紫云英根瘤中共生固氮下調(diào)表達(dá)基因的分離與初步分析

1、    紫云英根瘤中共生固氮下調(diào)表達(dá)基因的分離與初步分析    李一星，吳梅，李友國摘要：對前期利用抑制消減雜交技術(shù)（suppressive subtractive hybridization， ssh）構(gòu)建的紫云英（astragalus sinicus）根部組織的共生固氮差異表達(dá)cdna文庫進(jìn)行了全文庫測序和初步分析，并利用半定量rt-pcr方法驗(yàn)證了其中5個基因片段在根瘤中的下調(diào)表達(dá)。結(jié)果表明，從180個克隆中共獲得94個有效序列，文庫插入片段長度為2001 300 bp。blast同源比對分析結(jié)果表明，有90個序列可以找到同源片段，有4個可能為新基

2、因，按功能分為10個類群。關(guān)鍵詞：紫云英（astragalus sinicus）；共生固氮；抑制消減雜交；下調(diào)表達(dá)基因：s541+.3；q786 ：a ：0439-8114（2014）07-1684-06isolation and analysis of down-regulated symbiotic nitrogen fixation genes in astragalus sinicus root nodulesli yi-xing， wu mei， li you-guo（state key laboratory of agricultural microbiology， huazhon

3、g agricultural university， wuhan 430070， china）abstract： in previous work， a cdna library of astragalus sinicus genes related with symbiotic nitrogen fixation was constructed with suppressive subtractive hybridization（ssh）. the library containing down-regulated genes was sequenced and analyzed. amon

4、g the sequenced genes， five fragments were sckeened and its down-regulated expressions were confirmed by semi-quantitative rt-pcr. the results showed that 94 genes were obtained from 180 clones and the average length of inserted fragments was 2001 300 bp. nucleotide blast homological analysis showed

5、 that 90 genes had similarities to known genes and 4 genes were putatively novel genes. all the 94 genes were divided into 10 functional categories.key words：astragalus sinicus； symbiotic nitrogen fixation； suppressive subtractive hybridization； down-regulated gene根瘤菌和豆科植物可以共生固氮，共生固氮是一個二者相互識別、相互作用的復(fù)

6、雜過程。根瘤的形成以及根瘤菌的入侵、分化和發(fā)育離不開植物基因的參與和調(diào)控1。這種調(diào)控涉及多種代謝途徑和信號傳遞過程，有多個基因參與。對共生固氮過程中基因表達(dá)情況進(jìn)行全局性的研究，可以發(fā)現(xiàn)并鑒定出更多與根瘤形成和固氮過程相關(guān)的基因，有助于建立共生固氮的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。如研究者從蒺藜苜蓿中鑒定出756個與根瘤形成和固氮相關(guān)的差異表達(dá)基因，其中313個基因上調(diào)表達(dá)，而443個基因則下調(diào)表達(dá)2。lohar等3也從苜蓿中檢測出在根瘤菌感染的172 h內(nèi)各階段上調(diào)或下調(diào)表達(dá)的基因。抑制消減雜交技術(shù)是一種以mrna差異顯示為基礎(chǔ)的篩選差異表達(dá)基因技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于植物差異表達(dá)基因的研究。fan等4利用抑制消減雜

7、交技術(shù)篩選出火龍果中與干旱脅迫相關(guān)的基因；guo等5采用抑制消減雜交從胡椒中鑒定出73個在低溫脅迫下可能受脫落酸調(diào)控的基因；韓明鵬等6構(gòu)建了紫花苜蓿高溫脅迫條件下的抑制消減雜交文庫，用來篩選高溫誘導(dǎo)表達(dá)的基因。抑制消減雜交技術(shù)同樣是研究共生條件下差異表達(dá)基因的有效手段。clement等7構(gòu)建了干旱條件下大豆根瘤的抑制消減雜交文庫，并從中鑒定出一批與干旱條件下根瘤的固氮功能相關(guān)的新基因。godiard等8通過抑制消減雜交技術(shù)篩選出52個在根瘤菌-苜蓿共生固氮過程中起調(diào)控作用的基因。紫云英（astragalus sinicus）是一種主要分布于中國、日本和韓國等東南亞國家的豆科綠肥。它和華癸中慢生

