生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)操作指導(dǎo)(共享)

1、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)操作指導(dǎo)天津科技大學(xué)生物化學(xué)課程組2006.12目錄生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)須知2實(shí)驗(yàn)室一些常用知識(shí)介紹3實(shí)驗(yàn)一：離子交換法分離氨基酸7實(shí)驗(yàn)二：垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)9實(shí)驗(yàn)三：馬鈴薯多酚氧化酶制備及性質(zhì)實(shí)驗(yàn)13實(shí)驗(yàn)四：堿性蛋白酶活力的測(cè)定 16實(shí)驗(yàn)五：植物組織中dna和rna的提取和鑒定 19實(shí)驗(yàn)六：糖酵解中間產(chǎn)物的鑒定22實(shí)驗(yàn)七：綜合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)一蛋白質(zhì)的制備及其含量測(cè)定24實(shí)驗(yàn)八:還原糖和總糖的測(cè)定（3, 5二硝基水楊酸法）35實(shí)驗(yàn)十：氨基酸的分離鑒定一紙層析法39實(shí)驗(yàn)十一：細(xì)菌血栓溶解酶活性測(cè)定41實(shí)驗(yàn)十二：可溶性糖的硅膠g薄層層析43實(shí)驗(yàn)十三：植物材料中總黃酮的提純與鑒定4

2、4實(shí)驗(yàn)十四：ief/sds-page 雙向電泳分離鑒定蛋白質(zhì)45附錄49一、實(shí)驗(yàn)室主要儀器使用操作規(guī)程與注意事項(xiàng)49二、常用緩沖溶液的配制5560三、硫酸錢飽和度的常用表生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)須知1. 實(shí)驗(yàn)室規(guī)則(1) 實(shí)驗(yàn)課必須提前5分鐘到實(shí)驗(yàn)室，不遲到,不早退，應(yīng)白覺遵守課堂紀(jì)律。(2) 使用儀器、藥品、試劑和各種物品必須注意節(jié)約，應(yīng)特別注意保持藥品和試劑的純 凈，嚴(yán)防混雜污染。(3) 實(shí)驗(yàn)臺(tái)、試劑藥品架必須保持整潔，儀器藥品擺放井然冇序。實(shí)驗(yàn)完畢，需將藥品、 試劑排列整齊，儀器洗凈倒置放好，實(shí)驗(yàn)臺(tái)面抹拭干凈，經(jīng)教師驗(yàn)收儀器后，方可離開實(shí)驗(yàn) 室。(4) 使用和洗滌儀器時(shí)，應(yīng)小心謹(jǐn)慎，防止損壞儀器。使

3、用精密儀器時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格遵守操作 規(guī)程，發(fā)現(xiàn)故障應(yīng)立即報(bào)告教師，不要自己動(dòng)手檢修。(5) 在實(shí)驗(yàn)過程中要聽從教師的指導(dǎo)，嚴(yán)肅認(rèn)真地按操作規(guī)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并簡耍、準(zhǔn)確 地將實(shí)驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)記錄在實(shí)驗(yàn)記錄木上。課示寫出實(shí)驗(yàn)報(bào)告，由課代表收齊交給教師。(6) 儀器損壞時(shí)，應(yīng)如實(shí)向教師報(bào)告，真填寫損壞儀器登記表，然后補(bǔ)償一定金額。(7) 每次實(shí)驗(yàn)課安排同學(xué)車侖流值日，值日生耍負(fù)責(zé)當(dāng)天實(shí)驗(yàn)的衛(wèi)生和安全檢查。2. 實(shí)驗(yàn)記錄實(shí)驗(yàn)課前應(yīng)認(rèn)真預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，將實(shí)驗(yàn)名稱、實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和步驟等簡單扼要寫 在記錄本上。實(shí)驗(yàn)記錄本要標(biāo)明頁碼，不能隨意撕掉任何一頁。實(shí)驗(yàn)中使用的試劑純度和終濃度以及使用的儀器類型等都要記錄清楚

4、。實(shí)驗(yàn)中觀察到的 現(xiàn)象、結(jié)果和得出的數(shù)據(jù)，應(yīng)及時(shí)直接記在記錄本上，絕對(duì)不可以隨意記在單片紙上。原始 記錄必須準(zhǔn)確、簡練、清楚。3. 實(shí)驗(yàn)報(bào)告的書寫實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)及時(shí)整理和總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，寫出實(shí)驗(yàn)報(bào)告。(1) 標(biāo)題標(biāo)題應(yīng)包括實(shí)驗(yàn)名稱、實(shí)驗(yàn)時(shí)間、實(shí)驗(yàn)室名稱、實(shí)驗(yàn)組號(hào)、實(shí)驗(yàn)者及同組者姓名、實(shí)驗(yàn) 室條件。（2）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?）實(shí)驗(yàn)原理應(yīng)簡述基本原理，不要完全照抄實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書。（4）操作步驟操作步驟（或方法）可以采用流程圖的方式或h行設(shè)計(jì)的表格來表達(dá)。（5）實(shí)驗(yàn)結(jié)果將實(shí)驗(yàn)中的現(xiàn)彖、數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、分析，得出相應(yīng)的結(jié)論。建議盡量使川圖表法來表示 實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這樣可以使實(shí)驗(yàn)結(jié)果清楚明了。（6）討論包括對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及觀察

5、現(xiàn)彖的小結(jié)、對(duì)實(shí)驗(yàn)中遇到的問題和思考題的探討以及對(duì)實(shí)驗(yàn)的 改進(jìn)意見等。4. 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)情況（1（）%） 實(shí)驗(yàn)操作情況（20%）實(shí)驗(yàn)報(bào)告情況（30%） 實(shí)驗(yàn)考試成績（40%）實(shí)驗(yàn)室一些常用知識(shí)介紹一. 玻璃儀器的洗滌及一些常用的洗滌劑1. 玻璃儀器的洗滌（1）新購買的玻璃儀器，首先用白來水洗去表面灰垢，然后用洗衣粉刷洗，h來水沖凈后, 浸泡在1%2%鹽酸溶液中過棧以除去玻璃表血的堿性物質(zhì)。最后，用自來水沖洗干凈，并 用蒸憎水沖洗2次。（2）對(duì)于使用過的玻璃儀器，應(yīng)先用h來水沖洗，再用毛刷蔭取洗衣粉刷洗。用h來水充分 沖洗后再用蒸僻水沖洗2次。凡洗凈的玻璃儀器壁上都不應(yīng)帶有水珠

6、，否則表示尚未洗凈, 需重新洗滌。（3）比較臟的儀器或不便刷洗的儀器，使川前應(yīng)丿ij流水沖洗，以除去粘附物，如果儀器上冇 凡士林或其他油污，應(yīng)先用軟紙擦除，再用有機(jī)溶劑擦凈，最后用口來水沖洗。待儀器晾干 示，放入倂酸洗液屮浸泡過夜。取出后用自來水充分沖洗，再用蒸館水沖洗2次。（4）普通玻璃儀器可在烘箱內(nèi)烘干，但定量的玻璃儀器如吸管、滴定管、量筒、容量瓶等 不能加熱，應(yīng)晾干備用。另外，分光光度計(jì)中的比色杯的四壁是用特殊膠水粘合而成，受熱 示會(huì)散架，所以也不能烘干。對(duì)疑有傳染性的樣品（如肝炎病人的血清），其容器應(yīng)先消毒再清洗。盛過劇毒藥物或 放射性同位素物質(zhì)的容器，應(yīng)先經(jīng)過專門處理后再清洗。2.

