不同產(chǎn)地大豆SOD的提取及活性比較

1、不同產(chǎn)地大豆SOD勺提取及活性比較1 引言SOD是生物體內(nèi)一種非常重要的金屬酶，廣泛存在于各種生 物體中。同時(shí)也是一種重要勺抗氧化劑， 它勺作用底物是超氧陰 離子？02-，催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)，從而清除？02-自由基1，2。目前SOD已在多個(gè)領(lǐng)域中被應(yīng)用，比如醫(yī)療保健 3、 食品工業(yè)4、以及植物抗逆5等。植物來(lái)源SOD的分離純化 68主要工藝流程為：植物-精制-超濾濃縮-冷凍干燥-產(chǎn)品。 SOD勺活性測(cè)定方法一般分直接測(cè)定法和間接測(cè)定法9-11。常見(jiàn)的直接測(cè)定方法有 EPR法、脈沖輻解法、超氧化鉀法等。常見(jiàn) 勺間接測(cè)定方法有黃嘌呤氧化酶法、 細(xì)胞色素法、 鄰苯三酚自氧 化法、微量鄰苯三酚

2、自氧化法、黃嘌呤氧化酶 -NBT法、NBT光還 原法等。鄰苯三酚自氧化法勺主要原理為：在堿性條件下，鄰苯 三酚發(fā)生自氧化反應(yīng)，并產(chǎn)生 ？O2,在SOD存在下，自氧化反應(yīng) 受到抑制。 該法所用試劑和儀器比較普通， 測(cè)試方便， 靈敏度高， 是目前應(yīng)用最廣泛的一種測(cè)試方法，但對(duì)溫度、pH值、鄰苯三酚濃度、SOD寺測(cè)液存放時(shí)間等諸因素比較敏感，因此測(cè)定時(shí)要 嚴(yán)格控制這些因素 12 14。筆者提取了大豆中的SODS,然后利用改良的鄰苯三酚自氧 化法對(duì)大豆的SOD酶活性進(jìn)行了測(cè)定，對(duì)測(cè)定過(guò)程中的各個(gè)條件 進(jìn)行了探索，建立了大豆SOD酶測(cè)定最佳方法，并對(duì)不同產(chǎn)地大豆的SOD舌性進(jìn)行了比較，使SOD在規(guī)?；?/p>

3、產(chǎn)的同時(shí)更具針對(duì) 性。2 材料與方法2.1 材料和儀器本實(shí)驗(yàn)所使用的大豆樣品來(lái)源于 9 個(gè)產(chǎn)地，分別為：廣東（廣 州）、北京、江蘇（動(dòng)臺(tái)）、黑龍江（佳木斯）、黑龍江（牡丹 江）、福建（廈門(mén)）、廣西（柳州）、湖北（武漢）、湖南（長(zhǎng) 沙）。對(duì)應(yīng)的編號(hào)分別為19。實(shí)驗(yàn)材料：Tris base（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑 XX公司，優(yōu)級(jí)純）；其余試劑均為分析純。 A液：稱(chēng)取1.2114 g Tris 和37.2 mgEDTA?2N溶于62.4 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液中，用蒸餾水定容至100mL B液：4.5 mmol/L鄰苯三酚鹽酸溶液。實(shí)驗(yàn)儀器：紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UEG1008016上海美譜達(dá) 儀

4、器XX公司）；微型酸度計(jì)（PHSJ-3F,上海精科）；高速離心 機(jī)（TGL-20M長(zhǎng)沙平凡儀器儀表 XX公司）；超純水系統(tǒng)（Aquaplore3S，頤洋企業(yè)發(fā)展 XX公司）。2.2SOD酶提取與處理2.2.1 粗酶液的提取將大豆種子洗凈淋干，于 pH值為7.8的PBS緩沖液中浸泡10 h。清洗后加入4C三倍體積的預(yù)冷緩沖液，在冰上勻漿。勻 漿后加入一定量的緩沖液， 在超聲波清洗機(jī)中超聲， 使細(xì)胞破碎， 得到粗酶液。2.2.2SOD 粗酶液的處理熱變性：分別取一定體積的粗酶液，放入60C的水浴鍋中分別保溫10、15、20 min，在5000 r/min、4C的離心條件下離 心 15 min 去除

