一種抗HER2人源化單克隆抗體藥物的藥學(xué)研究

1、一種抗HER2人源化單克隆抗體藥物的藥學(xué)研究王曉聞，劉培培，呂鋒華，譚青喬*（抗體藥物國家工程研究中心，201203）摘要：目的 對(duì)一種用于治療HER2陽性乳腺癌的抗HER2人源化單克隆抗體靶向生物制劑進(jìn)行有效性和安全性的藥學(xué)研究。方法 采用高效液相色譜、毛細(xì)管電泳、圓二色譜、差示掃描量熱技術(shù)、液質(zhì)聯(lián)用和基于人乳腺癌細(xì)胞的體外活性檢測(cè)以及SPR技術(shù)分析抗HER2抗體的純度、結(jié)構(gòu)、翻譯后修飾以及功能活性等關(guān)鍵質(zhì)量屬性。結(jié)果 該抗體的單體純度>98%，聚體含量<2%；輕重鏈電泳純度>97%；具有正確的二級(jí)與三級(jí)結(jié)構(gòu)，相變溫度為72.65±0.1，和85.08±

2、0.1；大于99%的分子具有正確的糖基化修飾，且N糖分布大體上與參比制劑高度相似，高甘露糖含量少但唾液酸含量多；對(duì)人乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制活性和ADCC活性與參比制劑相當(dāng)（P=0.96），與HER2抗原以及Fc受體的結(jié)合也無顯著差異。結(jié)論 該抗體在藥學(xué)評(píng)價(jià)上展現(xiàn)了高純度、低雜質(zhì)、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定以及正確的翻譯后修飾的特性，通過如此精心的分子和工藝設(shè)計(jì)，使其表現(xiàn)出與參比制劑相同的生物等效功能作用，而且也在免疫原性和穩(wěn)定性上都表現(xiàn)出低風(fēng)險(xiǎn)，具備良好的安全性和有效性。關(guān)鍵詞: HER2; 單克隆抗體; 質(zhì)量; 有效性; 安全性The Pharmaceutical Research of an Anti-HER

3、2 Humanized Monoclonal Antibody Drug ProductWANG Xiao-wen, LIU Pei-pei, LV Feng-hua，TAN Qing-qiao*（National Engineering Research Center of Antibody Medicine，Shanghai 201203，China）ABSTRACT： OBJECTIVE To perform a pharmaceutical study on the efficacy and safety of a therapeutic anti-HER2 humanized mon

4、oclonal antibody targeting HER2-positive breast cancer. METHODS The critical quality attributes such as purity, structure, post-translation modifications, function and efficacy are analyzed using HPLC, CE-SDS, Circular Dichroism, Differential Scanning Calorimeter, LC-MS/MS, human breast cancer cell-

5、based in vitro bioactivity assay and SPR binding kinetics. RESULTS The monomer content of the antibody is more than 98% while the polymer impurities are less than 2%. The sum of heavy chain and light chain peak area is over 97% on the CE-SDS electrophoretogram. The antibody drug demonstrates correct

6、 secondary and tertiary structure with two phase transition temperatures of 72.65±0.1 and 85.08±0.1. More than 99% of the molecules are correctly glycosylated with a highly similar N-glycan profiling to the reference product. The differences exist where the experiment subject has higher co

7、ntent of high mannose structure but lower sialic acids. The two products keep the same level on BT474 proliferation inhibiting bioactivity and ADCC efficacy（P=0.96）,and show no significant difference on the binding affinity to HER2 and Fc Receptors. CONCLUSION The antibody drug product demonstrates

8、excellent characteristics such as high purity, few impurities, stable structure and correct post translation modifications in the pharmaceutical evaluation. By means of these well-designed molecules and production process, the drug product is proved bioequivalent to the reference product as well as

