LCMS定性定量方法與技術

1、1會計學LCMS定性定量方法與技術定性定量方法與技術1. LC/MS的基本數(shù)據(jù)與信息的基本數(shù)據(jù)與信息2. LC/MS定性分析技術定性分析技術3. LC/MS定量分析技術定量分析技術本講內容：TICBPCTICEIC m/z 311.0805SO+ONH2SNH3+OONH2NH3+NNOOCH3CH3SNH2+NNOOOONH2CH3CH3specific to sulfadimethoxinecommon to all sulfonamidesSO+ONH24 GHzResolution 121841x1000.511.522.533.544.555.566.577.588.599.5+ P

2、roduct Ion (0.820-0.966 min, 10 scans) (311.08060z=1 - *) sulfas_10ng_4GHz-016.d 156.0760412184156.0108712238156.112269868Counts (%) vs. Mass-to-Charge (m/z)155.78 155.8155.82 155.84 155.86 155.88 155.9155.92 155.94 155.96 155.98156156.02 156.04 156.06 156.08 156.1156.12 156.14 156.16 156.18 156.215

3、6.22 156.24 156.26 156.28156.3156.32 156.34NH3+NNOOCH3CH3m/z 156.0773m/z 156.0119平均分子量平均分子量（average molecular mass）由分子中各元素的（相對）平均原子量計算所得。由分子中各元素的（相對）平均原子量計算所得。a “Atomic Weights of the Elements 1987,” Pure Appl. Chem. 1988，60：841 括號內的數(shù)值為測不準水平，主要是同位素豐度的自然變化。例如，氫原子量為1.007940.00007 元素 原子量a H 1.00794（7）

4、C 12.011（1） N 14.00674（7） O 15.9994（3） F 18.998403（9） Na 22.989768（6） Si 28.0855（3） P 30.973762（4） S 32.066（6） Cl 35.452（9） K 39.0983（1） Br 79.904（1） I 126.90447（3） 同位素同位素質量質量a a天然豐度（天然豐度（% %）b b1 1H H1.0078250351.00782503599.98599.9852 2H H2.0141017792.0141017790.0150.0151212C C121298.998.91313C C1

5、3.0033548313.003354831.11.11414N N14.00307414.00307499.6399.631515N N15.0001089715.000108970.370.371616O O15.9949146315.9949146399.7699.761717O O16.999131216.99913120.040.041818O O17.999160317.99916030.20.21919F F18.9984032218.998403221001002323NaNa22.989676722.98967671001002828SiSi27.976927127.9769

6、27192.2392.232929SiSi28.976494928.97649494.674.673030SiSi29.973770129.97377013.13.13131P P30.97376230.9737621001003232S S31.972070731.972070795.0295.023333S S32.9714584332.971458430.750.753434S S33.9678666533.967866654.214.213636S S35.9670806235.967080620.020.023535ClCl34.9688527334.9688527375.7775.

7、773737ClCl36.9659026236.9659026224.2324.233939K K38.963707438.963707493.258193.25814040K K39.963999239.96399920.0120.0124141K K40.961825440.96182546.73026.73027979BrBr78.918336178.918336150.6950.698181BrBr80.91628980.91628949.3149.31127127I I126.904473126.904473100100單同位素分子量單同位素分子量（mono isotopic mol

8、ecular mass）由分子中各元由分子中各元素中豐度最高（素中豐度最高（最輕）的同位素最輕）的同位素的（相對）原子的（相對）原子量計算所得量計算所得單鍵裂解伴隨電荷的遷移單鍵裂解伴隨電荷的遷移 CH3-CH2-OH2+ CH3-CH2+ + H2O鍵的裂解伴隨環(huán)化及電荷的遷移鍵的裂解伴隨環(huán)化及電荷的遷移 環(huán)狀離子斷裂兩個鍵，電荷保留環(huán)狀離子斷裂兩個鍵，電荷保留兩個鍵的斷裂，伴隨著重排兩個鍵的斷裂，伴隨著重排 如烷鏈較長，通過六元環(huán)的如烷鏈較長，通過六元環(huán)的位氫重排為優(yōu)勢過程，這是發(fā)生在偶電子離子上的位氫重排為優(yōu)勢過程，這是發(fā)生在偶電子離子上的McLafferty重排重排磷酸二酯鍵的磷酸二酯

9、鍵的4種可能的裂解產(chǎn)生種可能的裂解產(chǎn)生8種離子，含種離子，含5-OH的離子稱的離子稱an 、bn 、cn和和dn而含而含3-OH的離子稱的離子稱wn 、xn 、yn和和zn。下標下標n指示其裂解位置。堿基的進指示其裂解位置。堿基的進一步丟失用括號表示，如一步丟失用括號表示，如a3-B3（A）表示鍵的開裂發(fā)生在表示鍵的開裂發(fā)生在3位的磷酸二酯基的位的磷酸二酯基的核糖碳原子和氧原子之間并在同一位置進一步丟失了腺苷堿基。核糖碳原子和氧原子之間并在同一位置進一步丟失了腺苷堿基。為了解釋互補離子為了解釋互補離子an-Bn和和wn的形成，提出了幾種裂解途徑，例如：的形成，提出了幾種裂解途徑，例如：上述裂解

10、途徑中首先通過上述裂解途徑中首先通過1，2消除丟失堿基。這一消除可能是由于分子間的堿催化產(chǎn)生消除丟失堿基。這一消除可能是由于分子間的堿催化產(chǎn)生的（的（3磷酸酯基的帶負電的氧原子）。然后，由這一中間體通過磷酸二酯基的磷酸酯基的帶負電的氧原子）。然后，由這一中間體通過磷酸二酯基的3C-O鍵鍵的開裂產(chǎn)生的開裂產(chǎn)生an-Bn和和wn碎片。碎片。電荷保留在非還原端的碎片稱A、B、C，而電荷保留在還原端的碎片稱X、Y、Z。 NNNNNOOBuspironeC21H31N5O2MW = 385150200250300350400450500m/z255075100Relative Abundance3864