8、根瘤菌共生，形成不定型根瘤，二者的共生具有嚴(yán)格的宿主專一性，是研究共生固氮的好材料9。前期工作中chou等10構(gòu)建了紫云英根瘤的正向和反向抑制消減雜交文庫，并通過上調(diào)文庫鑒定出16個共生條件下增強(qiáng)或誘導(dǎo)表達(dá)的新基因。相對于上調(diào)表達(dá)基因，下調(diào)表達(dá)基因同等重要，本研究對前期構(gòu)建的下調(diào)文庫進(jìn)行了全文庫測序，并對測序結(jié)果進(jìn)行了同源比對分析，為后續(xù)基因功能的研究提供參考。1 材料和方法1.1 材料華癸中慢生根瘤菌7653r（mesorhizobium huakuii 7653r）為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室固氮室保存。rna抽提所用trizol試劑購自invitrogen公司，taq dna

9、聚合酶、dnase、reverse transcriptase m-mlv均購自takara大連有限公司。 1.2 方法1.2.1 植物培養(yǎng)及結(jié)瘤 將紫云英種子用70%乙醇處理5 min，再用3%naclo處理10 min，然后用無菌水洗滌56次，將消毒后的種子用無菌水浸泡2 h后，平攤于含有0.5%蔗糖和1.2%瓊脂的平皿上，置于光照培養(yǎng)箱中22 培養(yǎng)。待胚根長至1 cm左右時，將種子接種于無菌沙缽中培養(yǎng)，子葉展開后接種華癸中慢生根瘤菌7653r。所有植株均用無氮營養(yǎng)液澆灌。1.2.2 總rna的提取和cdna合成 接種根瘤菌7653r后26 d，收集根瘤、去除根瘤的根和未接種植株的根，用t

10、rizol試劑提取根瘤組織總rna，經(jīng)dnase處理后，用紫外分光光度計測定其純度和濃度，然后用depc水將各樣品rna濃度調(diào)整到一致。取3 l總rna，以oligo dt18為引物，反轉(zhuǎn)錄酶reverse transcriptase m-mlv反轉(zhuǎn)錄得到cdna，以5-atgcagatcttttgtgaagac-3和5-accaccacggaagacggag-3為引物， 進(jìn)行pcr 擴(kuò)增保守基因泛素序列，以驗(yàn)證cdna合成是否有效。1.2.3 半定量rt-pcr 分別以根瘤、去除根瘤的根和未接種植株的根的cdna為模板，用基因特異性引物擴(kuò)增asg6、asc2、asb3、ast6、asd5這5

11、個基因片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，進(jìn)行半定量分析，以232 bp的18s rrna 基因片段為內(nèi)參。所用引物序列見表1。1.2.4 序列分析 目的基因氨基酸序列推測及比對利用bioedit軟件進(jìn)行。同源比對利用blast程序（http：//，http：//）進(jìn)行。氨基酸保守結(jié)構(gòu)域采用interproscan （http：/www.ebi.ac.uk/）和pfam（http：/www.sanger.ac.uk/software/）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析。2 結(jié)果和分析2.1 文庫序列的聚類分析將下調(diào)文庫進(jìn)行全文庫測序，共獲得94個