9、low-risk of immunogenicity and stability. The antibody drug product has good safety and efficacy. KEY WORDS: HER2; monoclonal antibody ; quality;efficacy;safety作者簡(jiǎn)介：王曉聞，女，碩士 研究方向：抗體藥物質(zhì)量分析評(píng)價(jià)*通訊作者：譚青喬，男，博士 研究方向：抗體藥物質(zhì)量分析評(píng)價(jià) Tel：（021）60753275 E-mail: tanqqcpgj-據(jù)世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年有超過50萬人死于乳腺癌，高居女性惡性腫瘤發(fā)病率的第一位，占

10、所有婦女癌癥的16%。一項(xiàng)全國多中心10年回顧臨床流行病學(xué)研究顯示1，我國女性乳腺癌患者具有發(fā)病年齡早、浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌多、腫塊更大、分期更晚、ER和PR表達(dá)比例更低和HER2比例更高（18%）的特點(diǎn)。臨床上常用的乳腺癌化療藥物有紫杉類、長(zhǎng)春堿類、鉑類和蒽環(huán)類，化療藥物由于缺乏對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷，大多會(huì)有心臟、血液、腸胃、肝臟、腎臟或神經(jīng)毒性，毒副作用明顯2。而針對(duì)腫瘤發(fā)生機(jī)制中的關(guān)鍵受體、基因和調(diào)控分子3的靶向生物制劑治療性單克隆體的出現(xiàn)克服了化療藥物的缺陷。經(jīng)過近三十年的發(fā)展，治療性單克隆抗體已經(jīng)成功地成為腫瘤治療的主流方式，其與靶點(diǎn)的特異識(shí)別以及多樣的免疫治療途徑?jīng)Q定了單抗在安全性和有效

11、性上的特殊優(yōu)勢(shì)，每年全球單抗市場(chǎng)銷售額可超過兩百億美元，產(chǎn)品管線以百數(shù)計(jì)4。目前，研究較為成熟的針對(duì)乳腺癌的靶向治療方法主要以表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2）為靶點(diǎn)，因?yàn)镠ER2基因的擴(kuò)增和蛋白的過度表達(dá)的乳腺癌對(duì)常規(guī)的化療和內(nèi)分泌治療反應(yīng)差，無病生存期短，預(yù)后差5。以HER2為靶點(diǎn)的治療性單抗以其定向性、高特異性、安全性和低風(fēng)險(xiǎn)成為了針對(duì)HER2陽性乳腺癌的有效治療方法，既能阻斷HER2抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，又能激活免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的攻擊。然而，由于歐美發(fā)達(dá)國家對(duì)重組單抗技術(shù)的封鎖和專利壟斷致使進(jìn)口藥品售價(jià)高昂，國內(nèi)的患者選擇單一卻大多負(fù)擔(dān)不起，這也是雖然乳腺癌被認(rèn)為是發(fā)達(dá)國家的疾病，但大多數(shù)

12、乳腺癌死亡病例（69%）發(fā)生在發(fā)展中國家的重要原因。可喜的是，國內(nèi)已有企業(yè)突破了哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)和單抗大規(guī)模分離純化技術(shù)壁壘，自主創(chuàng)新開發(fā)出產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的抗HER2人源化抗體，現(xiàn)已成功完成臨床三期，充分證實(shí)了國產(chǎn)抗HER2人源化抗體的有效性和安全性。除了臨床評(píng)價(jià)以外，藥學(xué)評(píng)價(jià)更是貫穿于初始分子構(gòu)建至上市后的整個(gè)生命周期，因?yàn)閱慰顾幬镉蓴?shù)百個(gè)氨基酸組成，分子量巨大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且通過哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)存在翻譯后修飾造成了分子的異質(zhì)性，復(fù)雜的修飾和多級(jí)結(jié)構(gòu)直接影響到單抗的藥效功能，蛋白質(zhì)較不穩(wěn)定的特性和復(fù)雜且隨著技術(shù)更新而變化的生產(chǎn)工藝也與其質(zhì)量和安全性息息相關(guān)。為了揭示一種HER2人源化單克隆抗

