三、微生物限度檢查法

1、微生物限度檢查法微生物限度檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。檢 查項(xiàng)目包括細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌檢查。微牛物限度檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi) 進(jìn)行。檢驗(yàn)全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止再污染。單向流空氣區(qū)域、工作臺面及環(huán)境 應(yīng)定期按醫(yī)約工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn) 進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證。供試品檢杳時(shí)，如果使用了表面活性劑、中和劑或滅活劑，應(yīng)證明其有效性及對微牛物 無毒恨除另有規(guī)定外，本檢查法屮細(xì)菌及控制菌培養(yǎng)溫度為30°c35°c；霉菌、酵母菌培養(yǎng) 溫度為23&#

2、176;c28°c。檢驗(yàn)結(jié)果以lg、1ml、10g> 10ml 10cm2為單位報(bào)告，特殊品種可以最小包裝單位報(bào) 告。檢驗(yàn)量即一次試驗(yàn)所用的供試品量（£、ml或cm?）。除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗(yàn)量為10g或10ml；膜劑為100cm2；貴重藥品、微量 包裝藥品的檢驗(yàn)量可以酌減。要求檢查沙門菌的供試品，其檢驗(yàn)量應(yīng)增加20g或20ml （其 中10g用于陽性對照試驗(yàn)）。檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)從2個(gè)以上故小包裝單位中抽取供試品，大蜜丸述不得少于4丸，膜劑述不 得少于4片。一般應(yīng)隨機(jī)抽取不少于檢驗(yàn)用量（兩個(gè)以上最小包裝單位）的3倍量供試品。供試液的制備根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特

3、性，采取適宜的方法制備供試液。供試液制備若需加 溫時(shí)，應(yīng)均勻加熱，且溫度不應(yīng)超過45°c。供試液從制備至加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基，不得超過1 小時(shí)。除另有規(guī)定外，常用的供試液制備方法如下。1 液體供試品取供試品10ml,加ph7.0無菌氯化鈉蛋白丿陳緩沖液至100ml,混勻，作為1 ： 10的供 試液。汕劑可加入適量的無菌聚山梨酯80使供試品分散均勻。水溶性液體制劑也可用混合 的供試品原液作為供試液。2.固體、半固體或黏稠性供試品取供試品10g,加ph7.0無菌氯化鈉-蛋口腺緩沖液至100ml,用勻漿儀或其他適宜的方 法，混勻，作為1 : 10的供試液。必要時(shí)加適量的無菌聚山梨酯80,并置水

4、浴中適當(dāng)加溫 使供試甜分散均勻。3需用特殊供試液制備方法的供試品（1）非水溶性供試品方法1取供試品5g （或5ml）,加至含溶化的（溫度不超過45°c） 5g司盤80、3g單硬脂酸h油酯、log聚山梨酯80無菌混合物的燒杯中，用無菌玻棒攪拌成團(tuán)后，慢慢加入 45°c的ph7.0無菌氯化鈉蛋白腺緩沖液至100ml,邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為1 : 20的供試液。方法2取供試品10g,加至含20ml無菌十四烷酸異內(nèi)酯（制法見附錄x11ib無菌檢查 法中供試品的無菌檢杳項(xiàng)下）和無菌玻璃珠的適立容器中，必要時(shí)可增加十四烷酸異內(nèi)酯的 用量，充分振搖，使供試品溶解。然后加入45

5、°c的ph7.0無菌氯化鈉蛋白豚緩沖液100ml, 振搖510分鐘，萃取，靜置使汕水明顯分層，取其水層作為1： 10的供試液。（2）膜劑供試品取供試100cm2,剪碎，力n 100ml的ph7.0無菌氯化鈉-蛋白腺緩沖液（必要時(shí)可增加 稀釋液），浸泡，振搖，作為1 :10的供試液。（3）腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品取供試品10g,加ph6.8無菌磷酸鹽緩沖液（川于腸溶制劑）或ph7.6無菌磷酸鹽緩沖 液（用于結(jié)腸溶制劑）至100ml,置45°c水浴中，振搖，使溶解，作為1 : 10的供試液。（4）氣霧劑、噴霧劑供試品取規(guī)定量供試品，置冰凍室冷凍約1小時(shí)，取出，迅速消毒供試品開啟部

6、位，用無菌鋼 錐在該部位鉆一小孔，放至室溫，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)容器，使拋射劑緩緩全部釋出。用無菌注射器 吸出全部藥液，加至適量的ph7.0無菌氯化鈉蛋白j東緩沖液（若含非水溶性成分，加適量 的無菌聚山梨酯80）中，混勻，取相當(dāng)丁70g或10ml的供試品，再稀釋成1： 10的供試液。（5）貼膏劑供試品取規(guī)定最供試品，去掉貼膏劑的保護(hù)層，放置在無菌玻璃或須料片上，粘貼面朝上。用 適宜的無菌多孔材料（如無菌紗布）覆蓋貼劑的粘貼面以避免貼劑粘貼在一起。然后將其置 于適宜體積并含有表而活性劑（如聚山梨酯80或卵磷脂）的稀釋劑中，用力振蕩至少30 分鐘，制成供試液。貼膏劑也可以其他適宜的方法制備成供試液。（6）具

7、抑菌活性的供試品當(dāng)供試品有抑菌活性時(shí)，采用下列方法進(jìn)行處理，以消除供試液的抑菌活性后，再依法 檢查。常用的方法如下。 培養(yǎng)基稀釋法 取規(guī)定量的供試液，至較大最的培養(yǎng)基中，使單位體枳內(nèi)的供試品含 量減少，至不含抑菌作用。測立細(xì)菌、霉菌及酵母菌的菌數(shù)時(shí)，取同稀釋級的供試液2ml, 每1ml供試液可等量分注多個(gè)平川l,傾注瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。每lml 供試液所注的平j(luò)iil中牛反的菌數(shù)z和即為lml的菌落數(shù)，計(jì)算每lml供試液的平均菌落數(shù), 按平皿法計(jì)數(shù)規(guī)則報(bào)告菌數(shù)；控制菌-檢查時(shí)，可加大增菌培養(yǎng)基的用量。 離心沉淀法 取一定量的供試液，500轉(zhuǎn)/分離心3分鐘，取全部上清液混合，用