7、一些常用的洗滌劑a. 肥皂水或洗衣粉溶液這是最常用的洗滌劑，主要是利用其乳化作用以除去污垢，-般玻璃儀器均可用其刷洗。b. 鉆酸洗液（重鉆酸鉀一硫酸洗液）餡酸洗液廣泛用于玻璃儀器的洗滌，其清潔效力來占于它的強(qiáng)氧化性(6價(jià)洛)和強(qiáng)酸性。 餡酸洗液具有強(qiáng)腐蝕性，使用時(shí)應(yīng)注意安全。洛酸洗液可反復(fù)使用多次，如洗液由紅棕色變 為綠色或過于稀釋則不宜再用。c. 5%-10%乙二胺四乙酸二鈉(edta-na2)溶液:加熱煮沸,利用ed-ta和金屬離子的 強(qiáng)配位效應(yīng)，可去除玻璃器1111內(nèi)部鈣鎂鹽類的口色沉淀和不易溶解的重金屬鹽類。d. 45%的尿素洗液：是蛋白質(zhì)的良好溶劑，適用于洗滌盛蛋白質(zhì)制劑血樣的容器。

8、e. 乙醉一硝酸混合液用于清洗一般方法難于洗凈的冇機(jī)物，最適合于洗滌滴定管。二. 生物化學(xué)常用緩沖液1. 磷酸鹽緩沖液磷酸鹽是生物化學(xué)研究中使用最廣泛的一種緩沖劑，由于它們是二級(jí)解離，有2個(gè)pka值, 所以用它們配制的緩沖液,ph范圍最寬：nabpoq： pka)=2.12, pka2=7.21na2hp04： pkai=7.2l pka2= 12.32配酸性緩沖液：用nah2p04, ph值為14。配中性緩沖液：用混合的兩種磷酸鹽,ph值為6-8o配堿性緩沖液：用na2hp04, ph值為1()12 。磷酸鹽緩沖液的優(yōu)點(diǎn)為： 容易配制成各種濃度的緩沖液； 適用的ph范圍寬； ph受溫度的影響

9、??； 緩沖液稀釋后ph變化小，如稀釋1()倍后ph的變化小于().1。其缺點(diǎn)為： 易與常見的ca2 mg2+以及重金屬離子締合生成沉淀； 會(huì)抑制某些生物化學(xué)過程，如對(duì)某些酶的催化作用會(huì)產(chǎn)生某種程度的抑制作用。2tris緩沖液(三輕甲基氨基甲烷)tris緩沖液在生物化學(xué)研究中使用的越來越多，冇超過磷酸鹽緩沖液的趨勢(shì)，如在sds- 聚內(nèi)烯酷膠凝膠電泳中己都使用tris緩沖液，而很少再用磷酸鹽。tris緩沖液的常用有效ph范圍是在“小性”范圍，例如tris-hcl 緩沖液 ph 值為 7.58.5tris-磷酸鹽緩沖液ph值為5.09.0tris-hcl緩沖液的優(yōu)點(diǎn)是: 因?yàn)閠ris堿的堿性較強(qiáng)，所

10、以可以只用這一種緩沖體系，配制ph范圍由酸性到堿性 的大范圍ph值的緩沖液； 對(duì)生物化學(xué)過程t擾很小，不與鈣離子及重金屬離子發(fā)半沉淀。其缺點(diǎn)是： 緩沖液的ph值受溶液濃度影響較人，緩沖液稀釋10倍,ph值的變化人于0.1; 溫度效應(yīng)大，溫度變化対緩沖液ph值的影響很大，例如4°c時(shí)緩沖液的ph值為8.4, 則37 °c時(shí)的ph值為7.4,所以一定要在使用溫度下進(jìn)行配制，室溫下配制的tris-hcl 緩沖液不能用于04°c; 易吸收空氣屮的co2,所以配制的緩沖液要蓋嚴(yán)密封； 此緩沖液對(duì)某些ph電極發(fā)生一定的t擾作用，所以要使用與tris溶液具有兼容性的電 極。3硼

11、酸鹽緩沖液常用的有效ph范圍是：ph值為8.510.0,因而它是堿性范圍內(nèi)最常用的緩沖液，其優(yōu)點(diǎn) 是配制方便，只使用-種試劑，缺點(diǎn)是能與很多代謝產(chǎn)物形成絡(luò)合物，尤其是能與糖類的短 基反應(yīng)生成穩(wěn)定的復(fù)合物而使緩沖液受到干擾。4.氨基酸緩沖液此緩沖液使用的范圍寬，可用于ph值為2.011.0,例如最常用的有：甘氨酸-hc1緩沖液：ph值為2.05.0 o甘氨酸-naoh緩沖液：ph值為8.011.0 。甘氨酸-tris緩沖液：ph值為&0-11.0(此緩沖液用于廣泛使用的sds聚丙烯酰胺凝膠 電泳的電極緩沖液)。紐氨酸緩沖液：ph值為5.56.5 o甘氨酰胺(glycine amide)緩

12、沖液：ph值為7.8-s.8。甘氨酰甘氨酸(glycylglycine緩沖液：ph值為8.0-9.0 。此類緩沖體系的優(yōu)點(diǎn)是：為細(xì)胞組分和各種提取液提供更接近的天然環(huán)境。其缺點(diǎn)是：與竣酸鹽和磷酸鹽緩沖體系相似，也會(huì)干擾某些牛物化學(xué)反應(yīng)過程，如代謝過 程等；試劑的價(jià)格鮫高。三. ph值的測(cè)定測(cè)定溶液ph值通常有兩種方法，最簡便但較粗略的方法是用ph試紙，分為廣泛和 精密ph試紙兩種。精確測(cè)定溶液ph值要使用ph計(jì)，其精確度可達(dá)0.005個(gè)ph單位，關(guān)鍵是要正確 選用和校對(duì)ph電極。過去是使用兩個(gè)電極，即玻璃電極和參比電極，現(xiàn)在它們己淘汰，被 兩種電極合一的復(fù)合電極所代替。玻璃電極對(duì)溶液中的氫離子