13、體產(chǎn)品的有效性和安全性，本研究采用高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、基于人乳腺癌細(xì)胞的體外活性檢測(cè)法、SPR技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)、圓二色譜技術(shù)、差示掃描量熱技術(shù)等多種技術(shù)手段分析了該單抗的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，從藥學(xué)研究角度解析了該單抗藥物的分子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、雜質(zhì)純度與其安全有效的良好質(zhì)量表現(xiàn)之間的內(nèi)在關(guān)系。1. 材料與方法重組抗HER2人源化單克隆抗體（MAb302），規(guī)格50mg/支，商品名賽普汀，上海中信國健藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。參比生物制劑為赫賽汀®。活性試驗(yàn)中使用自制的參考品作為參比品。1.1 還原型毛細(xì)管凝膠電泳CE-SDS純度和雜質(zhì)分析：樣品經(jīng)-巰基乙醇還原和SDS變性后在PA800 plu

14、s毛細(xì)管電泳儀（Beckman Coulter）上進(jìn)行CE-SDS分析，10kV電壓進(jìn)樣，15kV電壓下進(jìn)行分離，214nm UV檢測(cè)器進(jìn)行信號(hào)采集。1.2 分子排阻液相色譜SECHPLC純度和雜質(zhì)分析：使用Dionex U3000高效液相色譜系統(tǒng)（Thermo Fisher）和TSK-Gel G3000SWXL5m 7.8*300mm色譜柱(Tosoh Bioscience)對(duì)樣品進(jìn)行分離，20g樣品經(jīng)200mM磷酸鹽緩沖液等度洗脫后，280nm UV檢測(cè)器進(jìn)行信號(hào)采集。1.3 分子排阻色譜分離靜態(tài)光散射SEC-DLS法測(cè)定聚體分子量：使用Agilent 1260 高效液相色譜系統(tǒng)（Agil

15、ent Technologies）和TSK-Gel G3000SWXL5m 7.8*300mm色譜柱(Tosoh Bioscience)對(duì)樣品進(jìn)行分離，200g樣品經(jīng)200mM磷酸鹽緩沖液等度洗脫后，先經(jīng)過280nm UV檢測(cè)器進(jìn)行信號(hào)采集，后串聯(lián)ZMV2000動(dòng)態(tài)光散射粒度儀（Malvern）檢測(cè)散射光強(qiáng)計(jì)算分子量。1.4 圓二色譜分析：圓二色譜掃描在Chirascan圓二色譜儀（Applied Photophysics）上完成。分別在遠(yuǎn)紫外區(qū)260-180nm和近紫外區(qū)360-250nm波段下對(duì)樣品進(jìn)行掃描，遠(yuǎn)紫外區(qū)采用0.5mm光徑長(zhǎng)的石英比色皿，樣品濃度為0.2mg·mL-1

16、，并以同比例稀釋的制劑緩沖液作為背景對(duì)照；近紫外區(qū)則采用10mm的比色皿，樣品濃度為1.0 mg·mL-1。1.5 Tm值分析 Tm值分析在MicroCal VP-Capillary DSC差示掃描量熱儀 (GE Heathcare)上完成。用樣品的緩沖液稀釋樣品到0.5 mg·mL-1，從10110逐漸升溫蛋白發(fā)生去折疊，檢測(cè)其熱熔變化計(jì)算Tm值，即50%蛋白發(fā)生變性的相變溫度。1.6 N-糖基化分析：樣品經(jīng)糖苷酶PNgase F(New England biolabs)酶切18h后，用3倍體積的冰乙醇沉淀脫糖蛋白后離心取上清液于60烘干。用過量的2-AB（國藥試劑）于6