8、于細(xì)菌檢查。 薄膜過濾法 見細(xì)菌、密菌及酵母菌計(jì)數(shù)項(xiàng)下的“薄膜過濾法”。 中和法凡含汞、砂或防腐劑等具有抑菌作用的供試品，可用適宜的中和劑或滅活劑 消除其抑菌成分。小和劑或滅活劑可加在所用的稀釋液或培養(yǎng)基中。細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)ctu計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢査細(xì)菌、密菌及酵母菌計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基應(yīng)迓行培養(yǎng)基的適川性檢查，成品培養(yǎng)基、由脫水 培養(yǎng)基或按培養(yǎng)棊處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)檢查。菌種 試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第 0代）。試驗(yàn)用菌種應(yīng)采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗(yàn)菌株的牛物學(xué)特性。大腸埃希菌(escherichia coli) (cmcc (b

9、) 44 102)金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus) (cmcc (b)26 003)枯草芽砲桿菌(bacillus subtil is) (cmcc (b) 63 501)白色念珠菌(candida albicans) (cmcc (f) 98 001)黑曲霉(.aspergillus niger) (cmcc (f) 98 003)菌液制備 接種人腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯 培養(yǎng)基或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小吋；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁 培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)棊中，培養(yǎng)2448小吋。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化

10、鈉溶液制 成每1ml含菌數(shù)為50loocfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改肚馬丁瓊脂斜血培 養(yǎng)基中，培養(yǎng)57天，加入35ml含0.05% (v/v)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液, 將抱子洗脫。然厲，用適宜方法吸出抱子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05% (v/v)聚山梨酯 80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每lml含抱子數(shù)50loocfu的砲子懸液。菌懸液在室溫下放置應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使川，若保存在28°c可在24小時(shí)內(nèi)使川。黑曲霧 砲子懸液可保存在28°c,在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)使用。適用性檢查収大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌各50loocfu,分別注入 無菌平皿

11、中，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，混勻，凝固，置 3035°c培養(yǎng)48小時(shí)，計(jì)數(shù);取白色念珠菌、黑曲霉各50loocfu,分別注入無菌平皿中, 立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，混勻，凝固，置2328°c 培養(yǎng)72小時(shí)，計(jì)數(shù)；取白色念珠菌50loocfu,注入無菌平皿中，立即傾注酵母浸出粉腺 葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,平行制備2個(gè)平皿,混勻，凝固，置2328°c培養(yǎng)72小時(shí)，計(jì)數(shù)。同 時(shí)，用相應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)。結(jié)果判定被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對照培養(yǎng)棊上的菌落平均數(shù)的比值大于70%, 且菌落形態(tài)大小應(yīng)與

12、對照培養(yǎng)棊上的菌落一致。判該培養(yǎng)慕的適用性檢查符合規(guī)定。計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證當(dāng)建立產(chǎn)品的微牛物限度檢杳法時(shí)，應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證，以確 認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)的測定。若產(chǎn)品的組分或原檢驗(yàn)條件 發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，計(jì)數(shù)方法應(yīng)垂新驗(yàn)證。驗(yàn)證時(shí)，按供試液的制備和細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)所規(guī)定的方法及下列要求進(jìn)行。對 各試驗(yàn)菌的回收率應(yīng)逐-進(jìn)行驗(yàn)證。菌種及菌液制備同計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢査驗(yàn)證方法驗(yàn)證試驗(yàn)至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算各試驗(yàn)菌每次試驗(yàn)的回收率。(1) 試驗(yàn)組 平皿法計(jì)數(shù)時(shí)，取試驗(yàn)可能用的最低稀釋級供試液lml和50loocfu試 驗(yàn)菌

13、，分別注入平川l中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平川l,按平.iiil法測 定其菌數(shù)。薄膜過濾法計(jì)數(shù)時(shí)，取規(guī)定量試驗(yàn)可能川的最低稀釋級供試液，過濾，沖洗，在 最后一次的沖洗液中加入50loocfu試驗(yàn)菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌數(shù)。(2) 菌液組 測定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。(3) 供試品對照組 取規(guī)定量供試液，按菌落計(jì)數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)。(4) 稀禪劑對照組若供試液制備需要分散、乳化、屮和、離心或薄膜過濾等特殊處理 時(shí)，應(yīng)增加稀釋劑對照組，以考察供試液制備過程中微牛物受影響的程度。試驗(yàn)時(shí)，可用相 應(yīng)的稀釋液替代供試品，加入試驗(yàn)菌，使最終菌濃度為每lml供試液含50loocfu,

14、按試 驗(yàn)組的供試液制備方法和菌落計(jì)數(shù)方法測定其菌數(shù)。結(jié)果判斷 在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)屮，稀釋劑對照組的菌回收率(稀釋劑對照組的平均 菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率)應(yīng)均不低于70%o若試驗(yàn)組的菌回收率(試驗(yàn)組的 平均菌落數(shù)減去供試陽對照紐的平均菌落數(shù)的值占菌液紐的平均茵落數(shù)的百分率）均不低于 70%,照該供試液制備方法和計(jì)數(shù)法測定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)；若任一次試驗(yàn)中 試驗(yàn)組的菌回收率低t70%,應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法、中和法（表 1）籌方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。表1常見干擾物的中和劑或滅活方法干擾物可選用的中和劑或滅活劑戊二醛

15、亞硫酸氫鈉酚類、乙醇、吸附物稀釋法醛類稀釋法、h氨酸、硫代硫酸鹽季錢類化合物（qacs）、對疑基苯甲酸酯、卵磷脂、聚山梨酯汞類制劑亞硫酸氫納、硫某乙酸鹽、硫代硫酸鹽雙肌類化合物卵磷脂碘酒、洗必泰類聚山梨酯鹵化物硫代硫酸鹽乙二胺四乙酸（edta）鎂或鈣離子磺胺類對氨基苯甲酸b 內(nèi)酰胺類抗生索b 內(nèi)酰胺酶若沒有適宜的方法消除供試品屮的抑菌作川，那么驗(yàn)證試驗(yàn)屮微生物回收的失敗可看成 是因供試品的抗菌活性引起的，同時(shí)表明該供試品不能被試驗(yàn)菌污染。但是，供試品也可能 僅對試驗(yàn)用菌株具有抑制作用，而對其他菌株沒有抑制作用。因此，根據(jù)供試品須符合的微 生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報(bào)告規(guī)則，在不影響檢驗(yàn)結(jié)果判斷的前提下