12、有效序列，插入片段的大小在2001 300 bp。將所有序列利用blast程序進(jìn)行同源序列比對（表2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)有90個序列可以找到同源片段，同時有4個序列在數(shù)據(jù)庫中找不到同源片段，推測這4個序列可能代表新的基因。以上94個有效序列對應(yīng)81個基因，按其編碼蛋白的功能分為10個類群（圖1）：核糖體蛋白9個，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白7個，基因表達(dá)相關(guān)蛋白12個，代謝相關(guān)蛋白20個，膜及轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白11個，細(xì)胞應(yīng)激防御相關(guān)蛋白8個，未知蛋白6個，假定蛋白3個，無同源性蛋白4個和1個其他蛋白。2.2 半定量rt-pcr驗(yàn)證在測序得到的94個基因片段中，分別選取過氧化物酶、熱激蛋白、c3hc4型鋅指蛋白、假定蛋

13、白和質(zhì)體藍(lán)素蛋白5個基因片段asg6、asc2、asb3、ast6、asd5（表2）對其下調(diào)表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。提取接種后26 d的紫云英根瘤、感染根和未接種對照根的總rna，進(jìn)行半定量rt-pcr分析。以232 bp的18s rrna 基因片段為內(nèi)參，檢測5個目標(biāo)基因的半定量結(jié)果。由圖2可知，與未接種的根相比，這5個基因在根瘤中的表達(dá)量大大降低，呈明顯的下調(diào)表達(dá)特征，這說明文庫的結(jié)果是可靠的。3 結(jié)論與討論3.1 基因表達(dá)相關(guān)蛋白el yahyaoui等2在蒺藜苜蓿根瘤中發(fā)現(xiàn)了13個上調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子和11個下調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，基因芯片結(jié)果顯示，其中一些轉(zhuǎn)錄因子可能與結(jié)瘤素基因的表達(dá)相關(guān)，在下調(diào)基

14、因中包括一個與dna結(jié)合的wrky蛋白。lohar等3對苜蓿早期共生階段的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)了許多wrky家族基因的下調(diào)表達(dá)。本研究也發(fā)現(xiàn)一個wrky家族基因asf6的下調(diào)表達(dá)。wrky家族基因在植物抵抗病原菌侵染和其他非生物脅迫的過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，其靶蛋白可能是病程相關(guān)蛋白，因此wrky與防御相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)11。除wrky外，本研究還發(fā)現(xiàn)了1個nac家族基因asi1的下調(diào)表達(dá)。nac家族是植物轉(zhuǎn)錄因子中最大的家族之一，在植物抵抗不同的生物和非生物脅迫中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用12，如nac家族成員參與植物對干旱、低溫、鹽等脅迫的反應(yīng)13，在植物應(yīng)對病原菌的防御反應(yīng)中發(fā)揮作用14。另外

15、，一些nac家族成員在植物發(fā)育的過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，如種子萌發(fā)15、細(xì)胞分裂16、葉的衰老17等。近年來，對苜蓿mtnac969研究發(fā)現(xiàn)，其在根應(yīng)對鹽脅迫的過程中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，而在苜蓿與根瘤菌的共生過程中可以刺激側(cè)根的形成，但不影響根瘤數(shù)量，同時在根瘤中的下調(diào)表達(dá)導(dǎo)致根瘤提前衰老18。因此，本研究中發(fā)現(xiàn)的nac蛋白在共生過程中可能也發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，值得深入研究。3.2 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因目前發(fā)現(xiàn)在根瘤菌和宿主共生的過程中，植物中有很多信號傳導(dǎo)相關(guān)基因是上調(diào)表達(dá)的。同時，el yahyaoui等2發(fā)現(xiàn)在苜蓿中有些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因是下調(diào)表達(dá)的，如鈣調(diào)素-gtp結(jié)合蛋白、鋅指蛋白、蛋白激

