臨床檢驗儀器原理及設(shè)計_課程論文_血細胞分析儀的原理、現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢

1、血細胞分析儀的原理.現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢學(xué)習(xí)摘抄摘要：血液分析是臨床診斷工作屮常用的實驗方法之一。它能為全身各系統(tǒng)疾病的診斷提供 可靠的依據(jù)。木文重點介紹了目前臨床應(yīng)用的血細胞五分類分析技術(shù)的工作原理和技術(shù)特征， 并在此基礎(chǔ)上對于口前各種血細胞分析儀的應(yīng)用現(xiàn)狀和技術(shù)特點進行了綜合的分析和比較，最后 對血細胞分析儀的發(fā)展趨勢進行了總結(jié)展望。關(guān)鍵詞：血細胞分析儀血細胞五分類分析技術(shù)0.前言口 50年代初庫爾特先生發(fā)明了粒子計數(shù)技術(shù)的專利，制造了笫一臺血細胞分析儀并應(yīng)用 于臨床以來，血細胞分析儀的發(fā)展已冇50年的歷史.血細胞分析儀實質(zhì)上是指對一定體枳內(nèi) 血細胞數(shù)量及異質(zhì)性進行分析的儀器最初的血細胞計數(shù)儀(

2、cell counter)僅能計數(shù)紅細胞 (red)和白細胞(wbc),后來又有了血紅蛋白(hbg),血小板(plt),紅細胞壓積(hct),平均紅細胞體 積(mcv)等兒個參數(shù).而發(fā)展成為血細胞分析儀(hematology analyzer)后,乂增加i許多分析和 計算參數(shù),如紅細胞體積分布寬度(rdw),平均血小板體積(mpv),血小板體積分布寬度(pdw), 血小板壓積(pct),大血小板比率，白細胞三分群,白細胞五分類，血紅蛋白濃度分布寬度，界常淋 巴細胞提示,幼稚細胞提示等各種參數(shù)和功能也不斷地添加到一些品牌的儀器上。木文重點介紹了目前臨床m用的血細胞五分類分析技術(shù)的工作原理和技術(shù)特

3、征，并在此 基礎(chǔ)上對于冃前各種血細胞分析儀的應(yīng)用現(xiàn)狀和技術(shù)特點進行了綜介的分析和比較，最后對 血細胞分析儀的發(fā)展趨勢進行了總結(jié)展望。1. 血細胞五分類分析技術(shù)原理20世紀50年代以前，血細胞分析主要使用手工顯微鏡的方法進行。將稀釋過的血液 手工推片、染色后，利用顯微鏡目測，對h細胞、紅細胞進行計數(shù)分類；通過將血紅蛋白與 試劑結(jié)合形成衍生物比色定量測量紅細胞中血紅蛋白的含量。対于小批量樣本，手工鏡檢直 接提取了血細胞最原始的信息，通過觀測其形態(tài)，可將血細胞準確歸類，為臨丿木診斷提供最 可靠的依據(jù)；對于人批量樣木，由于受工作人員技術(shù)熟練度、連續(xù)工作時間、顯微鏡精度等 諸多因索的影響，手工鏡檢費時費

4、力，實驗結(jié)果的精確性、準確性也受影響(其變異系數(shù)值 高達8%15%11),難以提供快速、準確、及吋的報告。因此，血細胞的口動分析技術(shù)逐 漸發(fā)展起來。目前臨床用于血細胞分析的技術(shù)主要有以卜五大類：電阻抗法、流式細胞術(shù)、激光散射 法/多角度偏振光散射技術(shù)/熒光法、各種細胞化學(xué)特性應(yīng)用技術(shù)、電導(dǎo)射頻法叭1.1電阻抗法20世紀50年代初，美國的庫爾特先生(w. h. coulter)發(fā)明電阻抗法(electrical impedance )來進行血細胞計數(shù)和體積測定,這種方法也被稱為庫爾特原理(coulter principle)0電阻抗法是利用血細胞的非傳導(dǎo)性質(zhì)進行計數(shù)與分類,如圖1所示。把用等滲電

5、 解質(zhì)溶液稀釋過的血細胞懸液倒入不導(dǎo)電的容器中(全血標木稀釋倍數(shù))，將小孔管插到細 胞懸液中，其內(nèi)側(cè)充滿了稀釋液。在小孔管內(nèi)外各置一個電極，當(dāng)小孔間充滿導(dǎo)電的稀釋液 時，整個電路的陽航為一定值；當(dāng)血細胞通過微孔時，由于自身的非傳導(dǎo)性，小孔間陽航發(fā) 牛變化。保持電路屮電流恒定，根據(jù)歐姆定律(e=ir),回路屮電阻的增加于瞬間引起電壓變化而出現(xiàn)一個脈沖信號(通過脈沖)，脈沖振幅大小反映血細胞體積人小，脈沖數(shù)量反映 血細胞個數(shù)。電他內(nèi)押電級b"住電k2lnjr1 拓k外血電竝圖1電阻抗法細胞分析原理圖1.2流式細胞術(shù)流式細胞術(shù)(flow cytometry, fcm)是一種綜合應(yīng)用光學(xué)、機