16、，應(yīng)采用能使微生物生長的 更窩稀禪級的供試液進(jìn)行方法驗(yàn)證試驗(yàn)。若驗(yàn)證試驗(yàn)符合要求，應(yīng)以該稀釋級供試液作為最 低稀釋級的供試液進(jìn)行供試品檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證吋，采用上述方法若還存在一株或多株試驗(yàn)菌的冋收率達(dá)不到要求，那么 選擇回收情況最接近要求的方法和試驗(yàn)條件進(jìn)行供試品的檢驗(yàn)。驗(yàn)證試驗(yàn)也可與供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)同時(shí)進(jìn)行。供試品檢查計(jì)數(shù)方法包括平皿法和薄膜過濾法。檢查時(shí)，按已驗(yàn)證的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行供試品的細(xì)菌、 霉菌及酵母菌菌數(shù)的測定。按計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證試驗(yàn)確認(rèn)的程序進(jìn)行供試液制備。用稀釋液稀釋成1 ： 10、1 :102、1 : 103等稀釋級的供試液。1.平皿法取供試液lml,置直徑90mm

17、的無菌平皿屮，注入1520ml溫度不超過45°c的溶化的 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫魂紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉腺葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒 置培養(yǎng)。每稀釋級每種培養(yǎng)基至少制備2個(gè)平板。陰性對照試驗(yàn) 取試驗(yàn)用的稀釋液lml,置無菌平皿中，注入培養(yǎng)基，凝固，倒置培養(yǎng)。 每種計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個(gè)平板，均不得有菌生長。培養(yǎng)和計(jì)數(shù) 除另有規(guī)定外，細(xì)菌培養(yǎng)3天，霉菌、酵母菌培養(yǎng)5天。逐日觀察菌落生 長情況；點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。必要時(shí),可適當(dāng)延長培養(yǎng)時(shí)間至7天進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并報(bào)告。菌落蔓延 牛長成片的平板不宜計(jì)數(shù)。點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)后,計(jì)算各稀釋級供試液的平均菌落數(shù),按菌數(shù)報(bào)告 規(guī)則報(bào)告菌數(shù)。若同稀釋級兩個(gè)平板

18、的菌落平均數(shù)不小于15,則兩個(gè)平板的菌落數(shù)不能相 差1倍或以上。-般營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基川于細(xì)菌計(jì)數(shù)；玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基川于霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)；酵母 浸出粉腺匍萄糖瓊脂培養(yǎng)基川于酵母菌計(jì)數(shù)。在特姝情況下，若營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)棊上長令霉菌 和酵母菌、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上長有細(xì)菌，則應(yīng)分別點(diǎn)計(jì)霉菌和酵母菌、細(xì)菌菌落數(shù)。然 后將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的霉菌和酵母菌數(shù)或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上的細(xì)菌數(shù)，與玫瑰紅鈉瓊 脂培養(yǎng)基中的鎧菌和酵母菌數(shù)或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的細(xì)菌數(shù)進(jìn)行比較，以菌落數(shù)高的培養(yǎng)基 中的菌數(shù)為計(jì)數(shù)結(jié)果。含蜂蜜、王漿的液體制劑，用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基測定霉菌數(shù)，用酵 母浸出粉月東葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基測定酵母菌數(shù)，合并計(jì)

19、數(shù)。菌數(shù)報(bào)告規(guī)則 細(xì)菌、酵母菌宜選取平均菌落數(shù)小于300cfu、霉菌宜選取平均菌落數(shù)小 于loocfu的稀釋級，作為菌數(shù)報(bào)告(取兩位有效數(shù)字)的依據(jù)。以最高的平均菌落數(shù)乘以 稀釋倍數(shù)的值報(bào)告lg. iml或10cm2供試品中所含的菌數(shù)。如各稀釋級的平板均無菌落牛長，或僅故低稀釋級的平板有菌落牛長，但平均菌落數(shù)小 于1時(shí)，以1乘以授低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。2薄膜過濾法采用薄膜過濾法，濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45 um,直徑一般為50mm,若采用其它直徑的 濾膜，沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。選擇濾膜材質(zhì)時(shí)應(yīng)保證供試品及其溶劑不影響微生物的充 分被截留。濾器及濾膜使川前應(yīng)采川適宜的方法滅菌。使用時(shí)，應(yīng)保證濾

20、膜在過濾前后的完 整性。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾 器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最人過濾效率，應(yīng)注意保持供試晶溶液及沖洗液覆需 整個(gè)濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要川沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜侮次沖洗暈不超 過100ml，總沖洗量不得超過1000ml,以避免濾膜上的微生物受損傷。取相當(dāng)丁每張濾膜含lg、1ml或locm?供試品的供試液，加至適量的稀釋劑中，混勻， 過濾；若供試品每遼、1ml或locn?所含的菌數(shù)較多時(shí)，可取適宜稀釋級的供試液lml進(jìn)行 試驗(yàn)。用ph7.0無菌氯化鈉蛋白腺緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜，沖洗方法和沖洗 量同

21、“計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證”。沖洗后取出濾膜，菌ini朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫塊紅鈉瓊脂 培養(yǎng)基或酵母浸出粉月東葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。陰性對照試驗(yàn) 取試驗(yàn)用的稀釋液lml照上述薄膜過濾法操作，作為陰性對照。陰性對 照不得有菌牛長。培養(yǎng)和計(jì)數(shù) 培養(yǎng)條件和計(jì)數(shù)方法同平皿法，每片濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過100個(gè)。菌數(shù)報(bào)告規(guī)則 以相當(dāng)于lg lml或locrn?供試品的菌落數(shù)報(bào)告菌數(shù)；若濾膜上無菌落 生長，以l報(bào)告菌數(shù)(每張濾膜過濾臨、lml或locm?供試品)，或vi乘以最低稀釋倍數(shù) 的值報(bào)告菌數(shù)?？刂凭鷻z查控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查控制菌檢查川的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基的適用

