CpG寡核苷酸免疫刺激DNA序列的構效關系分析及其抗腫瘤作用研究

1、CpG寡核苷酸免疫刺激DNA序列的構效關系分析及其抗腫瘤作用研究作為免疫刺激序列 (immunostimulatory sequence，ISS) ，含有非甲基化 CpG 二核苷酸的寡脫氧核苷酸(oligodeoxynucleotides ，ODN能直接激活B細胞、樹 突狀細胞、巨噬細胞、抗原遞呈細胞等；間接激活 T細胞、NK細胞；誘導以Th1 型為主的免疫應答，是一種高效低毒的免疫佐劑。在腫瘤、免疫缺陷性疾病、感 染性疾病及過敏性疾病治療中有著強大的潛在應用價值，CpGODN作為一種新型的免疫刺激劑越來越多地受到人們的關注。CpGODN的免疫刺激活性具有結構特異性，其免疫刺激活性與結構之間的

2、相 關關系仍有許多環(huán)節(jié)尚待闡明：游離的 5'端結構是否免疫刺激活性所必需 ?回 文結構的有無、多寡、堿基構成特征及其在序列中的位置對活性有無影響 ?此外， CpG基序在序列中的數(shù)量、距離遠近、空間連接、5'端的堿基組成對ISS免疫刺激活性的影響也均有待系統(tǒng)研究。CpG ODN勺免疫刺激作用具有種屬特異性， 我們選擇已知有效的小鼠特異性 I S S O D N 1 826為模板和陽性對照，設計了一 系列不同結構的CpG ODNs采用多種生物學方法對所設計 CpG ODN的免疫活性 進行檢測，并基于此進行構效關系分析，總結一些能夠揭示CpGODN免疫刺激作用機制的新規(guī)律，并對新型

3、CpG ODN勺理性設計提供理論和實驗依據(jù)。研究中篩選出了若干條免疫刺激活性優(yōu)于陽性對照 ODN1826勺ISS，對這些 CpGODN在小鼠體內的抗腫瘤活性以及對荷瘤鼠免疫調節(jié)機能的影響進行了系統(tǒng) 的分析。此外，對CpG OD免疫刺激活性的分子機制進行了初步研究。一、以小鼠特異性的B型CpGODN182為模板和陽性對照，設計了 15條CpG ODNs(ODN1ODN5)涉及到CpG基序在序列中的數(shù)量、距離遠近、空間連接，5'端的堿基組成， 回文結構的有無、 回文結構堿基構成特征及其在序列中的位置等 結構變化；所設計CpG ODN作用于小鼠脾細胞，以其對細胞因子IL-6、IL-12 及I

4、FNa等分泌的影響、對B細胞增殖活性、NK細胞殺傷活性的影響等為活性指 標，系統(tǒng)分析CpG ODN的構效關系。結果表明：1）最佳的CpG六堿基作用基序 是5' -TCGACGTT'與文獻報道一致；2）CpG島缺乏兩側翼的雙堿基將失去其 免疫調節(jié)作用，如ODN15 3）CpG基序的數(shù)目最佳為2個，增加六堿基CpG基序 數(shù)量（如ODN9不增加其免疫刺激活性；4）相鄰兩個CpG基序之間的最適距離為3 個堿基，距離的縮短（ODN5或延長（ODN6均會減弱CpGODN勺免疫刺激作用；5）5 ' 端TpC二堿基對于CpGODN勺免疫刺激活性很重要，去掉 5'端TpC二堿基會

5、使 免疫刺激活性明顯減弱，如 ODN、6 ODN；8 6）自身互補的回文結構對于 CpG ODN 的免疫刺激作用很重要，如 ODN4 ODN7 ODN1僑口 ODN11 7）回文結構在序列中 的位置對活性有顯著影響： 3'端回文結構可增強序列的免疫刺激活性，而 5' 端回文結構可導致CpG OD免疫刺激活性幾乎消失，如 ODN3 ODN12值得注意的是，作為全回文結構的ODN1具有較強的免疫刺激活性，其回文 結構中包含完整的CpG作用基序5' -TCGACGTT'如果不包含完整的CpG作用 基序，僅以重復的CpG組成的自身互補的全回文結構幾乎沒有免疫刺激活性，如

6、ODN15二、采用流式細胞術檢測不同結構的 CpGODNS寸特定的免疫細胞B細胞、 DC細胞以及NK細胞的激活功能。將所設計CpGODN與小鼠脾細胞共孵育，然后用流式細胞術檢測 DC細胞、B 細胞以及NK細胞亞群表面分子表達情況，系統(tǒng)分析CpGOD結構與其對各種免疫 細胞活化能力的關系。研究結果顯示與前述構效關系分析結論一致。三、CpG ODN體外抗鼠源性黑色素瘤活性研究。結果表明，經(jīng) CpG0DN(0DN1-1處理的小鼠脾細胞對小鼠黑色素瘤均表現(xiàn)不同程度的殺傷活性， 不 含CpG島的ODN沒有腫瘤殺傷活性；0DN4 0DN7 0DN1僑口 0DN1的抗黑色素瘤 活性明顯高于陽性對照 0DN1