13、濃度敏感，其頭部為一薄玻璃泡，內(nèi)裝冇0.1mol/l hc1,上 部由銀-氯化銀電極與伯金絲聯(lián)結(jié)。當(dāng)玻璃電極浸入樣品溶液時(shí)，薄玻璃泡內(nèi)外兩側(cè)的電位 差取決于溶液的ph值，即玻璃電極的電極電位隨樣品溶液中氫離子濃度(活度)的變 化而變化。參比電極的功能是提供一個(gè)怛定的電位，作為測(cè)最玻璃電極薄玻璃泡內(nèi)外兩側(cè)電位差 的參照。常用的參比電極是廿汞電極(hg/hgcl)或銀氯化銀電極(ag/agcl) o參比電極 電位是氯離子濃度的函數(shù)，因而電極內(nèi)充以4mol/l kc1或飽和kc1,以保持恒定的氯離 子濃度和恒定的電極電位。使用飽和kc1是為使電極內(nèi)沉積有部分kc1結(jié)品，以使kc1 的飽和濃度不受溫度

14、和濕度的影響?，F(xiàn)在ph值測(cè)定已都改用玻璃電極與參比電極合一的復(fù)合電極，即將它們共同組裝在 -根玻璃管使用時(shí)應(yīng)注意： 經(jīng)常檢査電極內(nèi)的4mol/lkcl溶液的液面，如液而過低則應(yīng)補(bǔ)充4mol/lkc 1溶液。(2) 玻璃泡極易破碎，使用時(shí)必須極為小心。復(fù)合電極長期不用，可浸泡在2mol/l kc1溶液屮，平時(shí)可浸泡在無離子水或緩沖溶液 中，使用時(shí)取出，用洗并沖洗玻璃泡部分，然后用吸水紙吸干余水，將電極浸入待測(cè)溶液中， 稍加攪拌，讀數(shù)時(shí)電極應(yīng)靜止不動(dòng)，以免數(shù)字跳動(dòng)不穩(wěn)定。(4)使川時(shí)復(fù)合電極的玻璃泡和半透膜小孔耍浸入到溶液屮。使用前要用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液校正電極，其數(shù)據(jù)見書后附錄，常用的3種標(biāo)準(zhǔn)緩沖液ph

15、值 4.00、6.88和9.23(20 °c ),精度為土 0.002ph單位。校正時(shí)先將電極放入6.88的標(biāo)準(zhǔn) 緩沖液中，用ph計(jì)上的”標(biāo)準(zhǔn)”旋鈕校正ph讀數(shù)，然后取出電極洗凈，再放入ph 值為4.00或9.23的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液屮，用”斜率”旋鈕校正ph讀數(shù)，如此反復(fù)多次，h 至二點(diǎn)校正正確，再用第三種標(biāo)準(zhǔn)緩沖液檢查。標(biāo)準(zhǔn)緩沖液不用時(shí)應(yīng)冷藏。(6)電極的玻璃泡容易被污染。若測(cè)定濃蛋白質(zhì)溶液的ph值吋，玻矚泡表面會(huì)覆蓋一層 蛋白質(zhì)膜，不易洗凈而干擾測(cè)定，此時(shí)可用o.lmol/l hc1的llnurnl胃蛋白酶溶液浸泡過 夜。若被油脂污染，可用丙酣浸泡。若電極保存時(shí)間過長，校正數(shù)值不準(zhǔn)時(shí)，

16、可將電極放入 2mol/lkc1溶液中,40 °c加熱lh以上,進(jìn)行電極活化。ph測(cè)定時(shí)會(huì)有幾方面的謀差：鈉離子的干擾：多數(shù)復(fù)合電極對(duì)na+和h+都非常敏感，尤其是高ph值的堿性溶 液，na的t擾更加明顯。例如,當(dāng)na+濃度為0.1 mol/l時(shí)，可使ph值偏低0.40.5個(gè) 單位。為減少na+對(duì)ph測(cè)定的干擾，每個(gè)復(fù)合電極都應(yīng)附有-條校正na+干擾的標(biāo)準(zhǔn) 曲線，有的新式的復(fù)合電極具有na+不透過性能，如不具備以上兩個(gè)條件，則可以將電極 內(nèi)的kc1換成nacl。(2濃度效應(yīng):溶液的ph值與溶液屮緩沖離了濃度和其他鹽離了濃度有關(guān)，因?yàn)槿芤簆h 值取決于溶液中的離子活度而不是濃度，只有在

17、很稀的溶液中，離子的活度才與其濃度相 等。生化實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常配制比使用濃度高10倍的”貯液”，使用時(shí)再稀釋到所需濃度，由 于濃度變化很人，溶液ph會(huì)有變化，因此稀釋后仍需對(duì)其ph進(jìn)行調(diào)整。(3) 溫度效應(yīng)：有的緩沖液的ph受溫度影響很大，如tris緩沖液，因此配制和使用都要在 同一溫度下進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)離子交換法分離氨基酸一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)用陽離子交換樹脂柱分離氨基酸的操作方法和基木原理。二、實(shí)驗(yàn)原理離子交換層析(ion exchange chromatography,簡稱ice)是分析和制備樣品混合物的液 固相層析方法，是基于待測(cè)物質(zhì)的陽離了或陰離了和相對(duì)應(yīng)的離了交換劑間的靜電結(jié)合， 即根據(jù)物質(zhì)的酸堿性

18、、極性等差界，通過離子間的吸附和脫吸附原理將電解質(zhì)溶液各紐分分 開。它是從復(fù)朵混合物體系中分離性質(zhì)極為相似的生物分子的有效手段0。由于帶電荷不 同的各種物質(zhì)對(duì)離了交換劑有不同親和力，通過改變洗脫液的離了強(qiáng)度和ph值，控制這種 親和力，即可使這些物質(zhì)依據(jù)親和力人小順序依次從層析柱屮洗脫下來。氨基酸是兩性電解質(zhì)，分子上的凈電荷取決于氨基酸的等電點(diǎn)和溶液的ph值，各種氨 基酸分子結(jié)構(gòu)不同，在同一 ph值時(shí)所帶電荷的性質(zhì)（正、負(fù)）和多少不同，與離了交換樹 脂的親和力有差異，因此可根據(jù)親和力從小到大的順序被洗脫液分別洗脫卜來，達(dá)到分離的 效果。三、儀器與試劑（一）實(shí)驗(yàn)器材（1）玻璃層析柱（2）試管（3）

19、移液管（4）恒圧洗脫瓶（5）部分收集器（6）水浴鍋（7）分光光度計(jì)（8）電爐（二）材料與試劑（1）苯乙烯磺酸鈉型樹脂（100200目）（2）2mol/l鹽酸溶液（3）2mol/l氫氧化鈉溶液（4）標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液：將天門冬氨酸和賴氨酸分別配成2mg/ml的0.1mol/l鹽酸溶液。（5）混合氨基酸溶液：將上述天門冬氨酸和賴氨酸溶液按1： 4比例混合。（6）檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸溶液（ph5.8,鈉離子濃度0.45mol/l）：取檸檬酸14.25克、氫 氧化鈉9.30克分別溶于水后混合，加入濃鹽酸5.25毫升，定容至500毫升；4c冰箱保存。（7）顯色劑：2克水合苗三酮溶于95%乙醇中,加水至10