22、性檢查，成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按培 養(yǎng)基處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)檢查。檢查項(xiàng)tl包括培養(yǎng)基的促牛長、指示和抑制特性能力。菌種對試驗(yàn)菌種的要求同計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查。大腸埃希菌(escherichia coli) (cmcc (b)44 102)金黃色箭萄球菌(staphylococcus aureus) (cmcc (b) 26 003) 乙型副傷寒沙門菌(salmonella paratyphi b) (cmcc (b) 50 094) 銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa) (cmcc (b)10 104)牛孑包梭菌(clostridium sporogenws)

23、(cmcc (b)64 941)白色念珠w (candida albicans) (cmcc (f) 98 001)菌液制備 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新 鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)棊屮，生砲梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醉酸鹽流體 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時(shí)；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)棊或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2448小時(shí)。用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每lml含菌數(shù)為10loocfu 的菌懸液。菌懸液在室溫下放置應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用，若保存在28°c可在24小時(shí)內(nèi)使用。適用性檢查控制菌檢杏用培養(yǎng)基的適用性檢杳所用的菌株及檢測項(xiàng)

24、目見表2。表2控制菌檢查用培養(yǎng)基的促生長、抑制和指示能力檢查控制菌檢查培養(yǎng)基特性試驗(yàn)菌株大腸埃希菌膽鹽乳糖培養(yǎng)基mug培養(yǎng)基曙紅亞甲藍(lán)瓊脂或麥康凱瓊 脂促生長能力抑制能力促生長能力+指示能力促生長能力+指示能力犬腸埃希菌金黃色匍萄球菌大腸埃希菌人腸埃希菌人腸菌群乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基曙紅亞甲藍(lán)瓊脂或麥康凱瓊 脂促生長能力抑制能力促生長能力+指示能力促生長能力+指示能力大腸埃希菌金黃色葡萄球菌人腸埃希菌大腸埃希菌沙門菌營養(yǎng)肉湯四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基肚1鹽硫乳瓊脂或沙門、志賀 氏屬瓊脂曙紅亞甲藍(lán)瓊脂或麥康凱瓊 脂促生長能力 促生長能力 抑制能力促生長能力+指示能力促生長能力+指示能力乙型副

25、傷寒沙門菌 乙型副傷寒沙門菌 金黃色葡萄球菌乙型副傷寒沙門菌乙型副傷寒沙門菌銅綠假單胞菌膽鹽乳糖培養(yǎng)基澳化1 六烷基甲桜瓊脂綠膿菌索測定用培養(yǎng)基促生長能力抑制能力 促生長能力抑制能力促生長能力+指示能力銅綠假單胞菌 金黃色葡萄球菌 銅綠假單胞菌 大腸埃希菌 銅綠假單胞菌金黃色超萄球 菌亞碼酸鹽肉湯培養(yǎng)基卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)棊或廿 露醇鹽瓊脂促生長能力抑制能力促生長能力+指示能力抑制能力金黃色葡萄球菌 大腸埃希菌金黃色匍萄球菌 大腸埃希菌梭菌梭菌增菌培養(yǎng)基 哥倫比亞瓊脂促生長能力 促生長能力生抱梭菌 生抱梭菌口色念珠菌沙氏葡萄糖肉湯 沙氏葡萄糖瓊脂促牛長能力 促生長能丿j +指示能力白色念珠菌 白

26、色念珠菌念珠菌顯色培養(yǎng)基促牛長能力+指示能力白色念珠菌抑制能力大腸埃希菌吐溫80玉米瓊脂培養(yǎng)物促生長能力+指示能力白色念珠菌增菌培養(yǎng)基促牛k能力檢查：分別接種不大于loocfu的試驗(yàn)菌（見表2）于被檢培養(yǎng)基 和對照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及墳短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)。與對照培養(yǎng)基 管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗(yàn)菌應(yīng)生長良好。固體培養(yǎng)基促生長能力檢查：収試驗(yàn)菌各o.lml （含菌數(shù)50loocfu）分別涂布于被檢 培養(yǎng)皋和對照培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢査規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)。被 檢培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基牛長的菌落大小形態(tài)特征應(yīng)一致。培養(yǎng)基抑制能力檢杏：接種不少于loocfu的試驗(yàn)菌

27、（見表2）于被檢培養(yǎng)基中，在相應(yīng) 控制菌檢杏規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最長時(shí)間下培養(yǎng)，試驗(yàn)菌應(yīng)不得生長。固體培養(yǎng)棊指示能力檢查：取試驗(yàn)菌各0.1ml （含菌數(shù)不大于loocfu）見 表2）分別涂 布于被檢培養(yǎng)棊和對照培養(yǎng)棊平板上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及吋間下培養(yǎng)。被 檢培養(yǎng)基中試驗(yàn)菌生長的菌落形態(tài)、大小、指示劑反應(yīng)情況等應(yīng)與對照培養(yǎng)基一致。液體培養(yǎng)基指示能力檢查：分別接種不大于loocfu的試驗(yàn)菌（見表2）于被檢培養(yǎng)基和 對照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及故短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)。與對照培養(yǎng)基管 比較，被檢培養(yǎng)基管試驗(yàn)菌生長情況、指示劑反應(yīng)等應(yīng)與對照培養(yǎng)基一致。控制菌檢查方法的驗(yàn)證當(dāng)建立

28、藥品的微生物限度檢查法時(shí)，應(yīng)進(jìn)行控制菌檢查方法的驗(yàn)證，以確認(rèn)所采丿u的方 法適合于該藥品的控制茵檢查。若藥品的紐分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí), 檢查方法應(yīng)重新驗(yàn)證。驗(yàn)證時(shí)，依各晶種項(xiàng)下微生物限度標(biāo)準(zhǔn)屮規(guī)定檢査的控制菌選擇相應(yīng)驗(yàn)證的菌株，驗(yàn)證 人腸菌群檢查法時(shí)，應(yīng)采用人腸埃希菌作為驗(yàn)證菌株。驗(yàn)證試驗(yàn)按供試液的制備和控制菌檢 查法的規(guī)定及下列要求進(jìn)行。菌種及菌液制備同控制菌檢查川培養(yǎng)基的適用性檢查驗(yàn)證方法取規(guī)定量供試液及10loocfu試驗(yàn)菌加入增菌培養(yǎng)基屮，依相應(yīng)控制菌檢查法進(jìn)行檢 查。當(dāng)采用薄膜過濾法吋，取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，試驗(yàn)菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中， 過濾后，注入增菌培