16、酶以及與clavata1、lj har 和gmnark同源的受體激酶，可能與結(jié)瘤的自主調(diào)節(jié)有關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn)了許多紫云英根瘤中下調(diào)表達(dá)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因，包括編碼磷酸誘導(dǎo)蛋白1、鈣調(diào)蛋白4、泛素家族蛋白、蛋白磷酸酶、蛋白激酶等的基因。膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白在類菌體與植物細(xì)胞物質(zhì)交換的過程中發(fā)揮重要作用，根瘤的固氮會增加根瘤和根部的氨基酸、己糖、硫酸鹽等的轉(zhuǎn)運(yùn)，同時有一些轉(zhuǎn)運(yùn)基因被下調(diào)表達(dá)，如某些磷酸鹽和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因在苜蓿的根瘤中下調(diào)表達(dá)19。本研究中下調(diào)的相關(guān)基因有11個（膜及轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白對應(yīng)基因），編碼蛋白包括硫氧還蛋白h、細(xì)胞溶質(zhì)因子、蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、g蛋白偶聯(lián)受體、鈉鈣交換體蛋白、液泡儲藏蛋白5

17、5家族蛋白等。 3.3 代謝相關(guān)蛋白在下調(diào)表達(dá)的基因中，初級和次級代謝相關(guān)基因較多，包括udp-葡糖醛酸酯-4-異構(gòu)酶、分支酸合成酶、sam依賴的羧甲基轉(zhuǎn)移酶、長鏈脂肪酸-輔酶a連接酶家族蛋白、s-腺苷-l-甲硫氨酸合成酶、nad依賴型異檸檬酸脫氫酶、質(zhì)體藍(lán)素、12-氧代植二烯酸-10，11-還原酶等22個基因。el yahyaoui等2也研究發(fā)現(xiàn)與根中相比，大量與初級和次級代謝相關(guān)的基因在苜蓿根瘤中被下調(diào)表達(dá)。這可能反映了根瘤與根在代謝水平上的差異，如在根瘤中很多代謝途徑受到了抑制，另一些與固氮相關(guān)的代謝途徑卻被激活。3.4 防御和應(yīng)激相關(guān)基因一般認(rèn)為，根瘤菌與植物共生的過程中需要抑制宿主的

18、防御機(jī)制，從而保證其成功入侵20。事實(shí)上，確實(shí)有很多與病程和防御相關(guān)的基因表達(dá)在共生過程中受到抑制，如在苜蓿中編碼過氧化物酶、多數(shù)非特異性轉(zhuǎn)脂蛋白、脂肪氧化酶、pr10/betv1、kunitz 型胰蛋白酶抑制劑等的基因均被下調(diào)表達(dá)。本研究中發(fā)現(xiàn)1個過氧化物酶編碼基因asg6的下調(diào)表達(dá)，除此之外下調(diào)的基因還包括脂肪酸酰基輔酶a脫氫酶、生存蛋白、過氧化物酶、熱激蛋白hsp70、鐵氧化還蛋白、dnaj伴侶蛋白等。豆科植物通過抑制防御基因的表達(dá)允許根瘤菌的侵入，然而某些防御和抗病相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)又說明豆科植物同時還要限制根瘤菌的侵入，或保護(hù)根瘤不受病原菌和昆蟲的侵害21。3.5 未知基因、假設(shè)蛋白

19、基因和無同源性基因在下調(diào)基因中，未知蛋白編碼基因有6個，假定蛋白基因有3個，無任何同源性的基因有4個，這些基因都有可能是一些尚未被發(fā)現(xiàn)的新基因，特別是無任何同源性的4個基因，有待進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)：1 mergaert p， uchiumi t， alunni b， et al. eukaryotic control on bacterial cell cycle and differentiation in the rhizobium-legume symbiosisj. proceedings of the national academy of sciences of the unit

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41、39.21 gerard p j. dependence of sitona lepidus （coleoptera： curculionidae） larvae on abundance of white clover rhizobium nodulesj. bulletin of entomological research，2001，91（2）：149-152. 9 吳 梅，丑敏霞，李一星，等.參與紫云英共生固氮的一個上調(diào)表達(dá)結(jié)瘤素基因的分離與鑒定j.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，29（2）：169-174.10 chou m x， wei x y， chen d s， et al. th

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