20、0毫升。四、操作步聚（1）層析柱的準(zhǔn)備：將強(qiáng)酸性陽離了交換樹脂用氫氧化鈉處理成na*型后洗至中性，攪拌1 小時(shí)后裝入層析柱，使之白然降沉到一定高度，用緩沖液平衡。（2）平衡：用ph5.8的檸檬酸緩沖液沖洗平衡離子交換柱，調(diào)節(jié)流速，收集洗脫液至4倍 床體積即可上樣。（3）加樣分離：將液面緩慢放至貼近層析柱表曲，由柱上端仔細(xì)加入氨基酸混侖液0.250.5 亳升，同時(shí)開始收集流出液。當(dāng)樣品液彎月血靠近樹脂頂端時(shí)，立即加入0.5毫升檸檬酸緩 沖液。待緩沖液彎月血靠近樹脂頂端時(shí)，再加入0.5毫升檸檬酸緩沖液。如此重復(fù)兩次，然 后用滴管小心注入檸檬酸緩沖液（切勿攪動(dòng)床面）。川試管收集洗脫液，每管收集1毫升

21、， 直至無氨基酸流出為止。（4）氨基酸的鑒定：向各管收集液中加入1毫升水合苗三酮顯色劑并混勻，在沸水浴中加 熱15分鐘，冷至室溫測(cè)定光密度值。以收集的管數(shù)為橫坐標(biāo)，以吸光度值a為縱坐標(biāo)，繪 制洗脫曲線。（用以已知兩種氨基酸的純?nèi)芤簽闃悠?，按上述方法和條件分別操作，將得到 的洗脫曲線與混合氨基酸的洗脫曲線對(duì)照，即可確定兩個(gè)峰為何種氨基酸。）五、思考題1. 何謂氨基酸的離子交換？本實(shí)驗(yàn)采用的離子交換劑屬于哪一種？2. 離子交換樹脂用緩沖液平衡，為何乂用緩沖液沖洗？實(shí)驗(yàn)屮為什么要用ph5.8的檸檬酸緩 沖液？可不可以用其它ph值的緩沖液？如果可以，應(yīng)選用的ph為多少？并闡述原理。3. 苗三酮顯色劑在

22、與氨基酸顯色時(shí)，是為氨基酸的什么基團(tuán)反應(yīng)？反應(yīng)條件是什么？顯色吋 為什么要沸水浴加熱？顯色原理是什么？4. 木實(shí)驗(yàn)分離的兩種氨基酸，是否可以采用陰離了交換樹脂分離，如果使用陰離了樹脂，條 件和結(jié)果如何？請(qǐng)說明原理。5. 除氨基酸外，用離子交換柱層析法還適合分離哪些物質(zhì)？為什么？實(shí)驗(yàn)二:垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（sds-page）測(cè)定蛋口質(zhì)的分子量的原理和基本 操作技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在一定的ph條件下解離而帶電荷。當(dāng)溶液的ph大于蛋白 質(zhì)的等電點(diǎn)（pl）時(shí)，蛋白質(zhì)本身帶負(fù)電，在電場(chǎng)屮將向正極移動(dòng)：當(dāng)溶液的ph小于蛋 白質(zhì)的

23、等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電，在電場(chǎng)中將向負(fù)極移動(dòng)；蛋白質(zhì)在特定電場(chǎng)中移動(dòng) 的速度取決于其木身所帶的凈電荷的多少、蛋白質(zhì)顆粒的大小和分了形狀、電場(chǎng)強(qiáng)度 等。聚丙烯酰胺凝膠是由一定量的內(nèi)烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合而成的三維網(wǎng)狀孔結(jié) 構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)采用不連續(xù)凝膠系統(tǒng)，調(diào)整雙內(nèi)烯酰胺用量的多少，對(duì)制成不同孔徑的 兩層凝膠；這樣，當(dāng)含有不同分子量的蛋口質(zhì)溶液通過這兩層凝膠時(shí)，受阻滯的程 度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率。由于上層膠的孔徑較人，不同大小的蛋白質(zhì)分子在 通過大孔膠時(shí)，受到的阻滯基本相同，因此以相同的速率移動(dòng)；當(dāng)進(jìn)入小孔膠時(shí)， 分了量人的蛋白質(zhì)移動(dòng)速度減慢，因而在兩層凝膠的界面處，樣品被壓縮成很窄的 區(qū)帶。這就

24、是常說的濃縮效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。同時(shí)，在制備上層膠（濃縮膠）和下層 膠（分離膠）吋，采用兩種緩沖體系；上層膠ph二6. 76. 8,下層膠ph = 8. 9； tris hci緩沖液中的tris用于維持溶液的電中性及ph,是緩沖配對(duì)離了； ci是前導(dǎo) 離子。在ph6.8時(shí)，緩沖液中的gly為尾隨離子，而在ph = 8.9吋，gly的解離度 增加；這樣濃縮膠和分離膠之間ph的不連續(xù)性，控制了慢離子的解離度，進(jìn)而達(dá)到 控制其冇效遷移率的。不同蛋白質(zhì)具冇不同的等電點(diǎn)，在進(jìn)入分離膠后，各種 蛋口質(zhì)由于所帶的靜電荷不同，而有不同的遷移率。由于在聚丙烯酰胺凝膠電泳屮 存在的濃縮效應(yīng)，分子篩效應(yīng)及電荷效應(yīng)，使

25、不同的蛋口質(zhì)在同一電場(chǎng)屮達(dá)到有效 的分離。如果在聚內(nèi)烯酰胺凝膠中加入一定濃度的十二烷基硫酸鈉(sds),由于sds帶 有人量的負(fù)電荷，且這種陰離子表面活性劑能使蛋白質(zhì)變性，特別是在強(qiáng)還原劑如 疏基乙醇存在下，蛋口質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被還原，肽鏈完全伸展，使蛋口質(zhì)分子與 sds充分結(jié)合，形成帶負(fù)電性的蛋白質(zhì)一sds復(fù)合物；此吋，蛋白質(zhì)分子上所帶的負(fù) 電荷量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過蛋白質(zhì)分子原有的電荷最，掩蓋了不同蛋白質(zhì)間所帶電荷上的差異。 蛋白質(zhì)分子量愈小，在電場(chǎng)中移動(dòng)得愈快；反之，愈慢。蛋白質(zhì)的分子最與電泳遷 移率之間的關(guān)系是：mr=k(10-b，b) logmr=logkb r”式中mr蛋白質(zhì)的分子量；logk