29、養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。結(jié)果判斷若上述試驗(yàn)檢出試驗(yàn)菌，按此供試液制備法和控制菌檢査法進(jìn)行-供試品的該 控制菌檢查；若試驗(yàn)組耒檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、 中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。驗(yàn)證試驗(yàn)也可與供試品的控制菌檢查同時(shí)進(jìn)行。供試品檢查供試品的控制菌檢杏應(yīng)按己驗(yàn)證的方法進(jìn)行，增菌培養(yǎng)基的實(shí)際用量同控制菌檢查方法 的驗(yàn)證。陽性對照試驗(yàn) 供試品進(jìn)行控制菌檢査時(shí)，應(yīng)做陽性對照試驗(yàn)。陽性對照試驗(yàn)的加菌量 為10loocfu,方法同供試品的控制菌檢查。陽性對照試驗(yàn)應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。陰性對照試驗(yàn) 取稀釋液10ml照相應(yīng)控制

30、菌檢查法檢查，作為陰性對照。陰性對照應(yīng) 無菌牛長。（1）大腸埃希菌（escherichia coli） 取供試液10ml （相當(dāng)于供試品lg、lmk 10cm2）, 直接或處理后接種至適量（不少于100ml）的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小吋，必要 吋可延長至48小吋。取上述培養(yǎng)物0.2ml,接種至含5ml mug培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，于5小時(shí)、24小時(shí) 在366nm紫外線下觀察，同時(shí)川未接種的mug培養(yǎng)皐作木底對照。若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光, 為mug陽性；不呈現(xiàn)熒光，為mug陰性。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液, 液血呈玫魂紅色，為靛基質(zhì)陽性；辛試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。本底対照應(yīng)為

31、mug陰性和 靛基質(zhì)陰性。如mug陽性、靛棊質(zhì)陽性，判供試品檢出人腸埃希菌；如mug陰性、靛基質(zhì)陰性， 判供試品未檢出大腸埃希菌；如mug陽性、靛基質(zhì)陰性，或mug陰性、靛基質(zhì)陽性，則 應(yīng)取膽鹽乳糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)物劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平 板上，培養(yǎng)1824小時(shí)。若平板上無菌落牛長、或牛長的菌落與表3所列的菌落形態(tài)特征 不符，判供試品未檢出大腸埃希菌。若平板上生長的菌落與表3所列的菌落形態(tài)特征相符或 疑似，應(yīng)進(jìn)行分離、純化、染色鏡檢和適宜的鑒定試驗(yàn)，確認(rèn)是否為大腸埃希菌。表3大腸埃希菌菌落形態(tài)特征培養(yǎng)皐菌落形態(tài)曙紅亞甲藍(lán)瓊脂呈紫黑色、淺紫色、藍(lán)紫色或粉紅色，菌落中心呈

32、深紫色或無明顯暗 色中心，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表血光滑，濕潤，常有金屬光澤麥康凱瓊脂鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊， 表面光滑，濕潤（2）大腸菌群（coliform） 取含適量（不少于10ml）的乳糖月h鹽發(fā)酵培養(yǎng)基管3支, 分別加入1 : 10的供試液lml （含供試甜o.lg或0.1ml）、1 : 100的供試液1ml （含供試品 o.olg或0.01ml）、1 : 1000的供試液lml （含供試品o.oolg或0.001ml）,另取1支乳糖膽鹽 發(fā)酵培養(yǎng)基管加入稀釋液lml作為陰性對照管。培養(yǎng)1824小時(shí)。乳糖月h鹽發(fā)酵管若無菌主長、或有菌牛長但不產(chǎn)酸產(chǎn)

33、氣，判該管未檢出大腸菌群；若產(chǎn) 酸產(chǎn)氣應(yīng)將發(fā)酵管中的培養(yǎng)物分別劃線接種丁曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基 的平板上，培養(yǎng)1824小時(shí)。若平板上無菌落生長，或生長的菌落與表4所列的菌落形態(tài)特征不符或?yàn)榉歉锾m陰性無 芽范桿菌，判該管未檢出大腸菌群；若平板上牛長的菌落與表4所列的菌落形態(tài)特征相符或 疑似，且為革蘭陰性無芽泡桿菌，應(yīng)進(jìn)行確證試驗(yàn)。表4大腸菌群菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌落形態(tài)曙紅亞卬藍(lán)瓊脂呈紫黑色、紫紅色、紅色或粉紅色，圓形，扁平或稍凸起，邊緣整齊， 表面光滑，濕潤麥康凱瓊脂鮮桃紅色或粉紅色，惻形，扁平或稍凸起，邊緣整齊，表而光滑，濕 潤確證試驗(yàn) 從上述分離平板上挑選45個(gè)疑似菌落，分別

34、接種丁乳糖發(fā)酵管小，培養(yǎng)2448小時(shí)。若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，判該乳糖膽鹽發(fā)酵管檢出大腸菌群，否則判未檢出大腸菌群。 根據(jù)人腸菌群的檢出管數(shù)，按表5報(bào)告lg或lml供試品屮的人腸菌群數(shù)。表5可能的大腸菌群數(shù)表各供試晶量的檢出結(jié)果可能的大腸菌群數(shù)n （個(gè)/g 或 ml）o.lg 或 0.1mlo.olg 或 0.01mlo.oolg 或 0.001ml+>103+-102<n<103+-10<n<10-<10注：+代表檢出人腸菌群；代表未檢出人腸菌群。（3）沙門菌（salmonella） 取供試品10g或10ml,宜接或處理后接種至適量（不少 于200ml）的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)

35、基中，用勻漿儀或其他適宜方法混勻，培養(yǎng)1824小時(shí)。収上述培養(yǎng)物lml,接利于10ml四硫礦酸鈉亮綠培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時(shí)后，分別 劃線接種于膽鹽硫乳瓊脂（或沙門、志賀菌屬瓊脂）培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂（或曙紅亞甲藍(lán)瓊 脂）培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1824小時(shí)（必要時(shí)延長至4048小時(shí)）。若平板上無菌落生 長，或牛長的菌落不同于表6所列的特征，判供試品未檢出沙門菌。若平板上牛長的菌落 表6所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，用接種針挑選23個(gè)菌落分別于三糖恢瓊脂培養(yǎng)基 髙層斜面上進(jìn)行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng)1824小時(shí)，如斜面未見紅色、底層未見黃色; 或斜面黃色、底層無黑色，判斷供試品未檢出沙門菌。否則，

