太湖地區(qū)與皖南地區(qū)中華蜜蜂微衛(wèi)星DNA遺傳多樣性分析

1、    太湖地區(qū)與皖南地區(qū)中華蜜蜂微衛(wèi)星dna遺傳多樣性分析    吉挺 沈芳 孟祥金 王帥 李文明摘要：利用篩選后的2對熒光標記微衛(wèi)星引物，研究太湖地區(qū)與皖南山區(qū)中華蜜蜂（以下簡稱中蜂）間的遺傳多樣性并分析其遺傳分化。研究檢測判定了60個中蜂個體的基因型，計算2個群體的優(yōu)勢等位基因頻率（i）、期望雜合度（he）、多態(tài)信息含量（ic）、群體內(nèi)近交系數(shù)（fis），并分析中蜂群體內(nèi)與群體間的遺傳變異，采取配對試驗均數(shù)差異t檢驗比較太湖中蜂與皖南中蜂群體的遺傳差異。結果表明，太湖地區(qū)與皖南山區(qū)2個中蜂群體間的i、he、ic、fis差異均不顯著（i=0356&g

2、t;005，he=039>005，ic=0260>005，fis=0428>005）?？梢?，太湖地區(qū)與皖南地區(qū)兩地中蜂群體存在一定的遺傳多樣性，但遺傳分化程度不大。本研究結果對江蘇與安徽兩地中華蜜蜂品種的選育和保護也具有一定的指導意義。關鍵詞：太湖地區(qū)；皖南地區(qū)；中華蜜蜂；微衛(wèi)星dna標記；遺傳多樣性： s898文獻標志碼： ahk：002-302（204）2-002-05中華蜜蜂（apis cerana cerana）簡稱中蜂，指分布于我國境內(nèi)東方蜜蜂地理亞種的總稱，是我國特有的遺傳資源，家養(yǎng)歷史悠久，2006年被列入國家畜禽保護名錄中。江蘇省自古是我國野生中蜂的聚居區(qū)，也

3、是最早引入新法飼養(yǎng)的地區(qū)之一2。近幾十年來，由于西方蜜蜂大量引入及自然條件的破壞，江蘇省中蜂遺傳資源已消失迨盡，目前僅在環(huán)太湖地區(qū)略有分布，種質(zhì)資源保護迫在眉睫3。同時，隨著近幾年環(huán)太湖地區(qū)設施農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，蜜蜂授粉尤其是中蜂授粉的需求越來越多，現(xiàn)有的中蜂資源已不能滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需求。皖南地區(qū)地形復雜，植被豐富，適宜中蜂棲息，中蜂資源十分豐富4，而且皖南地區(qū)與太湖地區(qū)相隔較近，沒有任何地理隔離，所以從皖南地區(qū)引入蜂群可能是解決太湖地區(qū)中蜂資源缺乏的有效方法。但是引入后是否會改變太湖地區(qū)原有中蜂的遺傳結構，繼而對當?shù)胤N質(zhì)資源保護造成負面影響是應該考慮的首要問題，所以需要對2個地區(qū)現(xiàn)有中蜂資源的

4、遺傳結構與遺傳多樣性進行比較分析。微衛(wèi)星是目前普遍使用的分子遺傳標記，具有多態(tài)性好、共顯性、易于鑒定、檢測重復性好、在基因組分布廣泛等優(yōu)點。聯(lián)合國糧農(nóng)組織（fao）在其持續(xù)發(fā)展和管理動物遺傳資源的戰(zhàn)略計劃中，推薦將微衛(wèi)星標記作為優(yōu)先考慮的分析工具5-6。近幾年來，微衛(wèi)星標記已廣泛應用于我國各地蜜蜂種質(zhì)資源的分析中，但是目前普遍采用聚丙烯酰胺電泳加放射顯影或銀染的方法，不僅費時費力效率低，而且誤差較大7-9。本研究利用篩選后的2對熒光標記微衛(wèi)星引物對太湖地區(qū)與皖南地區(qū)的中蜂進行遺傳多樣性比較和遺傳分化分析，旨在初步評價2個地區(qū)中蜂群體遺傳結構的差異，繼而探討江蘇省太湖地區(qū)異地引入蜂群的可能性。材