17、5標(biāo)記N-寡糖3小時(shí)，標(biāo)記后經(jīng)固相萃取小柱Cleanert HILIC（天津博納艾杰爾科技）去多余的標(biāo)記液及雜質(zhì)，純化后的N-寡糖溶液經(jīng)離心后取上清經(jīng)ACQUITY UPLC BEH 1.7um 2.1*150mm Glycan色譜柱（Waters）分離后先經(jīng)過熒光檢測(cè)器330nm激發(fā)光和420nm發(fā)射光檢測(cè)N-寡糖熒光信號(hào)，后串聯(lián)XEVO G2 Q-Tof質(zhì)譜（Waters）進(jìn)行N-寡糖的分子量鑒定。1.7 細(xì)胞增殖抑制活性試驗(yàn)采用人乳腺癌細(xì)胞系BT-474（ATCC HTB-20）檢測(cè)樣品對(duì)細(xì)胞增殖的抑制功能活性。樣品2倍比稀釋13個(gè)濃度加樣到鋪有BT-474細(xì)胞的培養(yǎng)板中，375%CO2

18、培養(yǎng)7天后，使用CellTiter 96® AQueous非放射性細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（Promega）顯色讀數(shù)。檢測(cè)結(jié)果為與自制參考品的相對(duì)活性，即四參數(shù)量效曲線EC50值之比。1.8 ADCC活性試驗(yàn)BT-474細(xì)胞與NK92 CD16a細(xì)胞以1：5比例鋪板，樣品3倍比稀釋10個(gè)濃度加樣，375%CO2孵育46h后離心取上清，使用CytoTox-Glo細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（Promega）顯色讀數(shù)。檢測(cè)結(jié)果為與自制參考品的相對(duì)活性，即四參數(shù)量效曲線EC50值之比。1.9 與HER2抗原的結(jié)合活性試驗(yàn)Recombinant HumanErbB2/HER2（北京義翹神州）12mg

19、3;mL-1包被于ELISA板上，樣品2倍比稀釋11個(gè)濃度加樣，孵育后使用HRP標(biāo)記anti-Human Ig G(Fc) antibody（Sigma）作為二抗進(jìn)行檢測(cè)，采用TMB顯色讀數(shù)。檢測(cè)結(jié)果為與自制參考品的相對(duì)結(jié)合活性，即四參數(shù)量效曲線EC50值之比。1.10 與HER2抗原的親和力分析使用Biacore T200分子相互作用分析儀（GE Healthcare）進(jìn)行親和力分析。Anti-Human Ig G(Fc) antibody（GE Healthcare）經(jīng)氨基偶聯(lián)試劑盒（GE healthcare）偶聯(lián)到CM5芯片上（GE Healthcare）后，1 mg/ml的樣品和Re

20、combinant Human ErbB2/HER2（北京義翹神州）依次通過流路，樣品被捕獲而HER2與樣品發(fā)生結(jié)合解離，最后使用氯化鎂再生芯片。使用5個(gè)不同濃度的HER2重復(fù)此循環(huán)，采用1:1 binding模式擬合數(shù)據(jù)計(jì)算親和力。1.11 與FcRn受體的親和力分析Recombinant Human FcRn、FcRIIIa V158、FcRIIIa F158（義翹神州）經(jīng)氨基偶聯(lián)試劑盒（GE healthcare）偶聯(lián)到CM5芯片上（GE Healthcare）后，樣品通過流路與芯片上的FcRn發(fā)生結(jié)合解離，用Tris-NaCl緩沖液再生芯片。使用6個(gè)不同濃度的樣品重復(fù)此循環(huán)，采用Two

21、 State Reaction模式擬合數(shù)據(jù)計(jì)算親和力。1.12 與FcRIIIa受體的親和力分析Biotin CAPture Reagent（GE Healthcare）雜交于CAP芯片（GE Healthcare）后，生物素標(biāo)記的Recombinant Human FcRIIIa V158、FcRIIIa F158（義翹神州）通過流路被鏈親和素捕獲固定于芯片，樣品經(jīng)過流路與芯片上的FcRIIIa發(fā)生結(jié)合解離，用鹽酸胍-氫氧化鈉再生芯片。使用6個(gè)不同濃度的樣品重復(fù)此循環(huán)，采用1:1 binding模式擬合數(shù)據(jù)計(jì)算親和力。2 結(jié)果2.1 CE-SDS純度和雜質(zhì)分析：還原CE-SDS是根據(jù)分子量大