36、應(yīng)取三塘貼瓊脂培養(yǎng)基斜血的 培養(yǎng)物進(jìn)行適宜的鑒定試驗(yàn)，確認(rèn)是否為沙門菌。表6沙門菌菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌落形態(tài)膽鹽硫乳瓊脂無色至淺橙色，半透明，菌落屮心帶黑色或全部黑色或無黑色沙門、志賀菌屬瓊脂無色至淡紅色、半透明或不透明，菌落中心有吋帶有黑褐色曙紅亞甲藍(lán)瓊脂無色至淺橙色，透明或半透明，光滑濕潤的圓形菌落麥康凱瓊脂無色至淺橙色，透明或半透明，菌落中心有時(shí)為暗色（4 ）銅綠假單胞菌（peudomonas aeruginosa）取供試液10ml （相當(dāng)于供試品lg> 1ml、 10cm2）,直接或處理后接種至適量（不少于100ml）的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小吋。 取上述培養(yǎng)物，劃線接種

37、于繡花i 六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)2824小時(shí)。銅綠假單胞菌典型菌落呈扁平、無定形、周邊擴(kuò)散、表血濕潤，灰口色，周圍時(shí)有藍(lán)綠 色索擴(kuò)散。如平板上無菌落生長或與上述菌落形態(tài)特征不符，判斷供試品未檢出銅綠假單胞 菌。如平板生長的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)挑選23個(gè)菌落，分別接種于營 養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)1824小時(shí)。取斜面培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭染色、鏡檢及氧化酶試驗(yàn)。氧化酶試驗(yàn)取潔凈濾紙片置于平川i內(nèi)，川無菌玻棒取斜面培養(yǎng)物涂于濾紙片上，滴加 新配制的1%二鹽酸二甲基對苯二胺試液，在30秒內(nèi)若培養(yǎng)物呈粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色為 氧化酶試驗(yàn)陽性，否則為陰性。若斜而培養(yǎng)物為非革蘭陰性無

38、芽砲桿菌或氧化酶試驗(yàn)陰性,均判供試品未檢出銅綠假單 胞菌。否則，應(yīng)進(jìn)行綠膿菌素試驗(yàn)。綠膿菌（pyocyanin）試驗(yàn) 取斜而培養(yǎng)物接種于pdp瓊脂培養(yǎng)基斜而上，培養(yǎng)24小時(shí), 加氯卬烷35ml至培養(yǎng)管中，攪碎培養(yǎng)基并充分振搖。靜置片刻，將三氯卬烷相移至另一試 管中，加入lmol/l鹽酸試液約lml,振搖后，靜置片刻，觀察。若鹽酸溶液呈粉紅色，為 綠膿菌索試驗(yàn)陽性，否則為陰性。同吋用未接種的pop瓊脂培養(yǎng)慕斜而同法作陰性對照， 陰性對照試驗(yàn)應(yīng)呈陰性。若上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗(yàn)陽性及綠膿菌索試驗(yàn)陽性，判供試品檢出銅 綠假單胞菌。若上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗(yàn)陽性及綠膿菌素試驗(yàn)陰

39、性，應(yīng)繼續(xù) 進(jìn)行適宜的鑒定試驗(yàn)，確認(rèn)是否為銅綠假單胞菌。（5）金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus）取供試液10ml（相當(dāng)于供試品lgs lml> 10cm2）,宜接或處理后接種至適量（不少于100ml）的亞蹄酸鈉（鉀）肉湯（或營養(yǎng)肉湯） 培養(yǎng)集屮，培養(yǎng)1824小時(shí)，必要時(shí)可延長至48小時(shí)。取上述培養(yǎng)物，劃線接種于卵黃氯 化鈉瓊脂培養(yǎng)基廿鋁醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)2472小時(shí)。若平板上無菌落牛長 或生長的菌落不同于表7所列特征，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。表7金黃色葡萄菌菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌落形態(tài)甘露醇氯化鈉瓊脂金黃色，圓形凸起，邊緣幣齊，外圍有黃色環(huán)，菌

40、落直徑0.7-lmm卵黃氯化鈉瓊脂金黃色，惻形凸起，邊緣整齊，外圍有卵磷脂分解的乳濁圈，菌落直 徑 l2mm若平板上牛長的菌落與表7所列的菌落特征相符或疑似，應(yīng)挑選23個(gè)菌落，分別接種 于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)1824小時(shí)。取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭染色，并 接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時(shí)，作血漿凝固酶試驗(yàn)。血漿凝固酶試驗(yàn)取滅菌小試管3支,各加入血漿和無菌水混合液（1： 1） 0.5ml,再 分別加入可疑菌株的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物（或由營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜而培養(yǎng)物制備的濃菌懸液） 0.5ml、金黃色衙萄球菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物（或由營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物制備的濃菌懸液） 0.5ml、營養(yǎng)

41、肉湯或0.9%無菌氯化鈉溶液0.5ml,即為試驗(yàn)管、陽性対照管利陰性対照管。 將3管同時(shí)培養(yǎng)，3小時(shí)后開始觀察直至24小時(shí)。陰性對照管的血漿應(yīng)流動(dòng)自如，陰性對 照管血漿應(yīng)凝固，若試驗(yàn)管血漿凝固者為血漿凝固酶試驗(yàn)陽性，否則為陰性。如陽性對照管 或陰性對照管不符合規(guī)定吋，應(yīng)另制備血漿，重新試驗(yàn)。若上述疑似菌為非革蘭陽性球菌、血漿凝固酶試驗(yàn)陰性，判供試品未檢出金黃色葡萄球 菌、（6）梭菌（clostridium）取供試液10ml （相當(dāng)于供試品lg> lml） 2份，其中1份置 80°c保溫10分鐘片迅速冷卻。上述2份供試液百接或處理后分別接種至100ml的梭菌増菌 培養(yǎng)基中，置厭氧