5、料與方法試驗材料太湖地區(qū)中蜂（ds）來自于江蘇省蘇州市吳中區(qū)東山鎮(zhèn)，皖南山區(qū)中蜂（x）來自于安徽省宣城市涇縣山區(qū)，每個地區(qū)各隨機選取30群，蜂群盡量以野生種群為主，每群隨機采集成年工蜂0只，用無水乙醇溶液浸泡保存。中蜂群體的采集信息見表。參照吉挺所建立的方法0提取中蜂基因組dna，用微量紫外可見光度計（nanodrop nd-000）測定其含量與純度，-20 保存?zhèn)溆谩?微衛(wèi)星引物的篩選及cr條件的優(yōu)化根據(jù)筆者所在課題組對中華蜜蜂轉(zhuǎn)錄組測序結果所獲得的3 000多個微衛(wèi)星位點進行篩選，每條染色體選擇23對微衛(wèi)星引物，共初步選取54對微衛(wèi)星引物，送往上海生工生物工程有限公司合成。根據(jù)genban

6、k和相應文獻提供的微衛(wèi)星引物對所選54對引物進行優(yōu)化，進一步篩選出 30對擴增效果較好的微衛(wèi)星引物，具體所選微衛(wèi)星引物信息見表2。由于cr反應中影響因素較多，試驗分別設計了以dna模板濃度、mg2濃度、taq酶用量、退火溫度為因素的梯度試驗，最終確定cr的反應體系：0×buffer 20 l，25 mmol/l mgcl2 0 l，0 mmol/l dnts 05 l，0 pmol/l 上游引物 0 l，0 pmol/l 下游引物 0 l，5 u/l taq dna聚配制3%瓊脂糖凝膠，點樣6 l，20 v電泳20 min，檢查產(chǎn)物的有無。如有產(chǎn)物，配制8%聚丙烯酰胺凝膠80 ml體

7、系，00 v預電泳5 min，點樣0 l，20 v電泳3 h。進行硝酸銀染色，直至出現(xiàn)清晰的等位基因條帶。4熒光引物的篩選和組合根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳的結果，盡量選擇不同染色體上的標記，淘汰掉無法擴增以及無多態(tài)性的引物，最終選出相對較理想的2對多態(tài)性較豐富的微衛(wèi)星引物：7-cl278contig（）、5-cl4contig（）、39-cl308contig6（x）、7-cl462contig5（s）、8-cl470contig3（t）、37-cl293contig（w）、29-cl229contig33（k）、28-cl650contig3（b）、33-cl360contig4（l）、-cl2

8、29contig27（m）、4-cl549contig3（r）、-cl33contig4（q）。每對引物的上游 5 端分別用熒光染料fam（藍色）、hex（綠色）、tamra（黃色）進行標記，獲得的熒光標記引物避光保存。按照微衛(wèi)星引物的堿基長度進行組合，為了便于區(qū)分得精確一些，組合的引物長度至少相差 20 bp，獲得的5個熒光標記微衛(wèi)星引物組合信息見表3。cr熒光產(chǎn)物str分型送至上海生工生物工程有限公司進行，使用abi-3730xl dna analyzer全自動測序儀檢測。上樣的總體積為35 l，其中的上樣液hi-di formamide 0 l、gs-500 size standard

9、05 l，另外的3 l為混合cr產(chǎn)物。將hi-di formamide 和gs-500 size standard 混合均勻后與等量的同一個體的cr產(chǎn)物進行混合，然后進行個體編號，依次加樣到96孔板中，接著變性和檢測。檢測結束后，使用genemapper 40軟件自動生成獨立的圖譜文件，讀取片段長度、峰值和峰面積，判斷純合子和雜合子（單峰為純合子，雙峰為雜合子），最后導出excel數(shù)據(jù)表格。 6遺傳多樣性分析公式6等位基因頻率zi=（2niinijnij2nijn）/（2n）。其中：i為第i個等位基因頻率；nii為第i個等位基因純合個數(shù)；jn為與i共顯的第n個等位基因；nij為含i與jn共顯的

10、等位基因個體數(shù)；n為群體中個體數(shù)。62雜合度zhe=-dd（ki=-dd）2i。其中：k為等位基因數(shù)；i為第i個等位基因頻率。63多態(tài)信息含量zic=-dd（ki=dd）2i-dd（k-i=dd）dd（kj=idd）22i2j=2dd（k-i=dd）dd（kj=idd）ij（-ij）。其中：k為等位基因數(shù)；i為第i個等位基因頻率；j為第j個等位基因頻率。64群體內(nèi)近交系數(shù)zfis=（hs-ho）/hs。其中：ho為觀察雜合度；hs為平均期望雜合度。65統(tǒng)計分析利用microsatellite-toolkit軟件根據(jù)genemapper 40軟件導出的excel表格來計算等位基因頻率與期望雜合度

