熒光定量PCR的流程原理分析與應(yīng)用PPT課件

1、熒光定量熒光定量 PCR PCR 的流程，原理，分析與應(yīng)用的流程，原理，分析與應(yīng)用蔡振榮蔡振榮羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司熒光定量熒光定量 PCR PCR 基于 PCR 技術(shù) 擴增的同時對目標(biāo)基因定量 英文別名： Real-time PCR Quantitative PCR Kinetic PCR總覽總覽 熒光定量熒光定量 PCR PCR 的完整流程的完整流程 手動與自動核酸提取 逆轉(zhuǎn)錄 熒光定量 PCR 熒光定量熒光定量 PCR PCR 的原理的原理 檢測方法檢測方法 SYBR Green I, TaqMan Probes,. 分析分析 絕對定量 Absolute

2、 Quantification 相對定量 Relative Quantification 羅氏熒光定量產(chǎn)品介紹羅氏熒光定量產(chǎn)品介紹完整的流程完整的流程樣品制備 核酸分離 逆轉(zhuǎn)錄 擴增 檢測完整的流程完整的流程 核酸純化核酸純化 High Pure 硅吸附技術(shù) 核酸在接合液 (Binding Buffer) 環(huán)境下會吸附在硅材料表面。RNA PurificationRNA PurificationHigh Pure RNA Isolation KitHigh Pure RNA Tissue KitHigh Pure FFPE RNA Micro KitHigh Pure RNA Paraffin

3、 KitHigh Pure Viral RNA KitHigh Pure miRNA Isolation KitDNA PurificationDNA PurificationHigh Pure PCR Template Preparation KitHigh Pure Viral Nucleic Acid KitHigh Pure Viral Nucleic Acid Large Volume KitHigh Pure 16 System Viral Nucleic Acid Kit完整的流程完整的流程 自動核酸純化自動核酸純化 MagNa Pure LC2.0 MagNa Pure Com

4、pact MagNa Pure 96 優(yōu)點： 高通量 處理各種來源的樣品及各種核酸 快速的分離，簡單設(shè)置，全過程小于1小時完整的流程完整的流程 RT-PCR RT-PCR Transcriptor 1st Strand cDNA Synthesis Kit Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄全長cDNA至14kb 檢測低至 100pg RNA (10pg for High Fidelity) 在55oC有效的反轉(zhuǎn)錄正常及高GC含量的 RNA 具有RNase H活性 其他產(chǎn)品: 1st Strand cDNA Synthesis K

5、it for RT-PCR (AMV) cDNA Synthesis System LightCycler RNA Pre-Amplification Kit完整的流程完整的流程RNA PurificationRNA PurificationHigh Pure RNA Isolation KitHigh Pure RNA Tissue KitHigh Pure FFPE RNA Micro KitHigh Pure RNA Paraffin KitHigh Pure Viral RNA KitHigh Pure miRNA Isolation KitTriPure RNA Isolation

6、KitmRNA Capture KitmRNA Isolation KitmRNA Isolation Kit for Blood/Bone MarrowDNA PurificationDNA PurificationHigh Pure PCR Template Preparation KitDNA Isolation Kit for Cells and TissuesDNA Isolation Kit for Mammalian BloodHigh Pure Viral Nucleic Acid KitHigh Pure Viral Nucleic Acid Large Volume Kit

7、High Pure 16 System Viral Nucleic Acid KitRT-PCRRT-PCRTranscriptor 1st Strand cDNA Synthesis KitTranscriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit1st Strand cDNA Synthesis Kit for RT-PCR (AMV)cDNA Synthesis SystemLightCycler RNA Pre-Amplification Kit總覽總覽 定量定量 PCR PCR 的完整流程的完整流程 手動與自動核酸提取 逆轉(zhuǎn)錄 熒光定量 PCR 熒光定

8、量熒光定量 PCR PCR 的原理的原理 PCR 的原理 熒光定量 PCR 與常規(guī) PCR 的比較 檢測方法檢測方法 分析分析 羅氏熒光定量產(chǎn)品介紹羅氏熒光定量產(chǎn)品介紹實時定量實時定量PCR技術(shù)：技術(shù)：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系對起始模板進行定量分析與常規(guī)與常規(guī) PCR技術(shù)比較：技術(shù)比較：對PCR擴增反應(yīng)的終點產(chǎn)物進行定量和定性分析，無法對起始模板準(zhǔn)確定量，無法對擴增反應(yīng)實時檢測熒光定量熒光定量PCRPCR原理定義原理定義+ 擴增曲線擴增曲線+ 熒光閾值熒光閾值+ Ct值值熒光定量熒光定量PCRPCR原理常用名詞概念原理常用

