標(biāo)準(zhǔn)。酶活力測定是通過酶活力測定是通過“可視化可視化”酶催化其特定底物為產(chǎn)物，可用酶催化其特定底物為產(chǎn)物，可用終止反應(yīng)法或連續(xù)反應(yīng)法進(jìn)行測定。終止反應(yīng)法或連續(xù)反應(yīng)法進(jìn)行測定。活力的測定方法活力的測定方法 酶的

27、活力測定 酶反應(yīng)進(jìn)程曲線：酶反應(yīng)進(jìn)程曲線：縱坐標(biāo)為底物或產(chǎn)物的變化量，橫坐標(biāo)為反縱坐標(biāo)為底物或產(chǎn)物的變化量，橫坐標(biāo)為反應(yīng)時間，曲線斜率表示反應(yīng)速度。從酶反應(yīng)進(jìn)程曲線求得反應(yīng)的應(yīng)時間，曲線斜率表示反應(yīng)速度。從酶反應(yīng)進(jìn)程曲線求得反應(yīng)的初速度。初速度。 酶濃度曲線：酶濃度曲線：縱坐標(biāo)為反應(yīng)速度，橫坐標(biāo)為酶量。通過酶濃縱坐標(biāo)為反應(yīng)速度，橫坐標(biāo)為酶量。通過酶濃度曲線，檢驗(yàn)反應(yīng)測定系統(tǒng)是否合適。度曲線，檢驗(yàn)反應(yīng)測定系統(tǒng)是否合適。通常酶活力測定時，先制備酶反應(yīng)進(jìn)程曲線和酶濃度曲線通常酶活力測定時，先制備酶反應(yīng)進(jìn)程曲線和酶濃度曲線 酶的活力測定活力的測定方法活力的測定方法 酶活力與底物濃度、酶濃度、酶活力與底

28、物濃度、酶濃度、pH值、溫度、激活劑和抑制劑值、溫度、激活劑和抑制劑 的濃度以及緩沖液的種類和濃度都密切相關(guān)。的濃度以及緩沖液的種類和濃度都密切相關(guān)。 底物濃度：底物濃度：一般選用底物的濃度一般選用底物的濃度S=100Km。 pH值：值：選用適宜的緩沖離子和離子強(qiáng)度、適宜的選用適宜的緩沖離子和離子強(qiáng)度、適宜的pH值緩沖系值緩沖系 統(tǒng)來控制統(tǒng)來控制pH。 溫度：溫度：酶反應(yīng)的溫度通常選用酶反應(yīng)的溫度通常選用25、30、37，實(shí)驗(yàn)中溫，實(shí)驗(yàn)中溫 度的變動應(yīng)控制在度的變動應(yīng)控制在0.1以內(nèi)。以內(nèi)。 輔助因子：輔助因子：有些酶需要金屬離子，有些酶需要相應(yīng)的輔酶。有些酶需要金屬離子，有些酶需要相應(yīng)的輔酶

29、。 酶活力測定條件酶活力測定條件 酶的活力測定v 1.終止反應(yīng)法：終止反應(yīng)法： 終止法是在恒溫系統(tǒng)中進(jìn)行酶促反應(yīng)，間隔一段時間之后，終止終止法是在恒溫系統(tǒng)中進(jìn)行酶促反應(yīng)，間隔一段時間之后，終止酶反應(yīng)，然后測定反應(yīng)物的消耗量或產(chǎn)物的生成量，從而計(jì)算出酶反應(yīng)，然后測定反應(yīng)物的消耗量或產(chǎn)物的生成量，從而計(jì)算出酶活性酶活性 催化反應(yīng)的底物或產(chǎn)物可用催化反應(yīng)的底物或產(chǎn)物可用化學(xué)法化學(xué)法、放射性化學(xué)法放射性化學(xué)法、酶偶聯(lián)法酶偶聯(lián)法等等方法進(jìn)行測定。方法進(jìn)行測定。酶活力測定是通過酶活力測定是通過“可視化可視化”酶催化其特定底物為產(chǎn)物，可用酶催化其特定底物為產(chǎn)物，可用終止反應(yīng)法終止反應(yīng)法或或連續(xù)反應(yīng)法連續(xù)反應(yīng)