26、截距；b斜率；乩相対遷移率。實(shí)驗(yàn)證明，蛋白質(zhì)分了量在15,000200,000的范圍內(nèi)，電泳遷移率與分了量 的對(duì)數(shù)之間呈線性關(guān)系。蛋口質(zhì)的相對(duì)遷移率監(jiān)=蛋口質(zhì)樣品的遷移距離/染料(漠 酚藍(lán))遷移距離。這樣，在同一電場(chǎng)中進(jìn)行電泳，把標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移率與相應(yīng) 的蛋白質(zhì)分了量對(duì)數(shù)作圖，由未知蛋白的相對(duì)遷移率可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出它的分了 量。sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)法測(cè)定蛋口質(zhì)的分子量具有簡便、快速、重 復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，是h前一般實(shí)驗(yàn)室常用的測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的方法。三、試劑及主要器材1. 主耍試劑1) 標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合液內(nèi)含：磷酸化酶(mw 94, 000),牛血清蛋白(mw 67,

27、 000),肌動(dòng)蛋白(mw 43, 000)，磷酸肝 酶(mw 30, 000)和溶菌酶(mw 14,000)2) 30%凝膠貯備液：acr 30g, bis 0. 8g,加蒸錦水至100ml3) 分離膠緩沖液(1. 5mol / l) : tris 18. 15g,加水溶解,6mol/l hc1 調(diào) ph8. 9,定容 100ml4) 濃縮膠緩沖液(0. 5mol / l): tris 6g,加水溶解,6mol/l hc1調(diào)ph6. 8,并定容 到 looml5) 電極緩沖液(ph8. 3)： sds lg, tris 6g, gly 28. 8g,加水溶解并定容到loooml。用 時(shí)稀釋五

28、倍。6) 10%sds7) 10%過硫酸鞍(新鮮配制)8) 1%temed9) 上樣緩沖液:0. 5mol / l tris-hcl ph6. 81. 25ml, 50% 甘油 4ml, 10%sds 2ml,疏基乙醇0. 4ml, 0.1%漠酚藍(lán)0. 4ml,加蒸餡水定溶至10ml<>10) 0.25%考馬斯亮藍(lán)r-250染色液：考馬斯亮藍(lán)r - 250 1.25g, 50%卬醇454譏， 冰乙酸46mlo11）脫色液：冰乙酸35ml,蒸錨水465 ml012）未知分子量的蛋口質(zhì)樣品（lmg/ml ）2. 實(shí)驗(yàn)器材1）dycz-24d垂直板電泳槽（北京市六一儀器廠）2）電泳儀3）

29、長滴管及微量加樣器4）燒杯（250ml八 500ml）、量筒（500ml> 250ml）、培養(yǎng)皿（15cmx 1 5cm）5）注射器等 四、實(shí)驗(yàn)操作1. 裝板將密封用硅膠框放在平玻璃上，然后將凹型玻璃與平玻璃重疊，將兩塊玻璃立 起來使底端接觸桌面，用手將兩塊玻璃夾住放入電泳槽內(nèi)，然后插入斜插板到適屮 程度，即可灌膠。2. 凝膠的聚合分離膠和濃縮膠的制備：按卜-表屮溶液的順序及比例，配h 10%的分離膠和4.8%的濃縮膠。試劑名稱10%的分離膠/ml4. 8%的濃縮膠/mlacr/bis 30%51.6分離膠緩沖液（兇89）3. 750濃縮膠緩沖液（兇68）01.2510%sds0. 15

30、0. 110%過硫酸謖0. 10. 1水54. 95temed11按上表各液加入混勻后配制成分離膠后，將凝膠液沿凝膠腔的長玻璃板的內(nèi)而緩 緩用滴管滴入，小心不要產(chǎn)生氣泡。將膠液加到距短玻璃板上沿2cm處為止，約5n±。 然后用細(xì)滴管或注射器仔細(xì)注入少量水，約0. 5-lmlo室溫放置聚合30-40mino待分離膠聚合后，用濾紙條輕輕吸去分離膠表而的水分，按上表制備濃縮膠。用 長滴管小心加到分離膠的上面，插入樣品模子（梳子）；待濃縮膠聚合后，小心拔出樣 品模子。3. 蛋白質(zhì)樣品的處理若標(biāo)準(zhǔn)蛋口質(zhì)或欲分離的蛋口質(zhì)樣品是固體，稱取lmg的樣品溶解于lnil 0. 5mol /l ph6.8

31、tris-鹽酸緩沖液或蒸憎水中；若樣品是液體，要測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，按1.0 1.5mg/ml溶液比例，取蛋白質(zhì)樣液與樣品處理液等體積混勻。本實(shí)驗(yàn)所用樣詁為15 20pg的標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品溶液，放置在0. 5ml的離心管中，加入1520pil的樣品處理液。 在100°c水浴中處理2min,冷卻至室溫后備用。吸取未知分子量的蛋口質(zhì)樣品20卩1,按照標(biāo)準(zhǔn)蛋口的處理方法進(jìn)行處理。4. 加樣sds聚丙烯酰胺凝膠垂直板型電泳的加樣方法用手夾住兩塊玻璃板，上提斜插板使其松開，然后取下玻璃膠室去掉密封用硅膠 框，注意在上述過程小手始終給玻璃膠室一個(gè)夾緊力，再將玻璃膠室凹而朝里置入電 泳槽，插入斜板，將緩沖

32、液加至內(nèi)槽玻璃凹面以上，外槽緩沖液加到距平板玻矚上沿 3nun處即可，注意避免在電泳槽內(nèi)出現(xiàn)氣泡。加樣時(shí)可用加樣器斜靠在提手邊緣的凹槽內(nèi)，以準(zhǔn)確定位加樣位置，或用微量 注射器依次在各樣品槽內(nèi)加樣，各加1015卩1（含蛋白質(zhì)1015|ig）,稀溶液可加 2030承（還要根據(jù)膠的厚度靈活掌握）。5. 電泳加樣完畢，蓋好上蓋，連接電泳儀，打開電泳儀開關(guān)后，樣品進(jìn)膠前電流控制 在1520ma,人約1520min；樣品屮的澳酚藍(lán)指示劑到達(dá)分離膠之后，電流升到 3045ma,電泳過程保持電流穩(wěn)定。當(dāng)漠酚藍(lán)指示劑遷移到距前沿12cm處即停止 電泳，約12小時(shí)。如室溫高，打開電泳槽循環(huán)水，降低電泳溫度。6.