6、械學(xué)、流體力學(xué)、電了計算 機、細胞生物學(xué)、分子免疫學(xué)等學(xué)科技術(shù)，使被測溶液流經(jīng)測雖區(qū)域，并逐一檢測其中每一 個細胞的物理和化學(xué)特性，從而對高速流動的細胞或亞細胞進行快速定量測定和分析的聯(lián)合 檢測方法。首先，待測細胞經(jīng)處理或染色后被壓人流動室，與此同時，不含細胞的緩沖液在高壓下 從鞘液管噴出，鞘液管人口方向與待測樣品流成一定角度，這樣鞘液就能被包繞著樣品高速 流動，組成-個圓形的流束，待測細胞在包繞下單行排列，依次通過檢測區(qū)域在激光束的 照射下產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。這兩個光源信號分別反映了細胞體積的大小和內(nèi)部的信息。 經(jīng)光電倍增管接收后可轉(zhuǎn)換為電信號，再通過模，數(shù)轉(zhuǎn)換器將連續(xù)的電信號轉(zhuǎn)換為可被計

7、 算機識別的數(shù)字信號，經(jīng)計算機處理，可將分析結(jié)果顯示在屏幕上。為了保證細胞單個排列地逐一通過檢測區(qū)域，勒流技術(shù)在流式細胞術(shù)中被廣泛應(yīng)用。勒 流技術(shù)是對流體粘性定律和層流理論在醫(yī)學(xué)上應(yīng)用的特殊稱謂，意思是一種液體象刀鞘一樣 包裹著細胞的流動。對丁起包裹作用的液體被稱為鞘液，以為樣本液區(qū)別。其示意圖如圖2 所示。根據(jù)層流理論，山于兩種液體的流速和壓力不同。在一淀條件下樣品溶液與包裹它的 鞘液在流動屮可以保持相互分離并且同軸。同時鞘液流可以加速樣品溶液屮顆粒的流動并迫 使他們的流動軌跡保持在液流的中軸線上，使細胞單排列地逐一通過檢測區(qū)域，這便是所謂 的液流聚焦原理。圖2鞘流技術(shù)示意圖1.3激光散射法

8、/多角度偏振光散射技術(shù)/熒光法根據(jù)光散射理論，當(dāng)激光照射到流動室內(nèi)流過的每一個細胞時，市于細胞的物理特性,部分光線從細胞上經(jīng)不同的角度散射。其中，前向小角度散射光的光強可以反應(yīng)細胞體積; 人角度散射光的光強可以反應(yīng)細胞核，漿復(fù)雜度和細胞顆粒的信息；而側(cè)向散射光的光強可 以反應(yīng)細胞膜、核膜、細胞質(zhì)的變化。因此 可以依據(jù)細胞表明光散射的特點対細胞進行分 類。用激光光源產(chǎn)生的單色光束直接進入計數(shù)池的頌感區(qū)，在不同角度（10度70度）對每 個細胞進行掃描分析，測定其散射光強度，從而提供細胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)的光散射信息。由于粗 顆粒細胞的散射強度比細顆粒細胞史強，故光散射對細胞顆粒的構(gòu)型和顆粒質(zhì)量具有很好的

9、區(qū)別能力。多角度偏振散射技術(shù)用偏振激光束射照單個排列細胞，并進一步分辨細胞。該技術(shù)采用 了 10度窄角和偏振加消偏振檢測法,分辨能力有所提高。它首先測試中性，單核細胞,用0 度90度的散射數(shù)據(jù)，再測得90度d的衍射基，將嗜酸性和屮性細胞分開而嗜堿性粒細 胞、淋巴細胞及單核細胞則按英大小和內(nèi)部結(jié)構(gòu)不同的復(fù)雜性，所產(chǎn)生的散射光也各異，用 可調(diào)較的門限加以區(qū)分。其采用特定程序自動儲存分析數(shù)據(jù)，并經(jīng)計算機軟件處理，在屏幕 上顯示6個散點圖和2個直方圖。熒光法是利用不同細胞的細胞膜、胞內(nèi)因子以及胞內(nèi)dna、rna、胞內(nèi)離子鈣等不同染 色特性，選用具有特界性抗原或抗體的熒光染料載體，使待分離的細胞分別標記