7、82組(P V 0.05)。四、在構效關系分析以及體外抗鼠源性黑色素瘤活性研究的基礎上，選擇CpG0DN的有效序列(0DN1826 0DN4 0DN7 0DN1和0DN11進行小鼠體內外抗腫瘤活性研究。研究發(fā)現(xiàn)，CpG0DN能不同程度延長荷黑色素瘤小鼠的生存時間， 與陽性對照0DN182比較，0DN4 0DN和0DN1 均表現(xiàn)出明顯的腫瘤抑制作用(P V0.05)，0DN10勺作用尤為明顯(P V0.01)，抑瘤率達到(55.2 ± 2.3) %。腫瘤組織切片HE染色顯示，CpG0DN用藥組可觀察到腫瘤細胞出現(xiàn)核空化、核水腫以及凋亡現(xiàn)象， 而核膜清晰可見， 這種現(xiàn)象在腫瘤病理中較少見

8、， 其機理尚待闡明；腫瘤組織免疫組化分析顯示，代表增殖活性的核抗原PCNAfe達降低，表明腫瘤細胞增殖受到抑制；黑色素瘤細胞轉移相關的抗原CD63表達降低，表明瘤細胞轉移受到抑制。脾臟組織切片 HE染色顯示，PBS組荷瘤鼠的脾臟出現(xiàn) 大面積壞死，梗死的脾血管內可見壞死的腫瘤細胞團，而CpGODN臺療組未見瘤細胞轉移。淋巴結病理切片顯示，PBS組荷瘤鼠的淋巴結中出現(xiàn)淋巴導管梗阻，內可見 轉移的瘤細胞團塊，而CpGODN臺療組未見瘤細胞轉移。以上研究結果說明：CpG ODh不僅能夠抑制腫瘤細胞的生長，而且能夠抑制腫瘤細胞在小鼠體內的轉移和 浸潤。五、CpG OD對荷瘤鼠模型體內免疫調節(jié)機能的影響。

9、研究發(fā)現(xiàn)，C57 BL/6小鼠荷黑色素瘤后，血清中 IL-12 的含量顯著降低， IgE 的含量急劇上升，脾臟 中B細胞、T細胞的增殖活性以及NK細胞的殺傷活性均明顯下降，腹腔巨噬細 胞的吞噬功能也明顯減弱，提示腫瘤能夠促使免疫系統(tǒng)Th1/Th2平衡向TH2漂移， 使機體的抗腫瘤免疫效應大大減弱。而CpGODh能誘導荷瘤鼠產(chǎn)生大量的IL-12，抑制IgE的產(chǎn)生，脾臟中B細 胞、T細胞的增殖活性以及NK細胞的殺傷活性均顯著增強，巨噬細胞的吞噬功 能也顯著增強，并且，腫瘤抑制效應越強CpGODN所具有的免疫增強效應也越強， 這兩種效應呈現(xiàn)正相關，這強烈提示 CpG ODNh夠促使Th2型免疫應答向

10、Th1 型逆轉，扭轉因荷瘤導致的機體免疫功能低下， 從而增強機體的抗腫瘤免疫效應。 另外，CpGODh各組荷瘤鼠均出現(xiàn)不同程度的巨脾現(xiàn)象， 病理切片顯示，脾臟紅、 白髓邊界清晰， 可見脾竇輕度充血， 未見病理改變； 淋巴結的病理切片顯示， CpG ODN臺療組淋巴結中淋巴小結清晰可辨，淋巴細胞數(shù)量豐富，淋巴竇擴張；治療 組腫瘤組織免疫組化分析顯示，腫瘤細胞表面共刺激分子CD80的表達增強，以上結果充分說明機體的抗腫瘤免疫效應增強。實驗數(shù)據(jù)顯示，ODN4 ODN和ODN1 的抗腫瘤免疫效應均高于陽性對照 ODN1826(R 0.05)，而具有全回文結構的 ODN10乍用尤為明顯(P V 0.01

11、)。六、 為進一步探討CpGODNfe疫刺激活性的機理，檢測了不同結構的CpGODN(ODN1826 ODN1昏口 ODN11對核轉錄因子NF-k B、AP1的轉錄活性影響，同時檢測了上述不 同結構的CpG ODI與TLR9的結合活性。CpG OD通過TLR9介導的多種信號轉導途徑來調節(jié)核轉錄因子的表達，如 NF-k B AP1等，從而進一步調節(jié)免疫相關的多種細胞因子的表達，最終實現(xiàn)CpGODN勺免疫調節(jié)功能。EMSAK驗結果表明，不同結構的CpGODN能不同程度地上 調NF-k B及API的轉錄活性，ODN1能誘導NF-k B的表達，但其作用低于ODN1826或ODN10但ODN1誘導AP1

12、的活性高于 ODN182或ODN10前面提到的ODN10 促使IL-12的高表達可能與其對AP1的高轉錄活性有關。TLR9是介導CpGODN實現(xiàn)免疫調節(jié)活性的重要受體，我們將ODN1820ODN1O 和ODN1進行5'端生物素標記，然后分別與TLR9結合，發(fā)現(xiàn)三種結構的CpGODN 均能與TLR9結合，表明5'端被生物素封閉后仍然可以與 TLR9結合，這與先前 許多報道CpG OD與 TLR9的識別是從5'端到3'端依次進行的，CpG ODN 5 端的游離很重要的說法不一致。這提示我們，除了TLR9之外，CpG OD可能還需要結合另一種未知的相關受體，其結合需要 Cp