9、名詞概念Cycle（循環(huán)數(shù)）（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強度）（熒光強度）BaselineLgliner phase平臺期平臺期熒光基團熒光檢測元件熒光定量熒光定量PCRPCR原理擴增曲線原理擴增曲線Cycle（循環(huán)（循環(huán)數(shù)）數(shù)）Rn（熒光強度）（熒光強度）BaselineLgliner phase1 前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline）1 熒光閾值的缺省設(shè)置是315個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍1 手動設(shè)置：大于熒光背景值和陰性對照的熒光最高值；進入指數(shù)期的最初階段1 真正的信號:熒光信號超過閾值Threshold熒光定量熒光定量PCRPCR原理熒光閾值原理熒光閾值平臺期平臺期C

10、t值的定義：值的定義： PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)Cycle（循環(huán)數(shù)）（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強度）（熒光強度）Ct value 熒光定量熒光定量PCRPCR原理原理CtCt值值橫軸：橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號量縱軸：熒光信號量CtCt值的特點：值的特點：相同模板進行96次擴增，終點處產(chǎn)物量不恒定；Ct值極具重現(xiàn)性CtCt值的重現(xiàn)性值的重現(xiàn)性理想的PCR反應(yīng)XnX0 2n*Xn：第：第n次循環(huán)后擴增產(chǎn)物數(shù)量次循環(huán)后擴增產(chǎn)物數(shù)量X0 ：起始模板數(shù)量：起始模板數(shù)量n：擴增循環(huán)數(shù)：擴增循環(huán)數(shù)熒光定量熒光定量PCRPCR原理原理CtCt值定

11、量的數(shù)學(xué)原理值定量的數(shù)學(xué)原理非理想的PCR反應(yīng)XnX0 （1En）n*Xn：第：第n次循環(huán)后擴增產(chǎn)物數(shù)量次循環(huán)后擴增產(chǎn)物數(shù)量X0 ：起始模板數(shù)量：起始模板數(shù)量n：擴增循環(huán)數(shù)：擴增循環(huán)數(shù)En：擴增效率：擴增效率熒光定量熒光定量PCRPCR原理原理CtCt值定量的數(shù)學(xué)原理值定量的數(shù)學(xué)原理在擴增產(chǎn)物達到熒光閾值時XCtX0 （1En）CtM （1）*XCt ：熒光擴增信號達到閾值時擴增產(chǎn)物的量，在閾值設(shè)定以后，它是一個常數(shù)，：熒光擴增信號達到閾值時擴增產(chǎn)物的量，在閾值設(shè)定以后，它是一個常數(shù)，定為定為M方程式（1）兩邊同取對數(shù)得：Log2MLog2X0 *（1En）Ct （2）整理方程式（2）：Log

12、2X0 Log 2M Ct Log2（1En）熒光定量熒光定量PCRPCR原理原理CtCt值定量的數(shù)學(xué)原理值定量的數(shù)學(xué)原理Cycle numberCk 104Ck 102SampleLg of DNA concentration0 模板DNA量越多，熒光達到閾值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。0 Log模板起始濃度與Ct值呈線性關(guān)系。熒光定量熒光定量PCRPCR原理原理CtCt值與模板起始量的關(guān)系值與模板起始量的關(guān)系線性關(guān)系、擴增效率確認(rèn)線性關(guān)系、擴增效率確認(rèn)檢測靈敏度確認(rèn)檢測靈敏度確認(rèn)No template controlNo template control確認(rèn)確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率:

