人胎盤生長(zhǎng)因子ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)

1、人胎盤生長(zhǎng)因子（PIGF）酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說(shuō)明書(shū)廈門慧嘉生物科技有限公司本試劑盒僅供研究使用預(yù)期應(yīng)用ELISA 法定量測(cè)定人血清、血漿、尿液 , 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它相關(guān)液體中胎盤生長(zhǎng)因 子 ,PIGF 含量。實(shí)驗(yàn)原理本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測(cè)定標(biāo)本中 PIGF 水平。用純化的抗體包被微孔 板，制成固相抗體， 往包被單抗的微孔中依次加入 PIGF 抗原、生物素化的抗人 PIGF 抗體、 HRP 標(biāo)記的親和素，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后用底物 TMB 顯色。 TMB 在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色， 并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。 顏色的深淺和樣品中的 PIGF 呈正相關(guān)。 用酶標(biāo)儀在

2、450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（ OD 值），計(jì)算樣品濃度。試劑盒組成及試劑配制1. 酶聯(lián)板 ：一塊（ 96 孔）2. 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為1,000 pg/mL,做系列倍比稀釋后，分別稀釋成1,000 pg/mL , 500 pg/mL ， 250 pg/mL， 125 pg/mL， 62.5 pg/mL，31.25 pg/mL， 15.6 pg/mL，其 原液直接作為最高標(biāo)準(zhǔn)濃度，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 pg/mL，臨用前15分鐘內(nèi)配制。如配制 500 pg/mL 標(biāo)準(zhǔn)品：取 0.5ml

3、 1,000 pg/mL 的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有 0.5ml 樣品稀釋液 的 Eppendorf 管中,混勻即可,其余濃度以此類推。3. 樣品稀釋液：1X 20ml/瓶。4. 檢測(cè)稀釋液 A: 1X 10ml/瓶。5. 檢測(cè)稀釋液 B: 1X 10ml/瓶。6. 檢測(cè)溶液A: 1X 120ul/瓶（1 : 100）臨用前以 檢測(cè)稀釋液 A 1:100稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100ul）,實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制 0.1-0.2ml。女口 1ul檢測(cè)溶液 A 加 99ul 檢測(cè)稀釋液 A 的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。7. 檢測(cè)溶液B: 1 X 120ul/

4、瓶（1: 100）臨用前以檢測(cè)稀釋液B1:100稀釋。稀釋方法同檢測(cè)溶 液 A。8. 底物溶液：1X 10ml/瓶。9. 濃洗滌液：1X 30ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋 25倍。10. 終止液：1 X 10ml/瓶（2N H2SO4）。標(biāo)本的采集及保存1 細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請(qǐng)離心后收集上清，并將標(biāo)本保存于-20C，且應(yīng)避免反復(fù)凍融。2. 血清：標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置 2小時(shí)或4C過(guò)夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢 測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20 C保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。3. 血漿：可用 EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8 C 1000 x g離心15 分鐘，或?qū)?/p>

5、標(biāo)本放于-20 C保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。4. 尿液：請(qǐng)收集清晨第一次尿液（中段尿），或24小時(shí)尿液，2000 x g離心15分鐘后收 集上清，并將標(biāo)本保存于 -20C，且應(yīng)避免反復(fù)凍融。注：標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。操作步驟 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，請(qǐng)?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時(shí)，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。 每次檢測(cè)都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過(guò)高時(shí)，用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋，以使樣品符合試劑 盒的檢測(cè)范圍。1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00ul，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，

6、盡量不觸及孔壁， 輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37 C反應(yīng)120分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測(cè)溶液A工作液100ul （取1ul檢測(cè)溶液A加99ul檢測(cè)稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制），37C ,60分鐘。3. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干。4. 每孔加檢測(cè)溶液B工作液（同檢測(cè) A工作液）100ul, 37 C, 60分鐘。5. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干。6. 依序每孔加 底物

7、溶液90ul, 37 C避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后 3-4孔梯度不明顯，即可終止） 。7. 依序每孔加終止溶液50ul,終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底 物液的加入順序相同。 為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性， 底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。8. 用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。注：1 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是最后加底物溶液及2NH2SO4 。測(cè)量時(shí)先用此孔調(diào) OD 值至零。2為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或

8、覆膜。3. 未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請(qǐng)于2-8C保存。標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液A工作液、檢測(cè)溶液 B工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配置使用。請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液A工作液或檢測(cè)溶液 B 工作液。4. 建議檢測(cè)樣品時(shí)均設(shè)雙孔測(cè)定，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。洗板方法 手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水 紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少 0.3ml 注入孔內(nèi)，浸泡 1-2分鐘，根據(jù)需 要，重復(fù)此過(guò)程數(shù)次。自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中。特異性本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)重組或天然的人PIGF，且與其它相關(guān)蛋白無(wú)交叉反應(yīng)。

9、計(jì)算以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)） ， OD 值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)） ，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上 繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的 OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物 的濃度與 OD 值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的 OD 值代入方程式，計(jì)算出樣品 濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。注意事項(xiàng)1 洗滌過(guò)程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽(yáng)性。2一次加樣時(shí)間最好控制在 5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。3. 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。4. 如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高，請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)最后乘以稀釋倍數(shù)。5 在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液工作液時(shí)，請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。6 .底物請(qǐng)避光保存。檢測(cè)范圍：1.67 n g/ml-40 ng/ml靈敏度：0.7 ng/