22、小分離輕鏈、重鏈、非糖基化重鏈和其他雜質(zhì)的方法，能夠準(zhǔn)確的定量非糖基化重鏈的含量和抗體輕重鏈純度。圖1分析結(jié)果顯示，三個(gè)不同批次的MAb302的非糖基化重鏈的含量均小于1%，輕重鏈之和純度均大于97%（表1）。對(duì)三個(gè)批次多次檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行均值的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得知Mab302的非糖基化重鏈含量的95%置信區(qū)間為（0.77%0.83%），輕重鏈純度的95%置信區(qū)間為（97.3%97.6%），MAb302產(chǎn)品呈現(xiàn)高純度的同時(shí)也展現(xiàn)了良好的批間一致性。 表1MAb302的還原CE-SDS純度和雜質(zhì)分析結(jié)果Tab.1 The results of reduced CE-SDS purity and impu

23、rities analysis of MAb302圖1MAb302的還原型CE-SDS電泳圖譜Fig.1 The reduced CE-SDS electrophoretogram of MAb3022.2 SEC-HPLC單體純度和聚體雜質(zhì)分析：同毛細(xì)管凝膠電泳相似，SEC-HPLC也是根據(jù)分子大小分離主要成分和雜質(zhì)的方法。SEC-HPLC在天然情況下通過色譜填料孔徑的篩分將MAb302單體與其他高分子量和低分子量雜質(zhì)分離，其優(yōu)勢(shì)在于能夠準(zhǔn)確定量聚體和單體。為了鑒定聚體的聚合度，又進(jìn)行了SEC-DLS分析，通過串聯(lián)的DLS檢測(cè)器研究各峰的顆粒大小從而評(píng)估其分子量。分析結(jié)果顯示（圖2），三個(gè)不

24、同批次的MAb302的聚體含量均小于2%，均值的95%置信區(qū)間為（1.05%1.33%），單體純度均大于98%，均值的95%置信區(qū)間為（98.6%99.0%），遠(yuǎn)高于可接收標(biāo)準(zhǔn)95%。SEC-DLS分子量分析的結(jié)果顯示MAb302聚體的分子量基本是單體的兩倍左右，為二聚體（表2）。表2MAb302的單體純度和聚體含量、分子量分析結(jié)果Tab.2 The results of monomer and polymer as well as Mw analysis of MAb302圖2MAb302的SEC-HPLC圖譜Fig.2 The SEC-HPLC chromatogram of MAb302

25、2.3 圓二色譜掃描分析：除了通過提高純度控制雜質(zhì)對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的影響以外，抗體自身的正確折疊也是保障安全性和有效性的關(guān)鍵要素。圓二色譜通過測(cè)量樣品分別對(duì)遠(yuǎn)紫外波段和近紫外波段下左右偏振光吸收程度的差異來反應(yīng)Mab302二級(jí)結(jié)構(gòu)（螺旋、折疊和無規(guī)則卷曲）和三級(jí)結(jié)構(gòu)（氨基酸側(cè)鏈殘基）的折疊信息。對(duì)比Mab302與參比生物制劑的遠(yuǎn)紫外和近紫外（圖3）CD圖譜顯示，兩者圖形一致，幾乎可以重疊，顯示了Mab302與參比生物制劑相似的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，是Mab302正確折疊的證據(jù)。圖3MAb302與參比生物制劑的CD圖譜Fig.3 The Circular Dichroism Spectrum of MAb3

26、02 and the reference product2.4 Tm值分析：抗體的高級(jí)結(jié)構(gòu)決定了熱穩(wěn)定性，因而對(duì)其安全性有重要影響。DSC技術(shù)測(cè)量了Mab302和參比生物制劑在加熱過程中發(fā)生去折疊而產(chǎn)生的熱焓變化，推算Tm值反映了其50%天然高級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞時(shí)的相變溫度。相變溫度越高，熱穩(wěn)定性越好。單克隆抗體因?yàn)橛卸鄠€(gè)結(jié)構(gòu)域，通常會(huì)有多個(gè)相變溫度代表不同結(jié)構(gòu)域的去折疊。MAb302的Tm1值為72.65±0.1，Tm2值為85.08±0.1，而參比生物制劑的Tm1值為72.25±0.4，Tm2值為85.13±0.3（表3），MAb302的熱穩(wěn)定性與參比生物