30、法。 酶活力測定方法酶活力測定方法 酶的活力測定v1.1 化學(xué)法：化學(xué)法：化學(xué)法是利用化學(xué)反應(yīng)使底物或產(chǎn)物變成一個可用某種物理化學(xué)法是利用化學(xué)反應(yīng)使底物或產(chǎn)物變成一個可用某種物理方法測定的化合物。如脲酶催化尿素水解，得到產(chǎn)物方法測定的化合物。如脲酶催化尿素水解，得到產(chǎn)物NH3和和CO2，便可用比色、滴定、氣體量度法等方法測出酶活性。，便可用比色、滴定、氣體量度法等方法測出酶活性。堿 滴 定 法堿 滴 定 法對 硝 基 苯 酚 法對 硝 基 苯 酚 法銅 皂 法銅 皂 法 酶活力測定方法酶活力測定方法 酶的活力測定v1.2 放射性化學(xué)法：放射性化學(xué)法：用同位素標(biāo)記底物元素，終止反應(yīng)后將底物與產(chǎn)物

31、分離，然后測定用同位素標(biāo)記底物元素，終止反應(yīng)后將底物與產(chǎn)物分離，然后測定底物或產(chǎn)物的放射性。常用于標(biāo)記的同位素有底物或產(chǎn)物的放射性。常用于標(biāo)記的同位素有35P和和14C等。等。v1.3 酶偶聯(lián)法：酶偶聯(lián)法：有些酶促反應(yīng)的產(chǎn)物不易直接測定，需加入指示酶轉(zhuǎn)變成可測定產(chǎn)有些酶促反應(yīng)的產(chǎn)物不易直接測定，需加入指示酶轉(zhuǎn)變成可測定產(chǎn)物。物。另脫氫酶需要以另脫氫酶需要以NAD+（或（或NADP+）為輔酶，它們在）為輔酶，它們在340nm處消光處消光系數(shù)很小，而系數(shù)很小，而NADH（或（或NADPH）在）在340nm處有較大的消光系數(shù)。處有較大的消光系數(shù)。 酶活力測定方法酶活力測定方法 酶的活力測定v2. 連

32、續(xù)反應(yīng)法連續(xù)反應(yīng)法：連續(xù)法測酶活力，不需要取樣終止反應(yīng)，而是基于反應(yīng)過程光連續(xù)法測酶活力，不需要取樣終止反應(yīng)，而是基于反應(yīng)過程光譜吸收、氣體體積、酸堿度、溫度等的變化，用儀器跟蹤監(jiān)測譜吸收、氣體體積、酸堿度、溫度等的變化，用儀器跟蹤監(jiān)測反應(yīng)，記錄結(jié)果，算出酶活。反應(yīng)，記錄結(jié)果，算出酶活。v2.1 光譜吸收法：分光光度法分光光度法熒光法熒光法紫外光紫外光可見光可見光 酶活力測定方法酶活力測定方法 酶的活力測定v2.2 量氣法：量氣法：計(jì)算氣體釋放或吸收的量。計(jì)算氣體釋放或吸收的量。v2.3 量熱法：量熱法：用靈敏度較高的量熱計(jì)測定酶反應(yīng)速度。用靈敏度較高的量熱計(jì)測定酶反應(yīng)速度。v2.4 粘度變化

33、法：粘度變化法：測定測定CMC粘度降低的方法分為粘度降低的方法分為旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)法旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)法和和工研法工研法。旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)法旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)法采用旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)，測定底物采用旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)，測定底物3min和和18min的粘度，的粘度，利用公式推算出酶活力。利用公式推算出酶活力。工研法工研法采用奧氏粘度計(jì)，測定底物粘度減至采用奧氏粘度計(jì)，測定底物粘度減至12時所需的時間，時所需的時間，以以10min使底物粘度降低使底物粘度降低12的酶活作為的酶活作為1個活力單位。個活力單位。 酶活力測定方法酶活力測定方法 酶的活力測定v 2.5 結(jié)構(gòu)鑒定法：結(jié)構(gòu)鑒定法：酶促反應(yīng)中的底物和產(chǎn)物能產(chǎn)生不同的酶促反應(yīng)中的底物和產(chǎn)物能