13、-3 : -3 -3.5 -3.535Cycles35Cycles內(nèi)可得到好的定量結(jié)果內(nèi)可得到好的定量結(jié)果如果采用如果采用SYBRSYBR檢測方法，檢測方法，30Cycles30Cycles內(nèi)無非特異性產(chǎn)物擴內(nèi)無非特異性產(chǎn)物擴增增35 Cycles35 Cycles內(nèi)無引物二聚體產(chǎn)生內(nèi)無引物二聚體產(chǎn)生相關(guān)系數(shù)（相關(guān)系數(shù)（R R2 2）：大于）：大于0.980.98熒光定量熒光定量PCRPCR反應(yīng)性的確認(rèn)反應(yīng)性的確認(rèn)PCRPCR擴增效率（擴增效率（E E）:0.9-1.2:0.9-1.2總覽總覽 定量定量PCRPCR的完整流程的完整流程 熒光定量熒光定量PCRPCR的原理的原理 檢測方法檢測方法

14、 熒光染料： SYBR Green I ResoLight 探針： TaqMan Probes 分析分析 羅氏熒光定量產(chǎn)品介紹羅氏熒光定量產(chǎn)品介紹檢測方法檢測方法 熒光染料熒光染料 SYBR Green ISYBR Green I 不依賴于序列 不飽和不飽和 dsDNA 結(jié)合染料 激發(fā): 488nm; 發(fā)射: 533nm 在擴增循環(huán)（延伸）和熔解曲線過程中檢測AnnealingElongationEnd of Elongation 退火延伸結(jié)束時延伸檢測方法檢測方法 熒光染料熒光染料 ResoLight 不依賴于序列 飽和飽和的 dsDNA 結(jié)合染料 激發(fā): 488nm, 發(fā)射: 533nm

15、在熔解曲線過程中檢測SYBR Green ISYBR Green I峰形不夠敏銳不能區(qū)分純合子與雜合子序列Saturating dyesSaturating dyes均一的，敏銳的峰形只有序列的差別造成峰位變化，染料本身不影響峰位純合子 homoduplexes雜合子 heteroduplexesV VS Svsvs檢測方法檢測方法 探針探針 水解探針?biāo)馓结?(Hydrolysis Probes): (Hydrolysis Probes): TaqMan Probes, Universal ProbeLibrary Probes 熒光素與淬滅劑 聚合酶的 5 核酸酶活性將熒光素從探針上釋放

16、在擴增循環(huán)（延伸）中檢測信號延伸結(jié)束延伸變性退火Example: FAMExc. 465nmEmi. 510nm淬滅劑淬滅劑檢測檢測總覽總覽熒光定量熒光定量 PCR PCR 的完整流程的完整流程熒光定量熒光定量 PCR PCR 的原理的原理檢測方法檢測方法 SYBR Green I, ResoLight, TaqMan Probes, HybProbes 分析分析 定性分析 判斷目的基因是否存在 Tm 值 定量分析 絕對定量 Absolute Quantification 相對定量 Relative Quantification 羅氏熒光定量產(chǎn)品介紹羅氏熒光定量產(chǎn)品介紹分析分析 總覽總覽擴增分

17、析擴增分析定性檢測定量檢測熔解曲線分析熔解曲線分析產(chǎn)物鑒定突變檢測基因掃描Dye 1Dye 1Dye 2Dye 2終點檢測終點檢測 (Endpoint) (Endpoint)基因分型 (Genotyping)定性檢測定性檢測 確定目的基因是否存在 結(jié)果以“是/否”給出 需要設(shè)定陽性及陰性對照 SYBR Green I 染料 在擴增循環(huán)中檢測使用熔解曲線的使用熔解曲線的 Tm Calling Tm Calling 熔解曲線 Tm: 有50% DNA 發(fā)生熔解的溫度 熔解曲線的用途: Tm calling 目的基因的確認(rèn) 判斷是否有引物二具體的存在融解曲線分析，單一融解曲線分析，單一峰無非特異性熒

18、光峰無非特異性熒光定量準(zhǔn)確定量準(zhǔn)確融解曲線分析，出現(xiàn)雜融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準(zhǔn)性熒光，因此定量不準(zhǔn)確確SYBR Green ISYBR Green I染料法染料法融解曲線融解曲線定量實驗的原理定量實驗的原理目標(biāo)基因拷貝數(shù)很多 熒光值開始增加較早Cp值小絕對定量絕對定量 用于鑒定病原體或所研究基因的存在與否 用于檢測病原體基因的拷貝數(shù)或濃度絕對定量絕對定量 未知樣本的濃度由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出CyclesFluorescence標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品FluorescenceTarget未知樣品未知樣品CyclesCrossing PointLog Conce