27、制劑一致。表3Mab302與參比生物制劑的Tm值Tab.3 The Tm values of MAb302 and the reference product2.5 N-糖基化分析：對(duì)于由哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的MAb302來說，擁有正確的結(jié)構(gòu)和折疊尚不足以完全保障其有效性和安全性，還需要正確的糖基化修飾。糖基化修飾與單抗的功能緊密相關(guān)。首先，MAb302與參比生物制劑的N糖基化位點(diǎn)均發(fā)生在重鏈第297位天冬酰胺（數(shù)據(jù)未顯示），其次經(jīng)過脫糖熒光標(biāo)記色譜分析的結(jié)果顯示，MAb302和參比生物制劑均以G0F、G1F、G1F和G2F為主（圖4），具有相似的糖型多樣性，符合典型的單抗糖基化特征。根據(jù)N-寡糖

28、的特征性結(jié)構(gòu)（唾液酸、半乳糖、巖藻糖、高甘露糖）來統(tǒng)計(jì)MAb302和參比生物制劑的N-寡糖種類和比例（表4），可以看出兩者糖型分布總體高度相似，但略有差異，如在高甘露糖和唾液酸的含量上差異相對(duì)顯著。MAb302含高甘露糖和含唾液酸的N-寡糖的比例分別為3.63±0.66%和2.74±0.72%，而參比生物制劑的含高甘露糖和含唾液酸的N-寡糖的比例分別為5.74±0.44%和1.58±0.10%，參比生物制劑的高甘露糖含量比MAb302多了60%左右，而MAb302的唾液酸含量則比參比生物制劑多了70%左右，且唾液酸均為NANA，沒有發(fā)現(xiàn)NGNA。 表4M

29、Ab302與參比生物制劑的糖基化分析結(jié)果Tab.4 The N-glycan profiling of MAb302 and the reference product圖4MAb302與參比生物制劑的N-寡糖熒光色譜對(duì)比圖Fig.4 The fluoro-chromatograms of MAb302 and the reference product2.6BT-474細(xì)胞增殖抑制活性：MAb302在體內(nèi)的一種作用機(jī)制是：靶向定位于乳腺腫瘤，與腫瘤細(xì)胞表面的HER2分子結(jié)合使之解聚，從而抑制下游信號(hào)的激活阻止其繁殖6。BT-474細(xì)胞是人乳腺癌細(xì)胞，其表面大量表達(dá)了HER2分子，在體外將MAb

30、302作用于BT-474細(xì)胞能夠抑制其增殖，正是模擬了體內(nèi)的作用機(jī)制，而量效曲線的建立和半數(shù)有效濃度的計(jì)算能夠直接反映樣品對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制能力。三批MAb302的BT-474細(xì)胞增殖抑制相對(duì)活性為103±8%，而三批參比生物制劑的相對(duì)活性為103±5%（表5），兩者無顯著差異（P=0.96）(圖5)。 表5MAb302與參比生物制劑的BT-474細(xì)胞增殖抑制活性Tab.5 The BT-474 proliferation inhibiting bioactivity of MAb302 and the reference product圖5MAb302與參比生物制劑對(duì)BT-

31、474細(xì)胞的增殖抑制量效曲線圖Fig.5The response-dose curves of MAb302 and the reference product acting on BT-4742.7 ADCC活性除了抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖以外，MAb302的另一種作用機(jī)制7是通過誘導(dǎo)ADCC效應(yīng)激發(fā)免疫系統(tǒng)細(xì)胞殺傷癌細(xì)胞。體外的ADCC活性測(cè)試以BT-474為靶細(xì)胞，表達(dá)有FcRIIIa（CD16a）受體的NK細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，通過加入MAb302誘發(fā)NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷，反映其ADCC活性。參比生物制劑的ADCC活性是MAb302的90%（圖6）。圖6MAb302與參比生物制劑的ADCC活