34、產(chǎn)生不同的NMR波譜波譜,可以通過測定底物可以通過測定底物或產(chǎn)物的量來檢測反應(yīng)?；虍a(chǎn)物的量來檢測反應(yīng)。v 2.6 偶聯(lián)的連續(xù)法：偶聯(lián)的連續(xù)法：偶聯(lián)的連續(xù)法就是將指示酶直接加到待測酶反應(yīng)系統(tǒng)中，將待測酶偶聯(lián)的連續(xù)法就是將指示酶直接加到待測酶反應(yīng)系統(tǒng)中，將待測酶的反應(yīng)產(chǎn)物直接或間接轉(zhuǎn)變成一個可用光譜吸收儀檢驗(yàn)的化合物。的反應(yīng)產(chǎn)物直接或間接轉(zhuǎn)變成一個可用光譜吸收儀檢驗(yàn)的化合物。 酶活力測定方法酶活力測定方法 酶的活力測定酶活力測定中應(yīng)注意的問題酶活力測定中應(yīng)注意的問題1. 測定的反應(yīng)速率必須是初速度，即底物消耗量在測定的反應(yīng)速率必須是初速度，即底物消耗量在5%以內(nèi)，以內(nèi)，或產(chǎn)物形成量占總產(chǎn)量的或產(chǎn)物

35、形成量占總產(chǎn)量的15%以下的速度。以下的速度。2. 底物濃度、輔因子的濃度必須遠(yuǎn)大于酶濃度；反應(yīng)條件為底物濃度、輔因子的濃度必須遠(yuǎn)大于酶濃度；反應(yīng)條件為酶的最適條件；反應(yīng)系統(tǒng)中不含酶的激活劑、抑制劑，底物酶的最適條件；反應(yīng)系統(tǒng)中不含酶的激活劑、抑制劑，底物自身不能裂解。自身不能裂解。 酶的活力測定v 酶反應(yīng)動力學(xué)是研究酶反應(yīng)速度規(guī)律以及各種因素酶反應(yīng)動力學(xué)是研究酶反應(yīng)速度規(guī)律以及各種因素對酶反應(yīng)速度影響的科學(xué)。對酶反應(yīng)速度影響的科學(xué)。 酶反應(yīng)動力學(xué) 研究酶反應(yīng)動力學(xué)對闡明酶作用機(jī)制和建立最優(yōu)化的研究酶反應(yīng)動力學(xué)對闡明酶作用機(jī)制和建立最優(yōu)化的反應(yīng)體系（包括酶反應(yīng)器的設(shè)計(jì)選型和酶催化工藝）反應(yīng)體系

36、（包括酶反應(yīng)器的設(shè)計(jì)選型和酶催化工藝）有重要的意義。有重要的意義。 本節(jié)主要介紹本節(jié)主要介紹均相體系均相體系的的單底物反應(yīng)動力學(xué)單底物反應(yīng)動力學(xué)。 影響酶反應(yīng)速度的因素影響酶反應(yīng)速度的因素濃度濃度外部因素外部因素內(nèi)部因素內(nèi)部因素酶濃度酶濃度底物濃度底物濃度效應(yīng)物濃度效應(yīng)物濃度溫度、溫度、pH值、離子強(qiáng)度、值、離子強(qiáng)度、溶液的介電常數(shù)、壓力等溶液的介電常數(shù)、壓力等酶的結(jié)構(gòu)、底物和效應(yīng)酶的結(jié)構(gòu)、底物和效應(yīng)物的結(jié)構(gòu)、載體等物的結(jié)構(gòu)、載體等此外，對于固定化酶反應(yīng)、非水體系酶反應(yīng)等非均相反應(yīng)體系，還涉此外，對于固定化酶反應(yīng)、非水體系酶反應(yīng)等非均相反應(yīng)體系，還涉及物質(zhì)擴(kuò)散等因素。及物質(zhì)擴(kuò)散等因素。 酶反應(yīng)

37、動力學(xué)米氏方程米氏方程對于對于單底物酶促反應(yīng)單底物酶促反應(yīng)，最簡單的酶促反應(yīng)方程式為：，最簡單的酶促反應(yīng)方程式為：單底物反應(yīng)是由一種底物參與的不可逆反應(yīng)，水解酶、異構(gòu)單底物反應(yīng)是由一種底物參與的不可逆反應(yīng)，水解酶、異構(gòu)酶及多數(shù)裂解酶的催化反應(yīng)均屬此類型。單底物反應(yīng)方程式酶及多數(shù)裂解酶的催化反應(yīng)均屬此類型。單底物反應(yīng)方程式可用米氏方程描述?？捎妹资戏匠堂枋?。E + SESE + Pk1k2k-1在酶促反應(yīng)方程式中，酶在酶促反應(yīng)方程式中，酶E和底物和底物S形成不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物形成不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物ES復(fù)復(fù)合物，中間產(chǎn)物分解，形成產(chǎn)物合物，中間產(chǎn)物分解，形成產(chǎn)物P，釋放出游離酶，釋放出游離酶E。它們的