10、相應(yīng)的熒光 物質(zhì)，經(jīng)過特定波氏的激光照射激發(fā)出不同波氏的熒光，利用各種pmt管檢測熒光信號的 個數(shù)，可以完成待檢細胞的計數(shù)如進一步分析計數(shù)淋巴細胞或網(wǎng)織紅細胞等。1.4各種細胞化學(xué)特性應(yīng)用技術(shù)不同的白細胞自身具有不同的化學(xué)性質(zhì)，利用此特性，配合和應(yīng)的化學(xué)試劑可以對細胞 加以區(qū)分。由于嗜酸性（或嗜堿性）粒細胞均有較強的堿性（或酸性），因此在特殊的溶血劑作用下， 經(jīng)過特定時間及溫度的孵育，可使除嗜酸性（嗜堿性）粒細胞之外的所有細胞溶解或萎縮經(jīng)處 理z后的細胞根據(jù)阻抗脈沖計數(shù)法，可得相應(yīng)嗜酸性（嗜堿性）細胞有效數(shù)值。利用五種白細胞過氧化物酶活性的差異對白細胞進行染色，測定其酶反應(yīng)強度，對白細 胞進行

11、分析。血液屮五種口細胞的過氧化物酶活性排列順序為：嗜酸性粒細胞屮性粒細胞 單核細胞。淋巴細胞和嗜堿性粒細胞均無過氧化物酶。將待測血液加入清洗劑和甲醛的等滲 液體內(nèi)經(jīng)孵育，再加入過氧化氫和四氯一蔡酚，細胞內(nèi)過氧化酶分解產(chǎn)生氧離了，使四氯一 蔡酚顯色并沉淀，并定位于酶反應(yīng)部位。根據(jù)酶反應(yīng)強度的不同，利川光電檢測技術(shù)測定相 應(yīng)吸光度值的方法，用以區(qū)分嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、單核細胞。1.5電導(dǎo)射頻法射頻技術(shù)rf （radio frequency）的基本原理是電磁理論。射頻法通常與電阻抗法結(jié)合 對血細胞進行分析：利川射頻電流（高頻交流變化電磁波）穿透細胞，獲得細胞核人小和顆 粒多少的信息；利用直流電

12、測量細胞的大小。因此，血細胞在通過計數(shù)小孔吋將產(chǎn)綸兩個不 同的脈沖信號，脈沖的高低分別代表細胞的大?。╠c）和核及顆粒的密度（rf）。2. 血細胞五分類分析技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀血細胞分析儀是多學(xué)科相互交叉、滲透、綜合的產(chǎn)物。它是在血細胞五分類分析技術(shù) 的基礎(chǔ)上，聯(lián)合電子技術(shù)、計算機技術(shù)、傳感器技術(shù)、信號處理技術(shù)、生物化學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、 精密機械、光學(xué)、自動控制、流體力學(xué)等領(lǐng)域的工程技術(shù)研制出來的五分類產(chǎn)品。絕大多數(shù) “五分類”血細胞分析儀采用了流式細胞分析方法，而聯(lián)合檢測法則代表了五分類血細胞分 析儀的最新發(fā)展趨勢。目前,國內(nèi)五分類的產(chǎn)品絕大多數(shù)由美國的貝克曼庫爾特（beckman coulter）雅

13、培(abbott),日本的希森美康(sysmex)日本光電(nihon koden)，德國的拜耳(bayer), 法國的horiba abx等6個廠家生產(chǎn)。國內(nèi)的邊瑞公司也于2006年4月推出一款五分類 機 bc-5500o美國的貝克曼庫爾特(beckman coulter)全口動五分類血球分析儀采用其獨特的vcs 聯(lián)合技術(shù)，m+v(體積法)用于分析細胞體積；c(電導(dǎo)法)用于分析細胞核型；s(散射法)則用 于分析細胞的顆粒特性。測試時。患者標本經(jīng)過分血片等樣本分配系統(tǒng)進入攪拌杯屮，再加 入溶血劑攪拌溶血完全破壞紅細胞，剩下的白細胞在樣本壓力作用下進入流式通道。運用 vcs聯(lián)合檢測方法，在流式通

14、道的某一位點。對通過的單列白細胞，進行逐個的、同時的、 三重的檢測以及三維分析，以確定具亞群性質(zhì)。雅培(abbott)公司新推出的cell-dyn ruby全自動血液分析儀運用合并流式細胞術(shù)及 多角度偏振散射分離技術(shù)檢測白細胞。其采用多角度偏振散射技術(shù)對白細胞進行區(qū)分和按序 分離，通過四個角度的光學(xué)檢測進行白細胞分析。其中，0度用于區(qū)分細胞體積大小；10 度用于區(qū)分細胞的復(fù)雜性；90度用于區(qū)分細胞核的分葉性；90度d用于區(qū)分細胞的顆粒性。 通過90度偏振和90度去偏振區(qū)分嗜酸性粒細胞和嗜屮性粒細胞，同時通過多個散點圖分 析來鑒別和分類未成熟細胞和干擾物質(zhì)。德國拜爾(bayer)公司的adv i