32、性量效曲線圖Fig.6The ADCC response-dose curves of MAb302 and the reference product 2.8與HER2抗原的結(jié)合活性和親和力：無論是通過增殖抑制還是ADCC效應(yīng)，MAb302發(fā)揮功能的必要條件是與HER2分子的結(jié)合。與HER2分子更強(qiáng)的結(jié)合能影響更強(qiáng)的增殖抑制和ADCC活性。通過終點(diǎn)觀察的ELISA方法和動(dòng)態(tài)觀察的SPR技術(shù)（表6），兩項(xiàng)試驗(yàn)均證實(shí)了MAb302和參比生物制劑具有相似的與HER2的結(jié)合能力和親和力。表6MAb302、參比生物制劑與HER2抗原的結(jié)合活性及親和力Tab.6 The binding activity

33、 and affinity to HER2 of MAb302 and the reference product2.9與Fc受體的親和力：除了Fab段與抗原分子HER2的結(jié)合，MAb302 Fc段與Fc受體的結(jié)合也與其功能作用緊密相關(guān)。重要的Fc受體主要有FcRn和FcRIIIa，MAb302與它們的結(jié)合強(qiáng)弱直接關(guān)系到血清半衰期和誘發(fā)ADCC效應(yīng)的能力。通過SPR技術(shù)測(cè)定了MAb302和參比生物制劑與Fc受體的親和力常數(shù)KD(表7)，可以看出，不管是與半衰期相關(guān)的FcRn受體還是與ADCC相關(guān)的FcRIIIa受體的結(jié)合解離能力，兩者在同一個(gè)數(shù)量級(jí)上，無明顯差異。表7MAb302、參比生物制劑

34、與Fc受體的親和力Tab.7 The binding affinity to Fc receptors of MAb302 and the reference product3 討論與結(jié)論單克隆抗體雖然是巨大、復(fù)雜而且具有多重異質(zhì)性的分子，但是通過各種先進(jìn)的分析技術(shù)，我們能夠細(xì)致準(zhǔn)確地研究其分子結(jié)構(gòu)、雜質(zhì)特征含量、穩(wěn)定性、功能活性，反映單抗藥物的質(zhì)量、有效性和安全性，保障病患用藥的關(guān)鍵要求。雜質(zhì)含量的控制是單抗藥物關(guān)鍵質(zhì)量屬性中保障藥物安全性的重要標(biāo)志，在滿足如宿主DNA、宿主細(xì)胞蛋白、proteinA殘留等單抗藥物常見的工藝殘留雜質(zhì)符合安全標(biāo)準(zhǔn)和微生物安全的前提下，與蛋白本身相關(guān)的雜質(zhì)的控制

35、更能體現(xiàn)生產(chǎn)者對(duì)MAb302的分子結(jié)構(gòu)和工藝設(shè)計(jì)的心思。小于2%的聚體含量且聚合度為最小僅為二聚體，不但從含量上控制了雜質(zhì)遠(yuǎn)在安全限度以下，而且從特性上降低了其免疫原性的風(fēng)險(xiǎn)8,9,10，聚合程度越低，免疫原性越弱。免疫原性也與糖基化中高甘露糖含量11和唾液酸中NGNA12的含量相關(guān)，MAb302較低的高甘露糖含量和NGNA的零存在是從分子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)上確保低免疫原性的實(shí)例。在高純度、低雜質(zhì)以及單抗分子正確的翻譯后修飾的基礎(chǔ)上，正確的結(jié)構(gòu)也是確保MAb302安全和有效的重要因素。生產(chǎn)者設(shè)計(jì)了MAb302與參比生物制劑高度相似的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，是通過分子設(shè)計(jì)保障所需活性和功能的體現(xiàn)。而與安全性密切相