33、染色、脫色電泳結(jié)束后，關(guān)掉電源，取出玻璃板，在長短兩塊玻璃板下角空隙內(nèi)，用刀輕 輕撬動(dòng)，即將膠面與一塊玻璃板分開，然后輕輕將膠片托起，指示劑區(qū)帶中心插入 銅絲作為標(biāo)志，放入人培養(yǎng)1111屮染色，使用0.25%的考馬斯亮藍(lán)染液，染色24h, 必要時(shí)可過夜。棄去染色液，用蒸憎水把膠面漂洗幾次，然后加入脫色液，進(jìn)行擴(kuò)散脫色，經(jīng) 常換脫色液，直至蛋口質(zhì)帶清晰為止。7. 結(jié)果處理1）測(cè)量脫色后凝膠板的長度和每個(gè)蛋白質(zhì)樣品移動(dòng)距離（即蛋白質(zhì)帶中心到加樣孔 的距離），測(cè)蜃指示染料遷移的距離。2）按以下公式計(jì)算蛋白質(zhì)樣品的相對(duì)遷移率（rm）相對(duì)遷移率=樣品遷移距離（cm） /染料遷移距離（cm）3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的

34、制作：以各標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對(duì)遷移率為橫坐標(biāo)，蛋片質(zhì)分了量的對(duì)數(shù)為 縱坐標(biāo)在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上做圖，得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。4）測(cè)定蛋白質(zhì)樣品的分了量：根據(jù)待測(cè)蛋白質(zhì)樣品的相對(duì)遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查 得該蛋口質(zhì)的分子量。五、思考題1. 聚內(nèi)烯酰胺盤狀凝膠電泳的兒個(gè)不連續(xù)性是什么？2. 電泳時(shí)的三個(gè)物理效應(yīng)是什么？是怎樣造成的？3. 電泳后上下槽緩沖液可否混合后再使用？為什么？4 上樣緩沖液中加入廿油的作用是什么？5. 貯液配制及貯存應(yīng)注意什么？6. 過硫酸鞍、7%乙酸和考馬斯亮藍(lán)在實(shí)驗(yàn)中有什么作用？實(shí)驗(yàn)三：馬鈴薯多酚氧化酶制備及性質(zhì)實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 學(xué)習(xí)從組織細(xì)胞中制備酶的方法。2. 掌握多酚氧化酶的作用

35、及各種因素對(duì)其作用的影響。二、實(shí)驗(yàn)原理多酚氧化酶是一種含銅的酶，其最適ph值為67。由多酚氧化酶催化的反應(yīng)，如以鄰 苯二酚為底物，可以被氧化形成鄰苯二釀。由多酚氧化酶催化的氧化還原反應(yīng)可通過溶液的 顏色的變化鑒定，這個(gè)反應(yīng)在口然界中是常見的，如玄皮的馬鈴薯和水果變成褐色就是由于 該陸作用的結(jié)果。多酚氧化酶的最適底物是鄰苯二酚（兒茶酚）。間苯二酚和對(duì)苯二酚與鄰苯二酚的結(jié)構(gòu) 相似，它們也可以被氧化為各種有色物質(zhì)。腮是牛物催化劑，其催化活性易受各種因素的影響，如溫度、ph、底物種類、底物濃度、 酶濃度以及抑制劑和蛋白質(zhì)變性劑等都會(huì)改變其生物催化活性。三、實(shí)驗(yàn)器材1. 勻漿機(jī)2. 小刀，紗布，漏斗，其

36、它玻璃器皿3. 離心機(jī)4 冰箱5.恒溫水浴四、材料與試劑1. 馬鈴薯2. 0. lmol/l的naf溶液:將4. 2g氟化鈉溶于loooml水中。3. 0. 01mol/l的鄰苯二酚溶液:將1. lg鄰苯二酚溶解于loooml水中，用稀naoh調(diào)節(jié)溶液的 ph值為6.0,防止其口身的氧化作用。當(dāng)溶液變成褐色時(shí)，應(yīng)重新配制。新配制的溶液應(yīng)貯存于棕色瓶中。4. ph6.8的磷酸鹽緩沖液5. 5%三氯乙酸溶液6. 硫腺7. 0. 01mol/l的間苯二酚溶液:將0. llg間苯二酚溶解于100ml水屮。8. 0. olmol/l的對(duì)苯二酚溶液:將0. llg對(duì)苯二酚溶解于100ml水中。9. 固體硫

37、酸¥安10. 0. 8%hc1： 19. 2ml 濃 hc1 加水稀釋到 looomlo11. 0.2%和0. 3% (v/v)的乳酸溶液。12. 0.5%的碳酸鈉溶液13. 0.01%的碳酸鈉溶液五、操作方法1. 多酚氧化酶的制備每三個(gè)小組一起，稱取150g馬鈴薯(新馬鈴薯口j以不去皮)，切塊后放入勻漿機(jī)，加 入150mlnaf溶液，勻漿后用四層紗布過濾。各組分別量取50ml濾液置離心管中，于3500轉(zhuǎn)/min離心510min,取上清夜，加入 固體硫酸錢16g,溶解，于4°c放置30min,于3500轉(zhuǎn)/min離心15min,倒掉上清液,沉淀 川15ml ph6. 8的磷

38、酸鹽緩沖液溶解，即為粗酶液，含有馬鈴薯多酚氧化酶。2. 多酚氧化酶的催化作用按表1加入各試劑，觀察反應(yīng)現(xiàn)彖并記錄和分析原因。表1多酚氧化酶的催化作用試管號(hào)酶液鄰苯二酚水混勻后37°c保溫5lomin,觀察顏色變化115滴15滴215滴15滴315滴15滴3.多酚氧化酶的化學(xué)性質(zhì)按表2加入各試劑，觀察反應(yīng)現(xiàn)彖并記錄和分析原因。表2多酚氧化酶的化學(xué)性質(zhì)試管號(hào)酶液5%三氯乙酸硫hr振蕩混勻后分別加入鄰苯二酚15滴，于37°c保溫lomin,觀察顏色變化115滴215滴15滴315滴少許4.底物專一性按表3加入各試劑，觀察反應(yīng)現(xiàn)象并記錄和分析原因。表3多酚氧化酶的底物專一性試管號(hào)酶

39、液鄰苯1酚間苯1酚對(duì)苯二酚混勻后37°c保溫510min,觀察顏色變化115滴15滴215滴15滴315滴15滴5.底物濃度的影響按表4加入各試劑，觀察反應(yīng)現(xiàn)象并記錄和分析原因。 表4底物濃度的影響試管號(hào)酶液鄰苯二酚水混勻后37°c保溫lmin,觀察顏色變化15滴1滴39滴25滴10滴30滴35滴40滴6.陸濃度的影響按表5加入各試劑，觀察反應(yīng)現(xiàn)彖并記錄和分析原因。 表5酶濃度的影響試管號(hào)酶液鄰苯二酚水混勻后37°c保溫2min,觀察顏色變化115滴15滴21滴15滴14滴7.氫離子濃度的彩響按表6加入各試劑，觀察反應(yīng)現(xiàn)彖并記錄和分析原因。管號(hào)123450. 8%

40、 hc140滴0. 3%乳酸10浦0. 2%乳酸40滴0.01%碳酸鈉40滴0. 5%碳酸鈉40滴鄰苯二酚7滴7滴7滴7滴7滴酶液7滴7滴7滴7滴7滴混合后ph值1357937 °c保溫 5min,觀察顏 色變化，確定 最適ph值六、思考題1. 在酶制備過程11 加入硫酸錢的日的是什么？2. 在多酚氧化iw性質(zhì)實(shí)驗(yàn)中三氯乙酸和硫脈有什么作用？3. 該多酚氧化酶的授適pll值是多少？為什么？4. 通過實(shí)驗(yàn)可知哪些因素會(huì)影響酶的催化活力？實(shí)驗(yàn)四：堿性蛋白酶活力的測(cè)定(福林一酚試劑法)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)測(cè)定蛋口酶活力的方法。 掌握分光光度計(jì)的原理和使川方法。 學(xué)習(xí)繪制標(biāo)淮曲線的方法。二、實(shí)