42、條件下培養(yǎng)48小時(shí)。取上述每一培養(yǎng)物0.2ml,分別涂抹接種于含慶大 -霉索的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上，置厭氧條件下培養(yǎng)4曠72小時(shí)。若平板上無菌落生長, 判供試品未檢出梭菌；若平板上有菌落生長，應(yīng)挑選23個(gè)菌落分別進(jìn)行革蘭染色和過氧化 氫酶試驗(yàn)。過氧化氫酶試驗(yàn)取上述平板上的菌落，置潔凈玻片上，滴加3%過氧化氫試液，若菌 落表而有氣泡產(chǎn)生，為過氧化氫酶試驗(yàn)陽性，否則為陰性。若上述可疑菌落為革蘭陽性梭菌，有或無卵圓形或球形的芽胞，過氧化氫酶陰性，判供 試品檢出梭菌，否則判供試品未檢岀梭菌。（7）白色念珠菌（candida albicans）取供試液10ml （相當(dāng)于供試品2g、lmk 10cm2

43、） 直接或處理后接種至適量（不少于100ml）的沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)棊中，培養(yǎng)4曠72小吋。 取上述培養(yǎng)物劃線接種丁沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)24-48小時(shí)（必要時(shí)延反至 72小時(shí)）。白色念珠菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上牛長的菌落呈乳白色他見淡黃色，表血光滑有濃 酵母氣味，培養(yǎng)時(shí)間稍久則菌落增大，顏色變深、質(zhì)地變硬或有褶皺。若平板上無菌落牛長 或牛長的菌落與上述菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出白色念珠菌。如平板上牛長的菌落 與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)挑選23個(gè)菌落分別接種至念珠菌顯色培養(yǎng)棊平板上, 培養(yǎng)24-48小時(shí)（必要時(shí)延長至72小時(shí)）。若平板上無綠色或翠綠色的菌落生長，判供試品

44、未檢出口色念珠菌。若平板上牛氏的菌落為綠色或翠綠色，挑取相符或疑似的菌落接種于1%吐溫80玉米瓊 脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2448小時(shí)。収培養(yǎng)物進(jìn)行染色，鏡檢及牙管試驗(yàn)。牙管試驗(yàn) 挑取1%吐溫80-玉米瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物，接種于加有一滴血清的載玻 片,蓋上蓋玻片，置濕潤的平川l內(nèi)，置3537°c、13小時(shí)，置顯微鏡下觀察，可見到由砲 子長出短小芽管。若上述疑似菌為非革蘭陽性菌，顯微鏡未見厚膜他子、假菌絲、芽管，判供試品未檢出 白色念珠菌。結(jié)果判斷供試品間隙控制菌或其他致病菌時(shí)，按一次檢出結(jié)杲為準(zhǔn)，不再復(fù)試。供試品的細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)其中任何一項(xiàng)不符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，應(yīng)從同一批 樣品中

45、隨機(jī)抽樣，獨(dú)立復(fù)試兩次，以3次結(jié)果的平均值報(bào)告菌數(shù)。眼用制劑檢出霉菌和酵母菌數(shù)時(shí)，須以兩次復(fù)試結(jié)果均不得長菌，方可判供試品的霉菌 和酵母菌數(shù)符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定。若供試品的細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)、控制菌三項(xiàng)檢驗(yàn)結(jié)果符合該需種項(xiàng)下的規(guī)定，判 斷符合規(guī)定；若其中任何一項(xiàng)不符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品不符合規(guī)定。稀釋液稀釋液配制后，應(yīng)采用驗(yàn)證合格的滅菌程序滅菌。1. ph7.0無菌氯化鈉蛋白月東緩沖液 照無菌檢査法（附錄xiii b）制備。2. ph6.8無菌磷酸鹽緩沖液、ph7.6無菌磷酸鹽緩沖液 按緩沖液（附錄xvd） 配制后，過濾，分裝，滅菌。如需要，可在上述稀釋液滅菌前或滅菌后加入表而活性

46、劑或中和劑等。3. 0.9%無菌氯化鈉溶液取氯化鈉9.0g,加水溶解使成1000ml,過濾，分裝， 滅菌。培養(yǎng)基及其制備方法培養(yǎng)基可按以下處方制備，也可使川按該處方生產(chǎn)的符合要求的脫水培養(yǎng)皋。配制后, 應(yīng)采用驗(yàn)證合格的滅菌程序滅菌。1營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基及改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基照無菌檢査法（附錄xiii b）制備。2.玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基月東5.0g玫瑰紅鈉0.0133g葡萄糖lo.og瓊脂14.0g磷酸二氫鉀l.og水1000ml硫酸鎂0.5g除葡萄糖、玫瑰紅鈉外，取上述成分，混合，微溫溶解，濾過，加入制萄糖、玫瑰紅鈉,分裝，滅菌、3.酵母浸出粉腺匍

47、萄糖瓊脂培養(yǎng)棊（ypd）lo.og瓊脂14.0g酵母浸出粉5.0g水1000ml葡萄糖20.0g4.膽鹽乳糖培養(yǎng)基(bl)月東20.0g磷酸二氫鉀1.3g乳糖5.0g牛膽鹽2.0g氯化鈉5.0g（或去氧膽酸鈉）(0.5g)磷酸二氫鉀4.0g水1000ml除乳糖、牛膽鹽（或去氧膽酸鈉）夕卜，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)ph值使滅 菌后為7.4±0.2,煮沸，濾清，加入乳糖、牛膽鹽（或去氧膽酸鈉），分裝，滅菌。4.乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基蛋口腺20.0g0.04%浪甲酚紫水溶液1.3g乳糖lo.og水1000ml牛膽鹽5.0g除0.04%漠甲酚紫水溶液外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)p

48、h值使滅菌后為7.4±0.2,加入0.04%溟甲酚紫指示液，根據(jù)要求的用量分裝于含倒管的試管中。滅菌。所用倒 管的規(guī)格應(yīng)保證和產(chǎn)氣結(jié)果的觀察。5.曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（emb）營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基100ml曙紅鈉指示液2ml20%乳糖溶液5ml亞甲藍(lán)指示液1.31.6ml取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，加熱溶化后，冷至60°c,按無菌操作加入滅菌的其他3種溶液，搖勻，傾注平皿。6.麥康凱瓊脂培養(yǎng)棊（macc）月東20.0g1%中性紅指示劑3ml乳糖lo.og瓊脂14.0g牛膽鹽5.0g水1000ml氯化鈉5.0g除乳糖、1%'p性紅指示劑.牛膽鹽及瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)