36、關(guān)的穩(wěn)定性表現(xiàn)上，MAb302需要加熱到72以上才開始明顯地去折疊，完全去折疊需要80以上的高溫，足以保證其在正確的儲(chǔ)藏溫度下蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性?？笻ER2單克隆抗體的體外功能活性主要表現(xiàn)為對(duì)BT-474細(xì)胞的增殖抑制作用和介導(dǎo)ADCC效應(yīng)。與同樣以HER2為靶標(biāo)的參比生物制劑相比，MAb302在此兩種活性上與其沒有顯著差異。這可能來自于MAb302具有與參比生物制劑相似的與HER2抗原的結(jié)合能力和親和力，與Fc受體一致的親和力，也與兩者相似的糖基化特征相關(guān)。糖基化的設(shè)計(jì)對(duì)單抗的功能活性、體內(nèi)半衰期有著至關(guān)重要的影響作用13。沒有糖基化修飾的單抗蛋白，是不存在ADCC活性，也不能夠與Fc受體

37、結(jié)合的14,15。MAb302>99%的分子都是具有正確位點(diǎn)的糖基化修飾的，這是保障其具有針對(duì)腫瘤細(xì)胞的功能活性的先決條件。而與參比生物制劑高度相似的主要糖型和含量，是兩者有效性可比的重要依據(jù)。對(duì)特殊類型的N-寡糖分析結(jié)果顯示，MAb302的高甘露糖含量較參比生物制劑低而唾液酸含量較參比生物制劑高，這可能揭示了MAb302具有更長(zhǎng)的半衰期，因?yàn)楦吒事短堑拇嬖跁?huì)引起甘露糖受體16對(duì)血清中單抗這類糖蛋白的清除，而唾液酸的含量高17會(huì)增加血清半衰期。另外，在另一個(gè)與半衰期相關(guān)的受體FcRn18的結(jié)合能力上，兩者的親和力具有一致水平。通過對(duì)關(guān)鍵質(zhì)量屬性的分析研究，表明MAb302作為一個(gè)以HER

38、2為靶點(diǎn)的人源化單克隆抗體靶向生物制劑，其精心設(shè)計(jì)的分子結(jié)構(gòu)和通過工藝設(shè)計(jì)有效控制的高純度，能夠使其表現(xiàn)出與參比制劑相同的生物等效功能作用，即通過抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和引起免疫系統(tǒng)對(duì)靶細(xì)胞的攻擊達(dá)到治療療效，而且也在免疫原性和穩(wěn)定性上都表現(xiàn)出低風(fēng)險(xiǎn)，具備良好的安全性和有效性。REFERENCES1 ZHENG S, BAI J Q, LI J et al. The pathologic characteristics of breast cancer in China and its shift during 1999-2008: a national-wide multicenter cro

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48、840.850.860.840.850.85Lot20.700.730.750.720.730.74Lot30.820.820.840.820.830.84Sum of HC and LC%Lot197.397.297.397.397.297.3Lot297.897.797.697.897.697.6Lot397.497.397.497.597.597.3表2 MAb302的單體純度和聚體含量、分子量分析結(jié)果Tab.2 The results of monomer and polymer as well as Mw analysis of MAb302Test 1Test 2Test 3Tes

49、t 4Test 5Test 6Polymer%Mw/DaLot305754Lot324169Lot353645Monomer%Mw/DaLot198.998.798.698.798.898.8162886Lot299.199.299.2162131Lot398.898.598.498.498.498.7161709表3 MAb 302與參比生物制劑的Tm值Tab.3 The Tm values of MAb302 and the reference prod

50、uctTm1 Tm2 MAb 302 Lot172.6285.05MAb 302 Lot272.7685.19MAb 302 Lot372.5885.01Reference Lot172.5284.95Reference Lot271.7485.54Reference Lot372.4884.90表4 MAb 302與參比生物制劑的糖基化分析結(jié)果Tab.4 The N-glycan profiling of MAb302 and the reference productHigh mannose%Defucosylated%Galactosylated%Sialylated%MAb 302 Lot13.399.3943.412.27MAb 302 Lot23.127.5750.632.38MAb 302 Lot34.389.2747.013.56Reference Lot16.2114.0850.7