41、驗(yàn)原理福林一酚試劑是磷鉗酸鹽與磷鉤酸鹽的混合物。它在堿性條件下不穩(wěn)定，能被酪氨酸 中的酚基還原，生成鉗藍(lán)、餌藍(lán)的混合物。酪蛋白在蛋白酶作用后產(chǎn)生的酪氨酸可與福林 酚試劑反應(yīng)，所生成的藍(lán)色化合物可用比色法測(cè)定。三、實(shí)驗(yàn)器材 分光光度計(jì) 恒溫水浴鍋 冷凝器四、材料與試劑 市售的堿性蛋口酶制劑。 0.4mo/l碳酸鈉：42.4gna2co3用蒸鎘水溶解.定容到looomlo 4mol/l三氯醋酸：65.6g三氯酷酸用蒸鐳水溶解，定容到1000 ml。 2%酪蛋白：2.()g酪蛋片加4()ml蒸鎘水，加35滴濃氨水，于沸水浴上溶解。用phll的硼酸鈉氫氧化鈉緩沖溶液定容到looomlo phll的硼酸

42、鈉氫氧化鈉緩沖溶液：o.lmol/lnaoh與0.05mol/lna2b4o7等體積混合。 福林一酚試劑：5()g鈣酸鈉(na2w042h20), 12.5g的酸鈉(na2mo()42h20),350ml水，25ml 85%磷酸，50ml濃鹽酸放入1000ml圓底燒瓶中，文火回流(保持微沸)10 h,撤下冷凝器，加150g硫酸鏗(so，25ml水，混勻加漠水約5ml脫色。直至金黃色 為止，再微沸15min,驅(qū)除殘漠，冷卻,用45號(hào)耐酸細(xì)菌漏斗過濾,定容到500ml,盛 于洗干凈干燥的棕色瓶中,使用時(shí)以1： 2稀釋。五、操作方法(1) 樣品處理精確稱収粉制腮制劑loghjph 11的硼酸鈉一氫氧

43、化鈉緩沖液溶解并定容到200ml,于40°c浸取30min,濾紙過濾，収2ml濾液用ph11的硼酸鈉氫氧化納緩沖液定容到50mlo(2) 比色測(cè)定取10ml離心管4支分別加入稀釋筋液l.omlo平行試驗(yàn)3支空白試驗(yàn)1支白,于40°c反應(yīng)lomin。溫 lomirio 加2.0nil0.4mol/l三氯酷酸反 加l.oml2%的酪蛋白，反應(yīng)15min應(yīng)15min過濾。過濾。 i 取過濾液l.oml放入盛有5mlna2c03溶液的試管屮。 加l.oml 1： 2稀釋的福林一酚試劑(此試劑應(yīng)最后加入)于40°c水浴發(fā)色20 min。 ©7220型分光光度計(jì)在6

44、80nm比色，比色1111厚1cm。(3) 比色常數(shù)(k)的求法將dl酪奴酸于105°c烘2h,精確稱取o.looog,加少® 0.2mol/l鹽酸加熱溶解，川蒸憎水定容到1000ml(每毫升含dl酪氨酸100.0 pg),取5支試管，按下表加樣。編號(hào)12345酪氨酸/ml00.20.40.60.8h2o/ml1.00.80.60.40.2na2co3/ml55555福林酚/ml11111od680搖勻于40°c發(fā)色20min,以0號(hào)管為空白，在680nm進(jìn)行比色。以吸光度od為縱坐標(biāo)，以dl酪氨酸含量(跑)為橫坐標(biāo)作一直線，可求出比色常數(shù)k 單位吸光度值相當(dāng)dl

45、酪氨酸的臨數(shù)，見示意圖lo圖1 dl 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖計(jì)算活力單位規(guī)定：在phll, 40°c, lmin內(nèi)產(chǎn)生酪氨酸的酶最(g)為一個(gè)活力單位。 _4_總活力(u/g)=kx 10 xodx稀釋倍數(shù)式中 k為比色常數(shù)，dl酪氨酸吃/吸光度；od吸光度；稀釋倍數(shù)200x 50/2；4酶活測(cè)定液的稀釋倍數(shù)；10酶促反應(yīng)時(shí)間，min。六、思考題1.0.4mol/l碳酸鈉、0.4mol/l三氯醋酸溶液的作用是什么?2. 為什么要把反應(yīng)條件控制在ph值為11、溫度為40°c?3. 稀釋的酶溶液是否可以長期使用?為什么？實(shí)驗(yàn)五：植物組織中dna和rna的提取和鑒定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)

46、習(xí)和學(xué)握從植物組織中分離核酸的原理和操作方法。 學(xué)習(xí)和學(xué)握測(cè)定核酸含雖的定糖法（苔黑酚法和二苯胺法）的原理及操作方法。二、實(shí)驗(yàn)原理核酸是生物體內(nèi)的主要化學(xué)成分，核酸在生物體內(nèi)主要以核蛋白的形式存在。核酸分 為脫氧核糖核酸（dna）利核糖核酸（rna）。dna主要存在在細(xì)胞核小，rna主耍 存在于細(xì)胞質(zhì)中。用冰冷的稀三氯乙酸或高氯酸溶液在低溫下抽提菜花勻漿，以除去酸溶性小分子物 質(zhì)。再由冇機(jī)溶劑如乙醇、乙醯等抽提，去除脂溶性的磷脂等物質(zhì)。授后用濃鹽溶液（10% 氯化鈉溶液）和0.5mol/l高氯酸（70°c）分別提取dna和rna。山于核酸和脫氧核糖核酸有特殊的顏色反應(yīng)，經(jīng)顯色后所呈現(xiàn)

47、的顏色深淺在一定范圍 內(nèi)和樣品中所含的核糖和脫氧核糖的量成正比。因此可用定糖法來定性定量測(cè)定核酸。 核糖的測(cè)定：測(cè)定核糖的常用方法是苔黑酚法（3, 5二梵基甲苯，即orcinol反應(yīng)）。當(dāng)含有核糖的rna與濃鹽酸及3, 5二耗基甲苯在沸水水浴屮加熱1020min后，有綠 色物產(chǎn)生，這是因?yàn)閞na脫u票吟后的核糖打酸作用生成糠酶，后者再與3, 5二輕基甲 苯作用生成綠色物質(zhì)。ch3a需rna+濃硫酸+ oh七亠oh尸心3綠色化合物注意：dna、蛋白質(zhì)和黏多糖等物質(zhì)對(duì)測(cè)定有干擾作用。 脫氧核糖的測(cè)定：測(cè)定脫氧核糖的常用方法是二苯胺法。含有脫氧核糖的dna在酸 性條件下和二苯胺在沸水浴中共熱后，產(chǎn)牛