49、節(jié)ph值使滅菌后為7.2±0.2,加入瓊脂，加熱溶化后，再加入其余各成分，搖勻，分裝，滅菌，冷至約60°c,傾注平皿。8.4-甲基傘形酮葡糖甘酸（4-methylumblliferl- p -d-glucuronide, mug）lo.og磷酸二氫鉀（無水）0.9g硫酸鎰0.5mg磷酸二氫鈉（無水）6.2g硫酸鋅0.5mg亞硫酸鈉40mg硫酸鎂o.lg去氧川!酸鈉l.og氯化鈉5.0gmug75mg氯化鈣50mg水1000ml除mug夕卜，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)ph值使滅菌后為7.3±0.1,力叭mug, 溶解，每管分裝5ml,滅菌。9.三糖鐵瓊脂培養(yǎng)皋

50、（tsi）h東20.0g硫酸亞鐵0.2g牛肉浸出粉5.0g硫代硫酸鈉0.2g乳糖lo.og0.2%酚殞釀指示劑12.5ml蔗糖lo.og瓊脂12.0g葡萄糖l.og水1000ml氯化鈉5.0g除三種糖、0.2%酚磺瞅指示劑、瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)ph值使 滅菌后為7.3 + 0.1,加入瓊脂，加熱溶化厲，再加入其余各成分，搖勻，分裝，滅菌，制成 高底層（23cm）短斜而。10.死硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基（ttb）（i東5.0g硫代硫酸鈉30.0g牛膽鹽l.og水1000ml碳酸鈣lo.og取上述成分，混合，微溫溶解，滅菌。臨用前,取上述培養(yǎng)基,每10ml加入碘試液0.2ml和亮綠試

51、液0.1ml,混勻。.沙門、志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)基（ss）腺5.0g硫代硫酸鈉8.5g牛肉浸出粉5.0g屮性紅指示劑2.5ml乳糖lo.og亮綠試液0.33ml牛膽鹽8.5g瓊脂16.0g枸椽酸鈉8.5g水1000ml枸椽酸鐵錢l.og除乳糖、中性紅指示劑、瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)ph值使滅菌后為7.2±0.1,濾過，加入瓊脂，加熱溶化后，再加入其余各成分，搖勻，滅菌，冷至60°c,傾注平皿。12.膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)棊(dhl)月東20.0g枸椽酸鈉l.og牛肉浸出粉3.0g枸椽酸鐵按l.og乳糖lo.og中性紅指示液3ml蔗糖10.0g瓊脂16.0g去氧膽酸鈉l

52、.og水1000ml硫代硫酸鈉2.3g13. 溟化i 六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基 月東lo.og牛肉浸出粉3.0g氯化鈉5.0g溟化十六烷基三甲胺0.3g 瓊脂14.0g水1000ml除糖、指示液及瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)ph值使滅菌后為7.2 ±0.1,加入瓊脂，加熱溶化后，再加入其余成分，搖勻，冷至60°c,傾注平皿。除瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)ph值使滅菌后為7.5±0.1,加入瓊脂, 加熱溶化后，分裝，滅菌，冷至60°c,傾注平皿。14. 亞晞硫酸鹽肉湯培養(yǎng)棊臨用前，取滅菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，每100ml中加入新配制的1%

53、亞晞酸鈉(鉀)試液 0.2ml,混勻，即得。15. 卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基月東6.0g10%氯化鈉卵黃液100ml牛肉浸出粉1.8g瓊脂14.0g氯化鈉30.0g水650ml除10%氯化鈉卵黃液外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)ph值滅菌后為7.6±0.1,滅菌，待冷至約60°c,以無菌操作加入10%氯化鈉卵黃液，充分振搖，傾注平皿。10%氯化鈉卵黃液的制備収新鮮雞蛋1個(gè)，以無菌操作取出卵黃，放入10%無菌氯化鈉溶液100ml中，充分振搖，即得。16 .甘餌醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基lo.og酚磺臥指示液2.5ml牛肉浸出粉l.og瓊脂14.0g廿露醇lo.og水1000ml氯化鈉

54、75.0g出甘露醇、酚磺瞅指不液及瓊脂外,取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)ph值使滅菌后為7.4±0.2,加入瓊脂,加熱溶化后，濾過，分裝，滅菌，冷至60°c,傾注平皿。17.乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基月東20.0g0.04%淑甲酚紫指示液25ml乳糖lo.og水1000ml除0.04%漠甲酚紫指示液外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)ph值使滅菌后為7.2 ±0.2,加入指示液，分裝于含倒管的小試管中，每管3ml,滅菌。18.路膿菌素（pyocyanin）測定用培養(yǎng)基（pdp瓊脂培養(yǎng)基）20.0g廿油10ml氯化鎂（無水）1.4g瓊脂14.0g硫酸鉀（無水）lo.og水10

55、00ml収月東、氯化鎂、硫酸鉀和水混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)ph值使滅菌后為7.3±0.1,加入h汕及瓊脂，加熱溶化，混勻，分裝于試管，滅菌，置成斜而。19.梭菌增值培養(yǎng)棊牛肉浸出粉10.0g鹽酸半胱氨酸0.5g月東10.0g氯化鈉5.0g酵母浸出粉3.0g醋酸鈉3.0g可溶淀粉l.og瓊脂0.5g葡萄糖5.0g水1000ml収上述成分，混合，加熱煮沸使溶解，調(diào)節(jié)ph值使滅菌后為6.8±0.2,加熱溶化，濾過，分裝，滅菌。20.哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基酪蛋門胰酶消化物lo.og肉胃酶消化物5.0g心胰酶消化物3.0g氯化鈉5.0g玉米淀粉l.og瓊脂15.0g酵母浸出粉5.0g水1000ml除瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)ph值使滅菌后為7.3±0.2,加入瓊脂 嗎，加熱溶化，濾過，分裝，滅菌，冷至4550°c,加入相當(dāng)于20ml慶大霉素的無菌硫酸 慶大霉素，混勻，傾注平皿。21. 沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基葡萄糖40g水1000ml蛋白豚10g除葡萄糖外。取上述成分，混合。微溫溶解。濾過。加入葡萄糖，溶解，分裝，滅菌。22. 沙氏窗萄糖瓊脂培養(yǎng)基匍萄糖40g瓊脂1518g蛋白豚10g水1000ml除瓊脂和葡萄糖外