液質(zhì)學(xué)習(xí)資料

1、 質(zhì)譜儀是按照離子的質(zhì)荷比(m/z)不同,來(lái)分離不同分子量的分子.測(cè)定分子量進(jìn)行成分和結(jié)構(gòu)分析. 離子的生成方式有失去或捕獲電荷(如:電子發(fā)射,質(zhì)子化或去質(zhì)子化)n主要組成部分:n1.進(jìn)樣部分n2.離子源n3.質(zhì)量過(guò)濾器(分析器)n4.離子檢測(cè)器離子源質(zhì)量過(guò)濾/分析器檢測(cè)器進(jìn)樣部分樣品板LC或GCEI源FAB源MALDI源ESI源QuadruopoleIon trapTime-of-flight電子倍增器閃爍計(jì)數(shù)器 + + + + + + + + + + + + + + + + +常用基質(zhì)1、氰基4羥基肉桂酸 CCA 多肽2、3,5二甲氧基4羥基肉桂酸 SA 蛋白3、龍膽酸（2,5二羥基苯甲酸

2、 DHB 聚合物4、吡啶甲酸 PA5、3羥基吡啶甲酸 3HPAMALDI源由氮激光器產(chǎn)生短周期脈沖激光，產(chǎn)生的多為單電荷離子，效率很高，即使只有極少的樣品也可分析常用基質(zhì)結(jié)構(gòu)DHBDHBSASACCACCA MALDI的優(yōu)缺點(diǎn)n優(yōu)點(diǎn)n1、質(zhì)量數(shù)可達(dá)300,000Da。n2、attomole 至femtomole級(jí)靈敏度。n3、軟電離方式，無(wú)或極少碎片離子。n4、耐鹽（樣品含鹽可達(dá)毫摩爾濃度）。n5、適于分析復(fù)雜混合物。n缺點(diǎn)n1、分辨率低。n2、1000Da以下基質(zhì)峰干擾。n3、激光解吸附離子化有可能使樣品光降解。n4、串聯(lián)質(zhì)譜功能較弱，除非接反射裝置進(jìn)行源后衰變測(cè)量。n5、不能分析非共價(jià)鍵相

3、互作用。n6、定量時(shí)需要內(nèi)校準(zhǔn)。n7、如沒(méi)有反射飛行裝置，不能分析多肽修飾。n8、對(duì)各種賦形劑的容忍度低（如n含磷酸緩沖液，大于150mM的鹽等。D: ESI離子源Electrospray Ionization4000v強(qiáng)電場(chǎng)中，樣品溶液通過(guò)毛細(xì)管噴嘴噴出，帶電液滴被靜電場(chǎng)吸向質(zhì)譜人口，同時(shí)伴隨干燥或加熱干燥氣體吹送，使液滴表面溶劑揮發(fā),液滴體積變小，表面電荷密度變大，當(dāng)同種電荷之間的庫(kù)侖斥力達(dá)到雷利極限時(shí)，突破表面張力，液滴爆裂為更小的帶電液滴，這一過(guò)程不斷重復(fù)，使最終的液滴非常細(xì)小，呈噴霧狀，此時(shí)液滴表面電場(chǎng)非常強(qiáng)大，使分析物離子化，帶單電荷或多電荷。 一般分析物分子量 2000Da帶多電

4、荷NANO-ESI噴霧照片ESI特點(diǎn)1、 ESI產(chǎn)生的生物大分子離子如多肽蛋白等常常帶10個(gè)以上電荷，使得m/z大大減小，彌補(bǔ)了四極桿質(zhì)量分析器等質(zhì)量范圍窄的缺點(diǎn)。2、質(zhì)譜圖顯示的是離子帶不同電荷數(shù)的一系列質(zhì)荷比峰，根據(jù)峰位置換算成質(zhì)量數(shù)和電荷數(shù)。電荷數(shù)和質(zhì)量數(shù)的計(jì)算已知 mj=(m+nj)/nj mk=(m+nk)/nk nj= nk+1 推算出 nj=(mk-1) /(mk- mj) nk=(mj-1) /(mk-mj) m=mjnj-nj =mknk-nkm/z相相對(duì)對(duì)豐豐度度mjmkESI優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)1、質(zhì)量數(shù)可達(dá)70，000Da2、靈敏度高達(dá)femtomole級(jí)。3、軟電離，可觀察生物

5、分子非共價(jià)反應(yīng)。4、易于和LC串聯(lián)，直接分析流速為1ml/min的LC洗脫液。5、沒(méi)有基質(zhì)干擾。6、適于聯(lián)四極桿質(zhì)量分析器、離子阱質(zhì)量分析器做結(jié)構(gòu)分析。7、帶多電荷，允許質(zhì)量范圍窄的設(shè)備檢測(cè)高質(zhì)量數(shù)的離子。8、帶多電荷，通過(guò)計(jì)算平均值給出更精確的質(zhì)量數(shù)。9、特別適于測(cè)多肽的修飾。10、樣品前處理簡(jiǎn)單可直接分析RP-HPLC脫鹽處理的溶液。缺點(diǎn)1、耐鹽能力低。2、對(duì)某些化合物特別敏感，污染難清洗。3、樣品需先氣化，混合物不適用。4、帶多電荷，在分析混合物時(shí)，產(chǎn)生混亂。5、定量時(shí)需內(nèi)校準(zhǔn)。nD、分辨率 質(zhì)譜分辨不同質(zhì)荷比離子的能力 分辨率R=M/ a =M/(M M ) b a 公式定義為單峰的質(zhì)