5、沉淀，測(cè)定上清液中酶活力及蛋白含量，篩選熱 變性的最佳時(shí)間。丙酮沉淀：取一定體積的酶液，置于冰浴中，緩慢加入-20C 預(yù)冷的丙酮，攪拌10 min ,4C下靜置5 h,待其自然沉淀后，4C、 5000 r/min 離心 15 min 棄去上清液，收集沉淀，用緩沖液溶解 沉淀，4C、5000 r/min離心15 min后測(cè)定上清液酶活力和蛋 白含量。2.3 酶活性與濃度的測(cè)定2.3.1 酶活力的測(cè)定鄰苯三酚自氧化速率測(cè)定嚴(yán)格控制在25 C進(jìn)行。于15 mL比色管中用微量移液器依次加入 A液2.35 mL,蒸餾水2.015 mL, B液0.35 mL。加入B液后立即混合并傾入比色皿，于325 nm

6、處測(cè)吸光值，共測(cè) 4次，即取開(kāi)始后 30s 和 90s 時(shí)的吸光值，二者 之差即為鄰苯三酚自氧化速率厶 A325本試驗(yàn)確定 A325值為 0.060。測(cè)定樣液和SOD酶液抑制鄰苯三酚自氧化速率時(shí)樣品的 加入順序如表 1 所示，分別加入一定量樣液或酶液使鄰苯三酚自 氧化速率約為0.5倍A325,即厶A 325為0.030。2.3.2 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定采用紫外分光光度法測(cè)蛋白質(zhì)濃度，禾U用在280 nm及260 nm下的光吸收值計(jì)算蛋白質(zhì)的濃度，公式如下：蛋白質(zhì)濃度（mg/mL =1.45 XA280-0.74 XA260式中:A280是蛋白質(zhì)溶液在280 nm下測(cè)得的光吸收值；A260 是蛋白質(zhì)

7、溶液在 260 nm 下測(cè)得的光吸收值。2.3.3SOD 的定性分析采用紫外分光光度法：分離后的酶液與Cu/Z n-SOD標(biāo)品分別 在200400 nm處進(jìn)行紫外光譜掃描，根據(jù)樣品與標(biāo)品的紫外圖 譜比較， 對(duì)提取物質(zhì)進(jìn)行定性， 同時(shí)根據(jù)其最大吸收峰的波長(zhǎng)來(lái) 判斷SOD的類(lèi)型。2.4SOD酶提取條件的優(yōu)化2.4.1 超聲時(shí)間的優(yōu)化分別對(duì)勻漿超聲波處理 1 min， 2 min， 3 min， 4 min， 5 min 后，使用紫外分光光度法測(cè)定蛋白的濃度，并用改良的 ?苯三酚 自氧化方法測(cè)定酶的活力。2.4.2 熱變性時(shí)間的優(yōu)化取三份100 mL粗酶液，60C條件下對(duì)其進(jìn)行熱處理，時(shí)間分別為10

8、 min、15 min、20 min，邊加熱邊用玻璃棒輕輕攪拌， 加熱完成后，迅速放入4C冰浴冷卻30 min,然后在5000 r/min、 4C下離心15 min，取上清液，分別測(cè)酶活和蛋白質(zhì)含量。2.4.3 丙酮用量的優(yōu)化取熱變性以后的酶液，置入 4C冰浴中，分別加入1.0倍、 1.5倍、2.0倍體積的-20C預(yù)冷丙酮進(jìn)行沉淀。丙酮要緩慢加入， 并用玻璃棒輕輕攪拌， 以防止丙酮局部過(guò)量以及溶液產(chǎn)生大量的熱量而使蛋白質(zhì)變性。2.5不同產(chǎn)地大豆的SOD酶的提取與比較利用上述提取方法對(duì)全國(guó)9個(gè)產(chǎn)地的大豆進(jìn)行SODB的提取 及酶活的測(cè)定。3.2.3 丙酮加入量對(duì)酶活的影響檢測(cè)結(jié)果如表 3，當(dāng)丙酮加