48、.藍(lán)色。這是因?yàn)閐na嚟吟核芹酸上的脫氧核 糖遇酸生成疑棊6 酮基戊醛，再與二苯胺作用產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)。dna+少量濃硫酸或冰乙酸+ cnho kxrc 藍(lán)色物質(zhì)注意：dna、蛋白質(zhì)和黏多糖等物質(zhì)對(duì)測(cè)定有干擾作用。此法易受多種糖類及其衍生物和蛋片質(zhì)的干擾。上述兩種定糖的方法準(zhǔn)確性較差，但快速簡便，能鑒別dna和rna,是鑒定核酸、核 苴酸的常用方法。三、實(shí)驗(yàn)器材 恒溫水浴 電爐 布氏漏斗裝置 移液管 燒杯 量筒 剪刀 研體四、材料和試劑 新鮮菜花 95%乙醇 丙酮 5%高氯酸溶液 0.5mol/l三氯酸溶液 10%氯化鈉溶液 標(biāo)準(zhǔn)rna溶液(5mg/100ml) 標(biāo)準(zhǔn) dna (15mg/100m

49、l) 粗氯化鈉 海沙 二苯胺試劑：將陀二苯胺溶于100ml冰醋酸小，再加入2.75ml濃硫酸(置冰箱小可 保存6個(gè)月。使用后，在室溫下?lián)u勻)。 三氯化鐵濃鹽酸溶液：將2mll0%三氯化鐵溶液(用fecl3 - 6h20配制加入到)400ml 濃鹽酸中。五、操作方法1. 核酸的分離 取菜花的花冠20g,剪碎后置于研缽中。加入20ml95%乙醇和少量誨砂，研磨 成勻漿。然后用布氏漏斗抽濾，棄去濾液。 向?yàn)V渣中加入20ml丙酮，攪拌均勻,抽濾，棄去濾液。 再向?yàn)V渣中加人20ml丙酗，攪拌5min后抽濾(川力壓濾渣，盡量除去丙酗)。 在冰鹽浴屮，將濾渣懸浮在預(yù)冷的20ml5%高氯酸溶液屮攪拌抽濾棄去濾

50、液。 特濾渣懸浮于20ml 95%乙醇中，抽濾，棄去濾液。濾渣中加入2()ml內(nèi)酮，攪拌5mino抽濾至干.用力壓濾渣盡量除去丙酮。 將干燥的濾渣重新懸浮在40ml 10%氯化鈉溶液中，在沸水浴中加熱15mln,放置、 冷卻，抽濾至干，留濾液，并將此操作重復(fù)進(jìn)行一次。將兩次濾液合并，為捉取物一。 將濾渣重新懸浮在20ml ().5mol兒高氯酸溶液中。加熱到70°c。保溫20 min (恒溫水浴)后抽濾。留濾液為提取物二。2. dna和rna的定性鑒定二苯胺反應(yīng)：按表1加入各種試劑，反應(yīng)后觀察現(xiàn)象井記錄結(jié)呆。表1二苯胺反應(yīng)加入試劑管號(hào)12345蒸係水/ml1-dna溶液/ml-1-r

51、na溶液/ml-1-提取物一/ml-1-提取物二/ml-1二苯胺試劑/ml22222放沸水浴中l(wèi)omin后的現(xiàn)象苔黑酚反應(yīng)：按表2加入各種試劑，反應(yīng)后觀察現(xiàn)象井記錄結(jié)果。表2苔黑酚反應(yīng)加入試劑管號(hào)12345蒸錨水/ml1-dna溶液/ml-1-rna溶液/ml-1-提取物一/ml-1-提取物二/ml-1三氯化鐵濃鹽酸溶液/ml22222苔黑酚乙醇溶液/ml0.20.20.20.20.2放沸水浴中1020min后的現(xiàn)象根據(jù)現(xiàn)象分析提取物一和提取物二中主要含有什么物質(zhì)?六、思考題1. 核酸分離時(shí)為什么要除去小分子物質(zhì)和脂類物質(zhì)？本實(shí)驗(yàn)是怎樣除掉的?2. 運(yùn)用本實(shí)驗(yàn)方法是否可以提取到能夠進(jìn)行其他生物

52、實(shí)驗(yàn)用的核酸材料？3. 快速鑒別rna和dna的方法是什么？實(shí)驗(yàn)六：糖酵解中間產(chǎn)物的鑒定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私馓墙徒膺^程的某一屮間步驟及利用抑制劑來研究屮間代謝的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理利用碘乙酸對(duì)糖酵解過程中3磷酸昔油醛脫氫酣的抑制作用，使3磷酸營油醛不再向 前變化而積累。硫酸臍作為穩(wěn)定劑，用來保護(hù)3磷酸廿汕醛是不自發(fā)分解。然示用2, 4二 硝基苯臍與3-磷酸昔油醛在堿性條件下形成2, 4-二硝基苯臍-丙糖的棕色復(fù)合物，其棕色程 度與2-磷酸苜油醛含量成正比。三、儀器原料和試劑(1) 儀器:試管(1.5x 1.5cm)、吸量管(lml、2ml3ml)恒溫水浴、燒杯(50ml)。(2) 原料：新鮮酵母。(

53、3) 試劑： 2, 4二硝基苯臟：0.1g2, 4二俏基苯耕溶于水100ml 2mol/l鹽酸溶液中，貯于棕色瓶 中備用。 0.56mol/l硫酸腓溶液：稱取7.28g硫酸月井溶t 50ml水屮，這時(shí)不會(huì)全部溶解，當(dāng)加入 naoh使ph達(dá)7.4時(shí)則完全溶解。此液也可川于水合腓溶液配制，可按其分子濃度稀釋至 0.56mol/l,此時(shí)溶液呈堿性，可用濃硫酸調(diào)ph至7.4即口j。 5%葡萄糖溶液。 10%三氯乙酸溶液。 ().75mol/lnaoh 溶液。 o.()()2mol/l碘乙酸溶液。四、操作步驟(1)収小燒杯3只，分別加入新鮮酵母0.3g,并按下表分別加入各試劑，混勻。杯5%葡萄糖加入10%二氯醋酸碘乙酸加入量硫酸腓加入量發(fā)酵時(shí)起泡多號(hào)量/ml加入量/ml/ml/ml少11()21121()1131()（2）將各杯混合物分別倒入編號(hào)相同的發(fā)酵罐內(nèi)，放入37°c保溫1.5h,觀察發(fā)酵管產(chǎn)生氣 泡的量有何不同。（3）把發(fā)酵管中發(fā)酵液傾倒入同號(hào)小燒杯屮并在2號(hào)和3號(hào)杯中按下表補(bǔ)加各試劑，搖勻 放lomin后和第一只燒杯中內(nèi)容物一起分別過濾，取濾液進(jìn)行測(cè)定。杯號(hào)10%三氯乙酸/ml碘乙酸/ml硫酸月井/ml223211（4）収3個(gè)試管，分別加入上述濾液o.5m