6、荷比與其半峰寬之比 b公式定義為相鄰的相交10的兩個(gè)峰M M 按a 式計(jì)算的分辨率約為b式計(jì)算的兩倍。不同分辨率譜圖效果 離子阱質(zhì)量分析器 三維的四極桿，RF加在環(huán)形電極上。質(zhì)量分析器的串聯(lián)目的：碰撞誘導(dǎo)產(chǎn)生碎片離子，進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析 Collision-induced dissociation(CID)Ion source ion daughter ion granddaughter ion選擇離子 MSCIDMS/MSCIDMS/MS/MS空間串聯(lián)質(zhì)譜儀A、串聯(lián)四極桿（三級(jí)四極桿） triple-Quadrupole AnalyzerQ為過(guò)濾單元Q為碰撞單元Q為分析單元時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀A、離子阱

7、質(zhì)譜儀：幾種串聯(lián)質(zhì)譜優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)三級(jí)四極桿質(zhì)量精度高，分辨率好碰撞能量低，碎片不完全。RTOF價(jià)廉前體離子選擇困難子離子分辨率低。FTMS質(zhì)量精度最高，子離子分辨率好，非常適合多級(jí)質(zhì)譜低能量碰撞，需超導(dǎo)磁體，價(jià)高。離子阱相對(duì)價(jià)廉，質(zhì)量精度高，分辨率好，適合多級(jí)質(zhì)譜低能量碰撞QTOF質(zhì)量精度高，分辨率好，前體離子選擇性好，ESI、MALDI均可接。需高真空，價(jià)高。四、O標(biāo)記從頭測(cè)序技術(shù) 蛋白酶解時(shí)，酶解液中H2 O和H2 O各占50， 酶解后肽段的羧基端上的羥基氧 O/ O豐度比1：1，使Y型離子系列的M+2/M同位素峰的豐度高于正常未標(biāo)記 O的離子的同位素豐度比。181818161618

8、1816161818A：MA結(jié)合磷酸酶水解磷酸化蛋白MS蛋白酶水解MS磷酸酶脫HPO3MS通過(guò)比較幾級(jí)質(zhì)譜圖，比較質(zhì)量數(shù)少80Da或80倍數(shù)的肽段。B、串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行母離子、中性丟失 掃描，分析含HPO3的肽段產(chǎn)生的特征離子，直接從混合肽段中找出磷酸化肽段。C C、PRD-MALDI-MS用源后衰變技術(shù)尋找質(zhì)量數(shù)少80Da或98Da的肽段來(lái)判斷磷酸肽。D、用IMAC技術(shù)分離/富集磷酸肽對(duì)比前后質(zhì)譜變化尋找磷酸肽。 IMAC immobilized metal affinity固相金屬親和色譜。IMAC 對(duì)磷酸肽有高選擇結(jié)合能力，富集后用高PH或磷酸鹽洗脫后測(cè)質(zhì)譜。1、N穩(wěn)定同位素標(biāo)記法：N培養(yǎng)基

9、1415N培養(yǎng)基142、同位素親和標(biāo)記法細(xì)胞池1細(xì)胞池2混合消除氘消除氫親和純化酶解MS磷酸肽或磷酸化蛋白在緘性環(huán)境下發(fā)生消除，同時(shí)用親核試劑攻擊形成的雙鍵并發(fā)生加成反應(yīng)，親核試劑一種為氘原子、一種為氫原子，再接上一個(gè)親和標(biāo)簽（如生物素biotin），混合酶解，提取含biotin的肽段進(jìn)行MS檢測(cè)。六、糖基化蛋白的鑒定nA、用糖甙內(nèi)切酶切斷糖鏈與蛋白鏈間的糖甘鍵，將反應(yīng)前后的質(zhì)譜圖比較，可知糖鏈的平均質(zhì)量。B、糖基化位點(diǎn)的確定n先用蛋白酶酶解成含糖鏈和不含糖鏈的肽段，獲得其肽質(zhì)量指紋譜，再用糖苷內(nèi)切酶切除糖鏈，其肽質(zhì)量指紋譜將發(fā)生變化，含糖肽段發(fā)生丟失位移，通過(guò)網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)檢索其序列，找到位點(diǎn)。