9、入量為 1.5 倍時(shí)酶活收率與比活 力最高，因此本實(shí)驗(yàn)將丙酮加入量定為 1.5 倍體積。3.3SOD活性的測(cè)定優(yōu)化3.3.1A液pH值對(duì)鄰苯三酚自氧化速率的影響檢測(cè)結(jié)果如表 4 所示。 從表中數(shù)據(jù)可以看出， 鄰苯三酚自氧 化速率隨pH的升高而增大，在pH值在88.4范圍內(nèi)，曲線(xiàn)幾 乎不變，斜率較低，pH變化對(duì)鄰苯三酚自氧化速率的影響不大。 當(dāng)pH值超出此范圍時(shí)，曲線(xiàn)斜率變大，微小的pH變化都會(huì)顯著 影響鄰苯三酚自氧化速率。本實(shí)驗(yàn) A液最佳PH值定為8.2。3.3.2 鄰苯三酚加入量對(duì)測(cè)量的影響4 討論及結(jié)論大豆樣品經(jīng)粗提取和熱變性、 丙酮沉淀后的蛋白質(zhì)紫外光譜 如圖1 (b)所示。由圖1可以看

10、出Cu/Zn-SOD標(biāo)準(zhǔn)品圖1 (a) 與樣品圖譜的走勢(shì)、 峰形及出峰位置基本一致， 可確定提取物質(zhì) 為SOD圖形的差異是由于 Cu/Zn-SOD的來(lái)源不同，標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)源 于牛血細(xì)胞，出峰位置在 258 nm處，而待測(cè)樣品來(lái)源于大豆， 出峰位置在 260 nm。SOD勺測(cè)活方法有很多，在這些方法中，鄰苯三酚自氧化法 儀器簡(jiǎn)單、測(cè)試方便，因而是使用較普遍的一種方法。目前采用 勺鄰苯三酚測(cè)活方法有兩種，一種是經(jīng)典勺鄰苯三酚自氧化法， 另一種是改進(jìn)的微量鄰苯三酚自氧化法。 本文SOD舌性的測(cè)定采 用后者，該方法以修改的 Marldund方法廣泛用于食品中 SOD舌 性測(cè)定，方法靈敏，操作簡(jiǎn)易，易于推廣。超聲波實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，最佳的超聲波時(shí)間是4 min。因?yàn)樵谝欢ǖ臈l件下， 超聲波時(shí)間過(guò)短不能使細(xì)胞破碎， 因而其中的 酶不能完全溶出； 因?yàn)榇蠖鄶?shù)酶也是蛋白質(zhì)， 如果超聲波時(shí)間過(guò) 長(zhǎng)就會(huì)破壞蛋白的結(jié)構(gòu)， 酶也就會(huì)失去活力。 故超聲波時(shí)間應(yīng)該 嚴(yán)格控制。 熱變性試驗(yàn)可以去除一定量的雜質(zhì)蛋白， 熱變性的過(guò) 程中不需要接觸有機(jī)溶劑， 在節(jié)省成本的同時(shí)， 減少了對(duì)環(huán)境和 人體的危害， 增加了工作的安全性， 所以熱變性法是去除雜蛋白 的一種高效、簡(jiǎn)便、安全的方法。丙酮沉淀方法的優(yōu)勢(shì)在于丙酮 本身為易揮發(fā)的有機(jī)溶劑， 離心除去上清后沉淀， 避免了透析等 一系列的繁瑣步驟， 可以直接干燥而得到最