38、正。它們的正反應(yīng)與逆反應(yīng)的速度常數(shù)分別為反應(yīng)與逆反應(yīng)的速度常數(shù)分別為 k1、k2 和和 k-1。 酶反應(yīng)動力學(xué)v反應(yīng)速度和底物濃度之間的關(guān)系，服從雙曲線方程：反應(yīng)速度和底物濃度之間的關(guān)系，服從雙曲線方程：SKSVvmm 米氏方程最初由米氏方程最初由Michaelis和和Menten（1913年）應(yīng)用年）應(yīng)用“快快速平衡法速平衡法”解析出來（平衡態(tài)假說）；以后解析出來（平衡態(tài)假說）；以后Briggs和和Haldane（1925年）發(fā)展了年）發(fā)展了“穩(wěn)態(tài)法穩(wěn)態(tài)法”解析擴(kuò)展（穩(wěn)態(tài)假解析擴(kuò)展（穩(wěn)態(tài)假說）；說）；2003年，丁勇等人提出極值原理假說，用于完善不年，丁勇等人提出極值原理假說，用于完善不足之

39、處，擴(kuò)大了酶動力學(xué)的應(yīng)用范圍。足之處，擴(kuò)大了酶動力學(xué)的應(yīng)用范圍。 酶反應(yīng)動力學(xué)米氏方程米氏方程 1913年，年， Michaelis和和Menten提出提出平衡態(tài)假說平衡態(tài)假說：是一個快速平衡反應(yīng)；且是一個快速平衡反應(yīng)；且k2k-1；在反應(yīng)達(dá)到平衡時，在反應(yīng)達(dá)到平衡時， k1ES= k-1ES用用Et表示總酶濃度，由于表示總酶濃度，由于Et= E+ ESk1(Et- ES)S= k-1ES記記KS= k-1/ k1=(Et- ES)S/ ES為解離常數(shù)，為解離常數(shù)， = k2ES為反應(yīng)速度，為反應(yīng)速度，Vm= k2Et為最大反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度SKSVvSm（方程一）（方程一） 酶反應(yīng)動力學(xué)

40、米氏方程米氏方程Michaelis-Menten方程的推導(dǎo)方程的推導(dǎo) 快速平衡假設(shè)快速平衡假設(shè) 11sE SESkKk(1-1) 0EEES(1-2) s0EE SEESSK s0ESSESK(1-3) 酶反應(yīng)動力學(xué)設(shè)ES形成E+S的解離常數(shù)為Ks，則有平衡時，S不變（假設(shè)(2)），由式(1-1) 和式(1-2) 得 由假設(shè)由假設(shè)(1)， 由條件由條件(2)， 由此可得由此可得 將式將式(1-4)、式、式(1-6)代入式代入式(1-3)可得可得(1-4)(1-5)(1-6) dVVkkdt22SESES ,VV0maxESEVVkkmaxmax2002EE maxmaxs22sS+ S=S =

41、+ SV VV VV VK KV Vk kk kK K (1-7)Michaelis-Menten方程的推導(dǎo)方程的推導(dǎo) 快速平衡假設(shè)快速平衡假設(shè) 酶反應(yīng)動力學(xué)v穩(wěn)態(tài)假說修正了平衡態(tài)假說，然而仍有其不足之處：穩(wěn)態(tài)假說修正了平衡態(tài)假說，然而仍有其不足之處： （1）有些情況下酶反應(yīng)不一定能達(dá)到穩(wěn)態(tài)；）有些情況下酶反應(yīng)不一定能達(dá)到穩(wěn)態(tài)； （2）在穩(wěn)態(tài)假說下）在穩(wěn)態(tài)假說下,公式二在理論上有自相矛盾之處：公式二在理論上有自相矛盾之處：v 如果如果ES的生成和分解的速度相等的生成和分解的速度相等,即其濃度達(dá)到了穩(wěn)態(tài)即其濃度達(dá)到了穩(wěn)態(tài),則則ES為一個定值為一個定值,由方程二可知由方程二可知 ，由于，由于k2、Vm和