10、七、質(zhì)譜在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用七、質(zhì)譜在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用lA、穩(wěn)定同位素代謝標(biāo)記技術(shù)。前面已介紹lB、同位素親和標(biāo)簽技術(shù)ICATICAT專一與專一與CysCys共價(jià)結(jié)合共價(jià)結(jié)合Why 2D LC/MS?可鑒定極端具有pI、疏水性、分子量的蛋白質(zhì)適合膜蛋白重復(fù)性好容易自動(dòng)化上樣量大高靈敏度（溶液酶切）可根據(jù)樣品靈活配置（但最后一維一般為RP）Then why SCX/RP/MS?SCX和RP的分離原理是互補(bǔ)的 SCX按荷電情況，PR按疏水性流動(dòng)相是兼容的 pH3，ACN/water/salt SCX流動(dòng)相中的鹽可以在RP時(shí)有效去除Tryptic peptides 在SCX柱上可以有效保留Tryp

11、tic peptides在SCX條件下是穩(wěn)定的Separation powerPeak capacities2DE 500 - 10,000 protein spotsAffinity Chromatography 2Ion exchange Chromatography 10protein levelGelfiltration 10Reversed Phase Chromatography50Ion Exchange Chromatography 25Reversed Phase Chromatography 100peptide level2DLC (IEX/RPC)2,500Linear

12、 IT MSn18,000 mph*measurements per hourMS/MSMSGelGel spotProteolyticpeptidesMixture of ProteinsDigestionProteolyticpeptidesDigestionLCProtein Identification WorkflowsPeak FindingPeak listSearch of a Sequence CollectionIdentified and ProteinsProtein CandidatesSignificance TestingProtein Function?Sequ

13、ence Similarity SearchRPCIEXRPC trapRPC trapon-line elution by salt plugs to trap columnIEXoff-line gradient elutionwith “classical”fraction collectionRPC2D LC的三種配置形式IEXRPCin-line MudPITon-line 2D-LC優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)全自動(dòng)全自動(dòng)樣品體積可根據(jù)后續(xù)樣品體積可根據(jù)后續(xù)RPC調(diào)整調(diào)整在線脫鹽、濃縮在線脫鹽、濃縮自由選擇緩沖鹽自由選擇緩沖鹽缺點(diǎn)缺點(diǎn)SCX峰容量有限峰容量有限ACN濃度在濃度在IEX和和RPC得一致得

14、一致兩相分離都沒(méi)能在兩相分離都沒(méi)能在最佳狀態(tài)下進(jìn)行最佳狀態(tài)下進(jìn)行RPCIEXRPC trapRPC trapoff-line SCX with fraction collectionn優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)q兩維分離都有可能在最佳狀態(tài)下進(jìn)行，得到最好分辨率和峰容量q可自由選擇緩沖體系q樣品體積可根據(jù)后續(xù)RPC調(diào)整q速度快（只需一個(gè)SCX操作）qSCX餾份可留待以后分析n缺點(diǎn)缺點(diǎn)q自動(dòng)化程度低IEXGradient elutionwith “classical”fraction collectionRPCThe secret behind sensitivityReducing column dimensio

15、ns75 m I.D. columns and 200 nl/min are the standard today scalecolumn I.D.column volumetypical flow rategain in m(100 mm length) ll/minsensitivity analytical4.6001.7001.0001 narrow2.1003502005 micro1.000804021 capillary30074237 nano750.50.23.322 75 m I.D. columns and 200 nl/min are the standard toda

16、yTandem MSData dependent MS/MS 基本原則 先做一次全掃描（full MS)，記錄個(gè)豐度最高的離子 然后依次對(duì)這X個(gè)離子進(jìn)行CID, 做MS/MS(full MS2) 然后再做全掃描, 下一個(gè)data dependent MS/MS開(kāi)始 Dynamic exclusion 某個(gè)離子在做了一定次數(shù)（比如2次）的MS/MS后，將在一定時(shí)間內(nèi)（比如3min）不再作為侯選離子。+多肽的裂解碎片離子的命名 Residue name (A-Z) monoisotopic massaverage massA71.03711 71.0788B114.53493114.59625C1

17、03.00919103.1388D115.02694115.0886E129.04259129.1155F147.06841147.1766G57.02146 57.0520H137.05891137.1412I113.08406113.1595J0.00.0K128.09496128.1742L113.08406113.1595M131.04049131.1925N114.04293114.1039O0.00.0P97.05276 97.1167Q128.05858128.1308R156.10111156.1876S87.0320387.0782T101.04768101.1051U150.95364150.034V99.06841 99.1326W186.07931186.2133X111.0111.0Y163.06333163.1760Z128.55059128.62315氨基酸殘基質(zhì)量CID條件下tryptic peptides裂解規(guī)律mobile proton model在低能CID條件下，tryptic peptides主要產(chǎn)生以y離子和b離子為主的碎片離子此外還經(jīng)?？梢钥吹統(tǒng)離子、b離子中性丟失NH3或H2O的峰脯氨酸（P）殘基N-端側(cè)的肽鍵特別脆弱，因此含P的多肽MS/MS圖譜一般會(huì)有一個(gè)脯氨酸N-端側(cè)的肽鍵斷裂產(chǎn)生的特別強(qiáng)y離子。而脯氨酸（P）殘基C-端側(cè)的