11、08(M+H)+(M+Na)+NHNNNOONHNOO100150200250300350400m/z255075100Relative Abundance122386222150265180NNNNHNOO(M+H)+磺胺類藥物的磺胺類藥物的母離子掃描母離子掃描: Q3 固定在固定在 m/z 122NNNNNOOOH100200300400500m/zRelative Abundance402386910111213141516Time (min)255075100Relative Abundance11.6213.8413.1614.4012.1310.4515.45NNNNNOOQ3中性

12、丟失掃描中性丟失掃描: Q1/Q3 質量差為質量差為121 Da100200300400500m/zRelative Abundance402386910111213141516Time (min)255075100Relative Abundance13.9211.6913.2115.5010.58NNNNNOONNNNNOOOH-尋找代謝物-尋找代謝物Original TICProcessed TIC3D Plot No Background Data Reduced sum intensities of isotopes, adducts, clusters and multiply c

13、harges ions together.Finds Features in TOF/QTOF DataCoeluting Features預測Nefazodone的phase I和phase II代謝產(chǎn)物及其mass shift Mass shiftExpected resultsUnexpected resultsParent drug MS/MSMetabolite MS/MSMass-to-charge (m/z)Retention timeParent drugmetaboliteProcessed TICProcessed TICProcessed TICGroup A (meta

14、bolite)Processed TICProcessed TICProcessed TICGroup B (Control)Aligns Data RT, Mass, AbundanceAll Data RT/MassWhats Changed? Mass/RT 2 Fold ChangeWhats Unique! Metabolite ControlMass vs. Retention Time0510152025Retention Time (min)01002003004005006007008009001000Mass (Da)將將MP分析中得到的代謝物樣品獨有的分析中得到的代謝物樣

15、品獨有的features，帶入自建的，帶入自建的Metlin database，進，進行所搜，即可得到可能存在的代謝物。行所搜，即可得到可能存在的代謝物。 質譜定量數(shù)據(jù)質譜定量數(shù)據(jù) 四極質譜法四極質譜法 飛行時間質譜法飛行時間質譜法1 用用SIM, SRM等方法等方法 采用提取離子流采用提取離子流(EIC)2 隨著選擇監(jiān)測的離子種類隨著選擇監(jiān)測的離子種類 提取多種離子檢測靈敏度提取多種離子檢測靈敏度 的增加，檢測靈敏度下降的增加，檢測靈敏度下降 不受影響不受影響3 為提高專屬性，需同時記為提高專屬性，需同時記 提供待測成分的全譜、準提供待測成分的全譜、準 錄錄 “定性離子定性離子” 確質量、實

16、驗式、不飽和確質量、實驗式、不飽和 度、同位素豐度比等信息度、同位素豐度比等信息4 低分辨，對低分辨，對tR和和m/z相近的相近的 高分辨，可定量測定名義高分辨，可定量測定名義 離子難以定量離子難以定量 質量相同而準確質量不同質量相同而準確質量不同 的離子的離子 NNNNNOOBuspironeC21H31N5O2MW = 385150200250300350400450500m/z255075100Relative Abundance386408(M+H)+(M+Na)+NHNNNOONHNOO100150200250300350400m/z255075100Relative Abundan

17、ce122386222150265180NNNNHNOO(M+H)+磺胺類藥物的磺胺類藥物的 LC/ESI-MS/MS, SRM Mode 10 pg/mL Buspirone, Spiperone & Haloperidol in Bovine Plasma 100 fg on column Ballistic Gradient Method 1 mL/min (no split) Total acquisition time = 1.6 min0.60.70.80.91.01.11.21.31.41.51.6Time (min)200040006000800050001000015

18、000Intensity1000200030004000RT: 1.00RT: 1.061.22RT: 1.09Buspirone386 122Area = 7929Spiperone396 165Area = 10268Haloperidol376 165Area = 15744PlasmaContaminant -基于準確質量EIC的藥物動力學研究10ng/ml notoginsenoside R1EIC m/z 967.531967.532 MS spectrum of notoginsenoside R1EIC m/z 967.0968.0-基于準確質量EIC的藥物動力學研究01000

19、20003000400050006000700080009000020406080100120時間（小時）濃度（ng/ml）Mean-Rb1Mean-RdMean-R1Mean-Rg1Mean-ReRagu Ramanathan , International Journal of Mass Spectrometry xxx (2010) xxxxxx CSI allows the use of conventional HPLC or uHPLC columns and flow rates of 0.350.6 mL/min (before post column flow splitti

20、ng) and can be considered as a technique which can function as a nanospray or microspray. Also, in comparison to conventional nanospray ionization (NSI) techniques, setup and maintenance of CSI do not require:(1) X, Y, and Z positioning or cameras to guide the spray positioning, (2) difficult to con

21、trol splitters to deliver nano-flow ratios and difficult to maintain nanospray nozzles. Evaluations using equimolar mixture of buspirone and four monoxymetabolites present in human plasma show that LCCSI-MS is a highly sensitive technique that gives a near equimolar response for the compounds used i

22、n this example. Comparisons of LCESI-MS data with that obtained using LCCSI-MS show that reasonable quantification of metabolites may be achievable without using reference standards or administration of radiolabeled drugs. Ragu Ramanathan,J Am Soc Mass Spectrom 2007, 18, 18911899Thank you for your attention! 謝謝各位的關注！TICEIC m/z 311.0805SO+ONH24 GHzR