19、ntration標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果結(jié)果絕對數(shù)值 (e.g. 拷貝數(shù))相對定量的必要性相對定量的必要性相對定量相對定量 原理：比較同一樣品中不同基因的表達量 用于檢測復(fù)雜實驗處理中細(xì)微的基因表達的變化 用于長期實驗及不同實驗體系中所得數(shù)據(jù)的比較 一個參照樣本 一個或一個以上的未知樣本 一個目的基因 管家基因用來校對不同樣本之間目的基因的實際表達量 重復(fù)反應(yīng)孔 建議每個樣本使用三個或更多重復(fù)反應(yīng)，以確保統(tǒng)計顯著性。 標(biāo)記方法的選擇SYBR Green法或探針法均可。 實驗結(jié)果顯示擴增曲線；標(biāo)準(zhǔn)曲線（有些分析方法不需要）；融解曲線（探針法不需要）。 一組標(biāo)準(zhǔn)樣本（有些分析方法不需要）相對定量分析幾

20、要素相對定量分析幾要素相對定量分析相對定量分析管家基因篩選管家基因篩選P P P P P P O O 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法 2 -Ct法法 相對定量分析相對定量分析兩種常用的分析方法兩種常用的分析方法 通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對對照樣品、待測樣品的目的基因及管家基因進行定量，然后根據(jù)通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對對照樣品、待測樣品的目的基因及管家基因進行定量，然后根據(jù)計算公式求得相對值即為相對表達量。計算公式求得相對值即為相對表達量。 相對值相對值= =校正值校正值= =目的基因定量結(jié)果目的基因定量結(jié)果管家基因定量結(jié)果管家基因定量結(jié)果待測樣品的校正值待測樣品的校正值對照樣品的校正值對照樣品的校正值相對定量分析相對定量

21、分析雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法公式：公式：優(yōu)點：分析簡單，實驗優(yōu)化相對簡單優(yōu)點：分析簡單，實驗優(yōu)化相對簡單缺點：對每一個基因，每一輪實驗都必需做標(biāo)準(zhǔn)曲線缺點：對每一個基因，每一輪實驗都必需做標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)用：基因表達調(diào)控研究中最常用與公認(rèn)的兩種相對定量方法之應(yīng)用：基因表達調(diào)控研究中最常用與公認(rèn)的兩種相對定量方法之一一相對定量分析相對定量分析雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法檢測樣品檢測樣品管家基因管家基因H H目的基因目的基因X X定量結(jié)果定量結(jié)果定量結(jié)果定量結(jié)果校正值校正值相對量相對量對照樣品對照樣品6391.56391.5343.4343.40.05370.05371.0001.000待測樣品待測樣品1

22、18589.78589.717.317.30.00200.00200.0370.037待測樣品待測樣品2 27432.97432.91946.11946.10.26180.26184.8744.874實驗數(shù)據(jù)實驗數(shù)據(jù)相對定量相對定量 Step 1: 計算出同一樣品中目的基因和參考基因的Cp值 Step 2: 最終結(jié)果用目的基因的濃度比上參考基因濃度結(jié)果表達為目標(biāo)基因濃度與參比基因濃度的比值相對定量相對定量 參考基因 “看家”基因 Housekeeping genes: 編碼有基礎(chǔ)細(xì)胞功能的蛋白質(zhì)使用標(biāo)準(zhǔn)曲線的相對定量使用標(biāo)準(zhǔn)曲線的相對定量使用校準(zhǔn)品的相對定量使用校準(zhǔn)品的相對定量 校準(zhǔn)品 Cal

23、ibrator 提供幾次實驗中的校準(zhǔn)點，校正不同次實驗間以及不同批號間的差異 校正目的基因和參考基因的檢測靈敏度的區(qū)別，已經(jīng)長期實驗中的間次差別 校準(zhǔn)品可以是： 沒有處理的樣品 在處理前時刻的樣品 (at time 0) 正常的組織熒光定量熒光定量 PCR PCR 的完整流程的完整流程熒光定量熒光定量 PCR PCR 的原理的原理檢測方法檢測方法 SYBR Green I, ResoLight, TaqMan Probes, HybProbes 分析分析 定性分析 判斷目的基因是否存在 Tm 值 定量分析 絕對定量 Absolute Quantification 相對定量 Relative Quantification 羅