15、a120利用化學(xué)特性中過氧化物酶活性與激光散射技術(shù) 結(jié)合原理進行白細胞五分類測定。該儀器有4個測最通道：血紅蛋白測最通道、紅細胞/血 小板測量通道、嗜堿性粒細胞測量通道、過氧化物酶測量(白細胞分類)通道。其利用五種白 細胞過氧化物酶活性的差異對白細胞進行染色測定其酶反應(yīng)強度，對白細胞進行分析。在 測試過程屮每個細胞產(chǎn)生2個信號：組化染色結(jié)果與光散射結(jié)果。以x軸代表吸光率(組化 染色酶反應(yīng)強度)，y軸代表光散射(細胞大小)，一起定位于細胞圖上(cytogram)。計算機系 統(tǒng)對存儲資料進行分析處理，并結(jié)合嗜堿性或分葉細胞通道結(jié)果計算出白細胞總數(shù)及分類。 值得一提的是，該設(shè)備対rbc及plt的測定

16、也摒棄了傳統(tǒng)的阻抗法，而是采用激光法對其進 行測定的。丨i木的希森美康(sysmex)公司五分類血液分析儀的檢測原理按生產(chǎn)時間的先示可分為 三人類：多通道阻抗與射頻聯(lián)合檢測技術(shù)，代表機型有se-9000；激光流式細胞檢測結(jié)合細 胞組化染色技術(shù)，代表機型有sf-3000；激光流式細胞檢測結(jié)合核酸熒光染色技術(shù)，代表機 型有sf-2i00。sysmex xe-2100全口動血細胞分析儀是綜合了前向散光、側(cè)向散光和側(cè)向熒光三種光 學(xué)檢杏技術(shù)，結(jié)合電阻抗技術(shù)來進行片細胞分類的。肓流電阻抗法(dc)用于測量細胞體積人 小。激光散射產(chǎn)生的前向散射光、側(cè)向散射光可用于探測口細胞體積大小、細胞內(nèi)含物的情 況(細

17、胞核以及顆粒悄況)，側(cè)向熒光則可以反映細胞內(nèi)脫氧核糖核酸(dna)和核糖核酸(rna) 的含量。綜合各個測量方法，得到白細胞五分類的圖形和數(shù)據(jù)。sysmex xt-2000i全自動血 液分析儀運用核酸熒光染色技術(shù)，配合激光流式分析系統(tǒng)，保證了精確的wbc五項分類結(jié) 果。法國的horiba abx公司生產(chǎn)的pentra系列五分類血液分析儀采用獨冇的雙鞘流通道， 結(jié)合阻抗法、化學(xué)染色技術(shù)及吸光度法對白細胞進行精確的分析。流式通道內(nèi)有兩個檢測裝 置，60um的鞘流微孔用于阻抗法體枳檢測，42um的光窗用于吸光度測定分析細胞內(nèi)容物。 實現(xiàn)對大量細胞進行的順序、快速、準確地分析與測定。國內(nèi)邁瑞公司生產(chǎn)的

18、bc-5500的口細胞分類結(jié)合了液流聚焦技術(shù)、激光散射技術(shù)和化學(xué) 染色技術(shù)。英光源采用半導(dǎo)體激光系統(tǒng)，通過多角度的激光散射，提供細胞的大小、細胞核、 細胞顆粒人小及復(fù)雜性的信息并結(jié)合試劑對嗜酸性細胞和嗜堿性細胞的特異處理，將嗜酸 性細胞和嗜堿性細胞區(qū)分開來，剛篩選出各類片毒細胞，實現(xiàn)精確的五分類檢測結(jié)果。由于不同儀器的檢測原理及相關(guān)試劑的差杲，各類設(shè)備均有其相應(yīng)的特點?？傮w來講, 光學(xué)檢測法結(jié)合特種化學(xué)試劑如染色物質(zhì)等由于其針對某一被檢物質(zhì)的特異性，因此其測 定及分析結(jié)果較電阻法精確度要高，但相應(yīng)的試劑成木加人，同時對操作人員及環(huán)境的要求 也會有所提高。3. 血細胞分析儀的發(fā)展趨勢從五分類血液分析儀的發(fā)展進程可以看出，臨床對血細胞的分析已不滿足于簡單的對 wbc、rbc、plt的計數(shù)，而是更傾向?qū)τ谄涓黝惣毎捌鋪喨旱倪M一步分析，包括從細胞 內(nèi)部的dna, rna及免疫等方血進行分析。岡此，血細胞分析儀已從對細胞的簡單的物理 性能的研究轉(zhuǎn)向?qū)毎麅?nèi)部化學(xué)性質(zhì)及免疫性質(zhì)的研究方向發(fā)展