11、，根據(jù)botestein等的公式設計、計算群體的多態(tài)信息含量，再根據(jù)fstat程序計算群體內(nèi)近交系數(shù)。2結果與分析2dna提取結果dna提取出來以后，將其稀釋到00 ng/l，部分瓊脂糖凝膠用紫外透視成像系統(tǒng)檢測，其結果如圖所示：純度比較高，無拖尾現(xiàn)象。fk（w0tttiffk）22熒光產(chǎn)物str分型結果使用abi-3730xl dna analyzer全自動測序儀進行檢測掃板，得到的部分微衛(wèi)星引物的擴增結果與str分型結果見圖2。圖2所示的是太湖地區(qū)中蜂ds0個體在b位點的擴增結果，基因型為32/34（雜合子）；皖南山區(qū)中蜂x03個體在t位點的擴增結果，基因型為32/32（純合子）。23太湖

12、地區(qū)與皖南山區(qū)中蜂優(yōu)勢等位基因的比較由表4可見，利用配對試驗均數(shù)差異雙尾t檢驗對2個群體優(yōu)勢等位基因頻率進行處理，結果i=0356>005，即太湖地區(qū)與皖南地區(qū)中蜂群體在這2對微衛(wèi)星引物標記上檢測出來的優(yōu)勢等位基因差異不顯著。24群體間相關參數(shù)分析由表5可知，太湖地區(qū)中蜂群體的he、ic、fis平均為055、059、0053，均略高于皖南山區(qū)中蜂群體（0473、0423、025）。對2個群體的he、ic、fis進行t檢驗，結果顯示，2個群體的3個參數(shù)差異均不顯著（ht5”he=039、ic=0260、fis=0428）。3結論與討論從2006年開始，陸續(xù)有研究者利用西方蜜蜂微衛(wèi)星標記對我

13、國中蜂遺傳資源及遺傳多樣性進行分析，但普遍方法是在cr擴增后采用聚丙烯酰胺電泳加放射顯影或銀染的方法，通過人為觀察主觀地對多態(tài)性條帶進行分析，這種方法最令人質(zhì)疑的在于很難將相鄰近的2個條帶準確區(qū)分開來，從而造成判型誤差7-8。目前利用熒光引物擴增的微衛(wèi)星位點具有較高的分辨率和靈敏度，對擴增產(chǎn)物在單堿基水平和表達量方面也具有較高的準確性。本試驗利用abi基因測序分析儀對熒光標記dna片段進行檢測，并利用分子量內(nèi)標對dna片段長度進行計算，使2個地區(qū)的中蜂str分型方法較傳統(tǒng)方法更精確，更能真實反映2個群體內(nèi)的遺傳多樣性及群體間的遺傳分化。本研究在筆者所在課題組對中華蜜蜂轉(zhuǎn)錄組測序結果所獲得的 3

14、 000 多個微衛(wèi)星位點基礎上篩選出2個微衛(wèi)星位點，盡量保證其在多條染色體或連鎖群中都有分布，因此得出的數(shù)據(jù)有一定的代表性和可比性。群體中頻率最高的等位基因是該物種中最原始、最保守的等位基因，其余等位基因是進化cm（25過程中由該等位基因突變形成的，因此微衛(wèi)星的多態(tài)性能2k2夠反映物種的進化歷史2。本研究發(fā)現(xiàn)2個群體的優(yōu)勢等位基因頻率間存在差異，但差異不顯著（i=0356>005），表明太湖地區(qū)中蜂群體（ds）與皖南地區(qū)（x）各自維持著一定的種質(zhì)特性，但兩者之間遺傳分化較小。這可能與這2個地區(qū)相隔距離較近、兩者基因流動值較高有關，表明從皖南山區(qū)引入部分中蜂蜂群，擴大太湖地區(qū)中蜂種群數(shù)量，進行蜂蜜生產(chǎn)與授粉，不會對當?shù)刂蟹溥z傳資源產(chǎn)生較大影響。多態(tài)信息含量是衡量基因片段多態(tài)性較好的指標，當ic>05時，該座位為高度多態(tài)性座位；當025< p>期望雜合度別稱基因多樣度，是一個度量群體遺傳變異的最適參數(shù)4。本研究所選用的微衛(wèi)星標記中，、t、r、q、x、w等7個標記有較高的多態(tài)性，群體遺傳多樣性豐富，具有較高的選擇潛力；而b標記在2個群體間表現(xiàn)出完全不同的多態(tài)性，其在皖南山區(qū)中蜂群體中為純合子，而在太湖地區(qū)群體中表現(xiàn)為高度多態(tài)（he=0875），今后可將其作為候選遺傳標記區(qū)別2個地理群體。本研究通